一种特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱的制作方法

一种特异识别微囊藻毒素的双链dna功能化整体柱
技术领域
1.本发明涉及一种特异识别微囊藻毒素的双链dna功能化整体柱。


背景技术：

2.精准灵敏地识别微囊藻毒素（mc-lr）是开展饮用水安全监测的关键之一。微囊藻毒素是一类七肽单环肝毒素，具有强烈的肝肾毒性和免疫系统毒性，可在水及水产品组织中稳定存在。随着水体富营养化加剧，湖泊、水库和河湾受到蓝藻污染日益严重，特别是在太湖、鄱阳等大型湖泊水域受到藻毒素污染而短时暂停部分城市供水事件发生后，水中微囊藻毒素安全问题再次引发社会不安，亟需建立水中痕量mc-lr毒素的高效精准分析技术。
3.mc-lr毒素分子结构中没有荧光基团且紫外吸收较弱，难以直接高灵敏地光谱分析检测。主要分析方法有小鼠分析、细胞毒性检测、蛋白磷酸酶抑制、酶联免疫吸附和质谱分析等。其中小鼠分析、细胞毒性检测主要用于mcs毒性筛查；蛋白磷酸酶抑制法基于mcs对蛋白磷酸酶抑制作用进行mcs总量分析；酶联免疫吸附法通过抗原抗体酶联免疫直接定量检测mcs，特异性强，主要用于定性快速筛查，但是免疫抗体保存和使用条件较为严格。现行各类水质和鱼类组织中mcs的检测分析实验室确证技术主要采用液相色谱-质谱联用技术，方法灵敏度高，但是质谱设备大型、价格昂贵、操作维护技术要求高，在我国科技经济欠发达的地方和一线监测实验室，特别是在现场监测中难以普及，难于快速及时、准确地监测评估mc-lr。发展便捷的痕量mcs高灵敏分析手段很有必要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是在于提出一种特异识别微囊藻毒素的双链dna功能化整体柱及制备方法和应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种特异识别微囊藻毒素的双链dna功能化整体柱，以微囊藻毒素适配体与带有荧光标记的互补寡核酸链杂交生成双链dna修饰有机-无机杂化整体柱，制备特异识别微囊藻毒素的亲和整体柱，与微囊藻毒素mc-lr发生管内特异识别，释放荧光标记的dna互补链，实现mc-lr毛细管柱上激光诱导荧光高灵敏分析。
5.所述的亲和整体柱是由适配体与带有荧光标记的互补寡核酸链杂交生成双链dna修饰有机-无机杂化整体柱所得；所述的有机-无机杂化整体柱是以低聚倍半硅氧烷为聚合单体和含多烯烃基团的丙烯酸酯为交联剂、以惰性溶剂为致孔剂、经光引发剂在紫外光照射下聚合而成；所述的聚倍半硅氧烷为聚八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷，n=8-12，所述的交联剂为季戊四醇三丙烯酸酯，所述的致孔剂为甲醇、n-n-二甲基甲酰胺组成的二元混合溶液，所述的光引发剂为2,2-二羟甲基丙酸。
6.所述的有机-无机杂化整体柱，按聚合单体、交联剂和致孔剂三者质量百分数之和为100 %计，甲基丙烯酸酯异丁基聚倍半硅氧烷占比2.7%~4.5%，季戊四醇三丙烯酸酯占比11.2%~16.0%，甲醇占比64.0%~69.7%，n-n-二甲基甲酰胺占比12.3%~17.2%；所述的光引发剂2,2-二羟甲基丙酸的比例为聚合组成总质量的2.5%。
7.所述的核酸适配体为5'-sh-c
6-ggcgccaaacaggaccaccat gacaattacccataccacctcattatgccccatctccgc-3'；荧光标记的寡核酸链序列为5'-fam-cataat gagg tggtatgggtaattgtcat-3'。
8.所述的一种特异识别微囊藻毒素的双链dna功能化整体柱的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）按比例准确称取甲基丙烯酸酯异丁基聚倍半硅氧烷、季戊四醇三丙烯酸酯、甲醇、n-n-二甲基甲酰胺以及2,2-二羟甲基丙酸，涡旋振荡至完全溶解后，快速振荡并超声，迅速将所得溶液注入到表面烯基化的透明石英毛细管中，两端封口后于紫外光下聚合7 min；随后以甲醇为流动相冲洗整体柱0.5 h，得到表面富含烯基双键的有机-无机杂化聚合整体柱；（2）将mc-lr适配体及荧光探针标记的碱基互补链分别放置于两个锥形离心管中，10000 r/min离心10 min，然后加入ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l磷酸盐缓冲液（pbs）进行溶解稀释，置于90℃水浴中加热10 min，迅速冷却至0℃后形成浓度为100 mmol/l 的核酸适配体和荧光探针标记的碱基互补链储备溶液；将适配体与修饰荧光基团的互补链按照体积比1：1的比例等摩尔浓度混合，并加入40μl ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l pbs缓冲盐，放置于孵育器中55℃孵育2小时，得到抗mc-lr的适配体与碱基互补链结合组成的双链dna；（3）取得到的所需抗mc-lr的双链dna溶液20 ml，注入步骤（2）的基质整体柱中，在ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l pbs缓冲液60℃水浴反应1小时，制得表面键合有mc-lr的适配体与碱基互补链的有机-无机杂化聚合亲和整体柱，于4℃下保存。
9.所述的特异识别微囊藻毒素的双链dna功能化整体柱在检测微囊藻毒素中的应用：按照体积比1:1将20 ml含mc-lr待测物加入ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l pbs缓冲溶液，取20 ml注射进入制备的亲和整体柱，洗脱溶液进入柱后空管窗口，采用激光诱导荧光检测柱上测定mc-lr；所述激光诱导荧光的激发波长为492 nm，发射波长为518 nm。
10.与现有技术比较，本发明将核酸适配体引入mc-lr的特异识别，在核酸适配体链上修饰与之匹配的荧光标记碱基互补链，基于核酸适配体对mc-lr特异性识别结合可以有效地释放所修饰的荧光标记碱基互补链，大幅度增强流动相中荧光信号，联用激光诱导荧光检测系统，建立痕量mc-lr的激光诱导荧光分析技术，实现微痕量mc-lr的免标记荧光分析，避免了繁杂的荧光衍生流程或使用高昂的质谱分析仪器，实现痕量mc-lr的高灵敏监测。项目所采用的核酸适配体对mc-lr具有良好的结合特异性，可以高选择性地结合mc-lr并释放荧光标记的碱基互补链，可以良好地实现mc-lr免标记激光诱导荧光分析，方法和仪器简单，应用性和创新性强，对痕量mc-lr的安全监测具有良好的应用前景。
11.本发明在核酸适配体链上修饰与之匹配的荧光标记碱基互补链，基于核酸适配体对mc-lr特异性识别结合可以有效地释放所修饰的荧光标记碱基互补链，大幅度增强流动相中荧光信号，联用激光诱导荧光检测系统，建立痕量mc-lr的激光诱导荧光分析技术，实现微痕量mc-lr的免标记荧光分析。
12.微囊藻毒素没有荧光信号特征光谱，紫外吸收较弱，难以直接高灵敏地光谱分析检测。本项目在适配体链上修饰与之部分错配的荧光标记dna，基于核酸适配体对mc-lr识
nacl的10 mmol/l pbs缓冲盐，放置于孵育器中55℃孵育2小时，得到抗mc-lr的适配体与碱基互补链结合组成的双链dna；（3）取得到的所需抗mc-lr的双链dna溶液20 ml，注入步骤（2）的基质整体柱中，在ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l pbs缓冲液60℃水浴反应1小时，制得表面键合有mc-lr的适配体与碱基互补链的有机-无机杂化聚合亲和整体柱，于4℃下保存。
21.所述的特异识别微囊藻毒素的适配体亲和整体柱在检测微囊藻毒素中的应用。按照体积比1:1将20 ml含mc-lr待测物加入ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l pbs缓冲溶液，取20 ml注射进入制备的亲和整体柱，洗脱溶液进入柱后空管窗口，采用激光诱导荧光检测，激发波长492 nm，发射波长518 nm，在柱测定mc-lr。
22.实施例1有机-无机杂化整体柱制备：准确称取甲基丙烯酸酯异丁基聚倍半硅氧烷、季戊四醇三丙烯酸酯、甲醇以及n-n-二甲基甲酰胺；按聚合组成（含单体、交联剂和致孔剂三者）质量百分数之和为100 %计，甲基丙烯酸酯异丁基聚倍半硅氧烷占比2.7%~4.5%，季戊四醇三丙烯酸酯占比11.2%~16.0%，甲醇占比64.0%~69.7%，n-n-二甲基甲酰胺占比12.3%~17.2%；光引发剂2,2-二羟甲基丙酸的比例为聚合组成总质量的2.5%；将以上组分混匀，涡旋振荡至完全溶解后，快速振荡并超声，迅速将所得溶液注入到表面烯基化的透明石英毛细管中，两端封口后于光聚7 min；以甲醇为流动相冲洗整体柱0.5 h，得到表面富含烯基双键的有机-无机杂化聚合整体柱。
23.表1有机-无机杂化整体柱的制备实施例2根据渗透性适当的选择原则，实验选用配方5，称取甲基丙烯酸甲酯基笼状倍半多聚硅氧烷（0.009 g）、季戊四醇三丙烯酸酯 (0.027 g)、n-n-二甲基甲酰胺（0.0328 g）和甲醇（0.1312 g），制备含烯基双键的有机-无机杂化聚合整体柱。结果如图1，整体柱渗透性良好、适中，内部结构也比较均匀。
24.将表面修饰有抗mc-lr的核酸适配体及荧光探针标记的碱基互补链分别放置于两个锥形离心管中，10000 r/min离心10 min，然后加入ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l磷酸盐pbs缓冲液进行溶解稀释，放置于90℃水浴锅中加热10 min，迅速冷却至0℃后形成浓度为100 mmol/l 的核酸适配体和荧光探针标记的碱基互补链储备溶液；将适配体与修饰荧光基团的互补链按照体积比1：1的比例等摩尔浓度混合，并加入40μl ph =7.50
含有500 mmol/l nacl、10 mmol/l pbs缓冲盐，放置于孵育器中55℃孵育2小时，得到抗mc-lr的适配体与碱基互补链结合组成的双链dna。
25.选用所制备的整体柱，柱长5cm，分别进行平衡、修饰dna、清洗，其具体步骤为：(1) 平衡：先用ph =7.5的缓冲液平衡30min，其流速0.10 ml/min，压力250psi，所述缓冲液由 10mmol/l pbs, 500mmol/l nacl组成；(2) 负载：取得到的所需抗mc-lr的双链dna溶液20 ml，注入整体柱中，在ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l pbs缓冲盐水浴60℃反应1小时，注入条件为流速0.05 ml/min，压力250psi，制得表面键合有mc-lr的适配体与碱基互补链的聚合亲和整体柱； (3) 清洗:将富集柱装到 液相色谱泵上，用ph =7.5的缓冲液分别清洗，清洗流速0.1 ml/min,压力1000psi。
26.按照体积比1:1将20 ml含mc-lr待测物加入ph =7.50含有500 mmol/l nacl的10 mmol/l pbs缓冲溶液，取20 ml注射进入所制备的亲和整体柱，流速0.05 ml/min,压力250psi，,洗脱溶液进入柱后空管窗口，采用激光诱导荧光检测，激发波长492 nm，发射波长518 nm，在柱测定mc-lr。结果见图2，亲和整体柱中的荧光适配体被目标物微囊藻毒素（mc-lr）有效竞争洗脱下来，检测限达到5 ng/l，荧光响应程度随目标物浓度的增加而成比例增加，本发明亲和整体柱可实现对微囊藻毒素（mc-lr）的传感应用。
27.以上所述仅为本发明的实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。