一种基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅及其制备方法和应用

1.本发明涉及致毒活菌株检测技术领域，尤其涉及一种基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅及其制备方法和应用。


背景技术：

2.微生物在自然界中无处不在，它们存在于饮用水、水果和其他食物中。致病菌株的广泛存在可能导致重大流行病和疾病。例如，葡萄球菌病是由金黄色葡萄球菌引起的急性或慢性传染病，临床上具有关节炎、腱鞘炎、足垫肿胀、肚脐炎、葡萄球菌败血症等多种类型。在发达国家或发展中国家，被细菌污染的水和食物是微生物介导感染的主要来源。因此，有必要开发一种灵敏、快速、适合现场检测的致毒活菌株检测方法，以实现实际的应急检测。
3.传统上，致毒活菌株的检测基于致病菌培养。几种微生物和分子生物学技术已被用于检测致毒活菌株。其他基于核酸扩增的超灵敏检测方法，如连接酶链式反应、链置换扩增、聚合酶链式反应(pcr)，以及基于抗体的免疫测定和免疫pcr测定等技术，这些技术通常需要提前从致毒菌株中分离dna，需要核酸扩增设备和复杂的酶反应，价格昂贵、复杂，且费时，不能满足现场快速、简便检测的需求。
4.近年来，利用光学方法来检测病原菌受到了越来越多的关注。长周期光纤光栅是一种纤芯折射率周期性调制的无源光纤器件，由于具有易于制造、介质损耗低、构造紧凑等优点，已广泛的运用于光纤通讯和光纤传感领域。光纤光栅生物传感利用了长周期光纤光栅的折射率敏感特性，当外界环境折射率变化时，其谐振波长将发生明显的漂移，从而到达生物分子的检测。当其和生物识别组件(如抗体、核酸探针)等结合后尤其适用于构建超灵敏的光纤生物传感器，适合于致毒活菌株的检测。
5.目前，检测致毒活菌株的光纤生物传感器大多数通过表面固定抗体蛋白来吸附特定致毒菌株产生信号的偏移，达到定性定量检测致病菌的目的。但是，抗体蛋白价格昂贵且该方法分析时间一般为20～40分钟，对于实际的应急检测来说，检测效率依旧偏低。分子印迹技术是有望合成人工抗体最佳方法之一。其合成的人工抗体表现出类似天然抗体的结合亲和力和选择性。它们甚至可以拥有比天然抗体更好的特性，包括实用性和可操作性，在苛刻的化学和物理条件具有高稳定性，有的甚至具有超强的重复性，而且价格低廉。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅，并将其用于致毒活菌株的检测，以提供一种非诊断目的的准确性高、检测限低、特异性强的致毒活菌株的检测方法。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光
栅的制备方法，包括如下步骤：
9.对长周期光纤光栅依次进行表面硅烷化处理、修饰聚多巴胺涂层、修饰致毒菌株印迹人工抗体、修饰噬菌体，封闭后，得到基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅。
10.优选的，所述长周期光纤光栅以单模光纤为原料，采用飞秒激光直写技术刻录后得到；
11.所述刻录时，飞秒激光脉冲的重复频率为0.8～1.2khz，能量为0.7μj～1.0μj；
12.所述长周期光纤光栅的光栅周期为320μm～400μm，总光栅长度为15mm～20mm，光栅直径为100μm～120μm，损耗峰强度为25db～35db。
13.优选的，所述表面硅烷化处理的方法为：将长周期光纤光栅依次在盐酸甲醇溶液、氢氧化钠溶液和aptes乙腈溶液中浸泡；
14.所述盐酸甲醇溶液，由分析纯盐酸和分析纯甲醇按照体积比0.5～1.5:0.5～1.5混合得到，所述长周期光纤光栅在所述盐酸甲醇溶液中浸泡的时间为1～5h；
15.所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1.2mol/l，所述长周期光纤光栅在所述氢氧化钠溶液中浸泡的时间为5～12h；
16.所述aptes乙腈溶液的体积浓度为1.5～2.5％，所述长周期光纤光栅在所述aptes乙腈溶液中浸泡的时间为12～20h。
17.优选的，所述修饰聚多巴胺涂层的方法为：将盐酸多巴胺溶液涂覆在经表面硅烷化处理后的长周期光纤光栅上反应1～2h；
18.所述盐酸多巴胺溶液按照质量体积比8～12mg：0.8～1.2ml将盐酸多巴胺与tris-hcl混合得到，所述tris-hcl的浓度为8～12mmol/l，ph值为7.5～8.5。
19.优选的，所述修饰致毒菌株印迹人工抗体的方法为：将致毒菌株溶液包裹在经修饰聚多巴胺涂层后的长周期光纤光栅上，在15℃～25℃下孵育20～40min，然后用氨水正硅酸乙酯溶液催化(氨水正硅酸乙酯溶液中的氨水起到催化作用)，形成致毒菌株印迹人工抗体，最后用氨水处理去除致毒菌株；
20.所述致毒菌株溶液的浓度为105cfu/ml～108cfu/ml；
21.所述氨水正硅酸乙酯溶液中氨水溶液和正硅酸乙酯的体积比0.1～0.3:1～3，所述氨水溶液的体积浓度为20～30％，所述氨水正硅酸乙酯溶液处理的时间为20～50min；
22.所述氨水的ph为10～12，所述氨水处理的时间为5～10min。
23.优选的，所述修饰噬菌体的方法为：将修饰了致毒菌株印迹人工抗体的长周期光纤光栅再依次进行表面硅烷化处理和修饰聚多巴胺涂层，然后涂覆噬菌体溶液，在15℃～35℃下孵育20～50min，重复涂覆噬菌体溶液，直到长周期光纤光栅表面修饰的噬菌体数量达到饱和为止；
24.所述噬菌体溶液的浓度为104cfu/ml～107cfu/ml。
25.优选的，所述封闭的方法为：将经修饰噬菌体后的长周期光纤光栅用3～7％质量浓度的bsa溶液在15℃～25℃下孵育5～12h。
26.本发明还提供了一种由上述制备方法得到的基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅。
27.本发明还提供了一种所述的基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周
期光纤光栅用于制备检测致毒菌株的检测试剂中的应用。
28.本发明还提供了一种非诊断目的的检测致毒菌株的方法，包括如下步骤：
29.(1)检测权利要求8所述的基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅的初始共振波长信号λ0；
30.(2)将步骤(1)记录了初始共振波长信号λ0的基于致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅进行样品致毒菌株吸附，并检测样品致毒菌株共振波长信号λi；
31.(3)将样品致毒菌株共振波长信号λi与初始共振波长信号λ0相减，得到共振波长偏移量δλ；
32.(4)根据绘制的以致毒菌株浓度为横坐标、以共振波长偏移量为纵坐标的标准曲线，计算得到样品中致毒活菌株的浓度。
33.本发明提供的致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅通过噬菌体对致毒活菌株的特异性结合，使得与致毒活菌株接触时，表现出更强的吸附力。致使吸附特定致毒活菌株的时间缩短为5～10分钟，适合实际的应急检测。本发明提供的致毒菌株印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅可以监控其表面修饰的噬菌体的量，提高检测特定致毒活菌株的灵敏度，具有灵敏度高、准确性高、特异性强、检测限低、绿色环保的优点。
附图说明
34.图1为实施例1制备基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅的原理图；
35.图2为图1中基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅随温和气单胞菌溶液浓度增大共振波长向左偏移更长的放大图；
36.图3为实施例1基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅的显微镜照片(500倍)；
37.图4为实施例2吸附温和气单胞活菌后的长周期光纤光栅的显微镜照片(500倍)；
38.图5为实施例3同一浓度下基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅检测不同致毒菌株共振波长偏移的比较图。
具体实施方式
39.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
40.实施例1
41.(1)长周期光纤光栅的制备：利用飞秒激光直写技术，在实验室用单模光纤制造高灵敏度的长周期光纤光栅。使用中心波长为800nm的光学参量放大器系统刻录光纤。飞秒激光脉冲，重复频率为1khz，能量为0.8μj，通过使用na(数值孔径)为0.6的40倍物镜聚焦在光纤芯内。一个光栅周期λ为360μm、占空比为50％和总共500个光栅元件的长周期光纤光栅沿光纤纤芯内接，总光栅长度为18mm。在长周期光纤光栅刻录期间，使用超连续光谱源和光谱分析仪实时监测从1100nm到1700nm的透射光谱演变。所制作的长周期光纤光栅直径为
114μm，损耗峰强度为30db。
42.(2)长周期光纤光栅进行表面硅烷化处理：将步骤(1)制备得到的长周期光纤光栅浸泡在盐酸甲醇溶液中2小时，盐酸甲醇溶液是由盐酸溶液和甲醇溶液按照体积比1:1配置得到，其中盐酸溶液为分析纯盐酸，浓度为37％，甲醇溶液为分析纯甲醇，浓度为99％。浸泡后用去离子水清洗，待干燥后将其浸泡在1mol/l的氢氧化钠溶液中10小时，浸泡后用去离子水清洗，待干燥后将其浸泡在体积浓度为2％的aptes乙腈溶液中12小时，浸泡后用去离子水清洗，干燥。
43.(3)长周期光纤光栅表面修饰聚多巴胺涂层：将10mg盐酸多巴胺溶解在1ml的10mmol/l的tris-hcl(ph＝8.0)中，得到盐酸多巴胺溶液，将该溶液涂覆在步骤(2)制备得到的长周期光纤光栅上，反应1小时后，用去离子水清洗，干燥。
44.(4)长周期光纤光栅表面修饰温和气单胞菌(致毒菌株)印迹人工抗体：将浓度为107cfu/ml温和气单胞菌溶液(溶剂为pbs缓冲溶液)涂覆包裹在步骤(3)制备得到的长周期光纤光栅上，在20℃下孵育30分钟，用pbs缓冲溶液清洗，干燥；将0.2ml体积浓度为25％的氨水和2ml正硅酸乙酯搅拌混合后涂覆在修饰后的长周期光纤光栅的表面，经溶液中氨水催化，反应30分钟，使涂覆了温和气单胞菌溶液的长周期光纤光栅表面形成表面硅壳，即形成温和气单胞菌印迹人工抗体，然后用甲醇(分析纯)清洗，再用去离子水清洗，干燥；再将修饰后的长周期光纤光栅表面浸在5mlph为11的nh3·
h2o溶液中10分钟，去除温和气单胞菌，然后分别用5ml pbs缓冲液冲洗感应区域5次，干燥。
45.(5)长周期光纤光栅表面修饰噬菌体：将步骤(4)得到的长周期光纤光栅重复步骤(2)、(3)，即在其表面再进行表面硅烷化处理和修饰聚多巴胺涂层；再将浓度为105cfu/ml的噬菌体溶液(溶剂为pbs缓冲溶液)涂覆在长周期光纤光栅区域上在20℃下孵育30分钟，用pbs缓冲溶液清洗干燥，重复该步骤4次，每次干燥后使用超连续光谱源和光谱分析仪记录透射光谱共振波长偏移位置，判断长周期光纤光栅表面修饰噬菌体达到饱和程度(即共振波长基本不再偏移)，以此监控其表面修饰的噬菌体的量。
46.(6)长周期光纤光栅表面封闭：将5％质量浓度的bsa溶液涂覆在步骤(5)制备得到的长周期光纤光栅上在20℃下孵育6小时，用pbs缓冲溶液清洗，干燥。即制备得到基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅，其制备原理图如图1所示，最终得到的基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅随温和气单胞菌溶液浓度增大发生共振波长向左偏移更长，如图2。
47.在偏光显微镜放大500倍下，观察基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅的表面结构，如图3所示，从图3中可以看出，修饰后的长周期光纤光栅表面有许多粒径约1～2μm的“凹坑”，符合致毒菌株印迹人工抗体粒径大小。
48.实施例2
49.采用实施例1制备的基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅绘制以温和气单胞菌浓度为横坐标、以共振波长偏移量为纵坐标的标准曲线，并检测样品中温和气单胞菌的含量。
50.(1)标准温和气单胞活菌溶液配制：配制温和气单胞活菌溶液浓度为102、103、104、105、106、107cfu/ml，配制溶剂为pbs缓冲溶液。
51.(2)初始信号的记录：将实施例1得到的基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌
体修饰的长周期光纤光栅感应区域浸在pbs缓冲溶液中，记录透射光谱位置，记为初始信号位置(λ0)。
52.(3)目标物吸附：将步骤(2)干燥后的长周期光纤光栅感应区域浸在配制的浓度为102cfu/ml的标准温和气单胞活菌溶液中，10分钟后分别用5ml pbs缓冲液冲洗感应区域5次，再将感应区域浸在pbs缓冲溶液中，记录透射光谱位置，记为目标物信号位置(λi)，将λi与λ0相减，得到共振波长偏移量(δλ)。
53.(4)目标物洗脱：将长周期光纤光栅感应区域浸在5ml ph为11的nh3·
h2o溶液中5分钟，然后分别用5mlpbs缓冲液冲洗感应区域5次。
54.(5)数据处理：按照上述(2)、(3)和(4)的步骤，依次测定标准温和气单胞活菌溶液浓度为103、104、105、106、107cfu/ml的目标物信号位置，得到6组上述步骤(3)中共振波长偏移量的数据，绘制标准曲线，如表1所示：
55.表1温和气单胞活菌的标准曲线
[0056][0057]
(6)真实样品处理和测定：将自来水样品(来自浙江省宁波市江东水厂)1ml置于1.5ml离心管中，10000r/分钟离心5分钟，去除上清液，用1ml pbs缓冲液重悬，重复上述(2)、(3)和(4)步骤得到样品共振波长偏移量的数据，并代入标准曲线方程，计算得到样品中温和气单胞活菌的浓度，三次样品平行结果共振波长偏移量均低于0.10nm远低于温和气单胞活菌溶液浓度为102cfu/ml的共振波长偏移量0.43nm。并对其进行加标回收实验，每个浓度做3个平行样，计算相对标准偏差，结果如表2所示。证明该方法有很好的回收率。
[0058]
表2自来水中温和气单胞活菌的浓度及加标回收实验结果
[0059][0060]
由表2可知，本发明提供的检测方法的回收率均在95％以上，其相对偏差均低于5％，说明该检测方法准确可靠。
[0061]
实验过程中，在将基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅吸附真实样品中的温和气单胞活菌后，将其在偏光显微镜放大500倍下拍照，如图4，发现吸附温和气单胞活菌的长周期光纤光栅表面出现许多“颗粒状”疑似菌的物质，粒径在1～2μm之间，同时图3中的“凹坑”几乎被掩盖，表明致毒菌株温和气单胞活菌在10分钟内已经大量吸附在了长周期光纤光栅上，能够进一步进行检测。
[0062]
实施例3
[0063]
采用实施例1制备的基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光
纤光栅对于其他致毒活菌株的抗干扰能力测试，其他致毒活菌株包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌。每种致毒活菌株的浓度均为107cfu/ml，结果如图5所示。由图5可知，基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅只对温和气单胞活菌能产生明显的共振波长偏移，对其余几种致毒活菌株共振波长几乎不偏移，表明本发明基于温和气单胞菌印迹人工抗体结合噬菌体修饰的长周期光纤光栅具有较强的特异性，其他致毒活菌株不会对该检测体系造成干扰。
[0064]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。