一种针对体外细胞实验的臭氧气液界面暴露浓度的校准方法

本发明涉及环境化学，具体为一种针对体外细胞实验的臭氧气液界面暴露浓度的校准方法。

背景技术：

1、近年环境臭氧污染日趋严重，对人类健康尤其是呼吸系统造成隐患。流行病学调查发现臭氧污染与哮喘、慢性阻塞性肺炎等呼吸系统疾病的发病率相关。研究臭氧对呼吸系统的毒性效应及毒性机制对于空气质量标准的制定及人类在活动（或运动）中对呼吸系统的防护具有重要的参考价值。利用动物进行活体暴露实验存在周期长、成本高的缺陷，且存在动物实验伦理道德的问题，采用细胞进行体外暴露实验可极大地缩短实验周期，减少实验动物的使用，降低实验成本，有助于快速、准确地评估污染物的毒性效应，为进一步深入研究其毒理机制奠定基础。

2、传统的细胞暴露实验采用浸没式暴露，即污染物加入到培养基中与细胞共培养，研究污染物对细胞的毒理效应。然而在吸入性毒理学研究领域，传统的浸没式培养并不能模拟真实场景中的气液界面暴露过程，对于空气污染物（大气颗粒物、nox、co、so2、o3等）对肺的毒性效应研究，若采用传统的浸没式培养，空气污染物并不能与细胞直接接触，而是溶于培养液，间接对细胞产生影响，这并不能准确地评估污染物对细胞的直接效应。因此研究空气污染物对肺的毒性首先需要建立一个能模拟真实场景的气液界面暴露体系。

3、目前已开发出的气液界面暴露体系主要有两种：

4、一种是目前已实现商业化的气液界面暴露装置（air liquid interface, ali），其原理是将细胞铺于transwell小室的上室，小室下室加培养液，使上室的细胞下部能够与培养液接触，而上部直接暴露在气相中，虽然这种方式能较好地模拟真实的气液界面暴露，然而装置昂贵，且通量小，每次培养的细胞量非常有限，对于一些需要获取大量细胞样品的实验具有局限性。

5、另外一种简易的气液界面暴露方式（以下称为倾斜旋转方式）是在细胞培养箱内放置一缓慢匀速旋转的倾斜（倾斜角~10°）平台（或摇床）， 将培养皿置于该平台（或摇床），控制培养液加入量，使皿内细胞随着倾斜平台的旋转周期性地交替接受培养液覆盖和气体暴露，能一定程度上模拟气液界面暴露，且系统易于搭建、成本低，能够一次实现大量细胞的暴露。目前已有研究人员将其用于体外细胞的臭氧暴露实验。但是该方式也存在一个缺陷：为保证细胞的无菌培养状态，培养皿必须加盖，而培养皿盖的存在会影响臭氧与细胞的接触，削弱臭氧对细胞的效应。因此针对此种气液界面暴露方式，有必要对其真实的效应进行监测及校准。

技术实现思路

1、（一）解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种针对体外细胞实验的臭氧气液界面暴露浓度的校准方法，可纠正因培养皿盖引起的实际效应浓度偏低的问题，校准后的实际效应浓度用于体外细胞毒理实验更加准确，且兼具体系易于搭建，成本低，一次能进行大量细胞的暴露的优点

3、（二）技术方案

4、为实现上述纠正因培养皿盖引起的实际效应浓度偏低的问题，本发明提供如下技术方案：一种针对体外细胞实验的臭氧气液界面暴露浓度的校准方法，包括以下步骤；

5、s1：配制实际效应浓度检测所需的化学试剂；

6、s2：设置空白对照组、特定浓度的臭氧加盖暴露组和特定浓度的臭氧不加盖暴露组，分别检测上述各组经过不同时长（30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h……）暴露的氧化效应，每组每个取样时间节点设置3个重复；

7、s3：通过公式计算和校准臭氧实际效应浓度。

8、优选的，包括以下k2hpo4、kh2po4、edta、dtt、dtnb、na2hpo4、纯水、hcl和koh原料，所述步骤s1中所需的化学试剂为0.1 m ph7.3磷酸钾缓冲液、1 mm dtt溶液和10 mm dtnb溶液。

9、优选的，所述0.1 m ph7.3磷酸钾缓冲液的制备方法为

10、（1）分别称取14.9712 g k2hpo4·3h2o、4.682 g kh2po4、292.24 mg edta，依次加入800 ml纯水中，搅拌至完全溶解；

11、（2）用koh溶液调节ph至7；

12、（3）加纯水定容至1 l。

13、优选的，所述1 mm dtt溶液的制备方法为

14、（1）称取154.251 mg dtt粉末溶于纯水，配成1 ml的1 m dtt(1000x)母液（该母液于-20 ℃避光可保存2年以上）；

15、（2）取100 μl上述母液，用纯水稀释1000倍，即配成100 ml1 mm dtt，4 ℃避光短期保存；

16、（3）50 mm na2hpo4(ph7.0)的配制（以10 ml为例）。

17、优选的，所述10 mm dtnb溶液的制备方法为

18、（1）称取39.635 mg dtnb溶于上述10 ml 50 mm na2hpo4(ph7.0)溶液；

19、（2）用0.22 μm滤膜过滤除菌（不可高温高压），该溶液于4 ℃避光保存2个月。

20、优选的，所述步骤s2的具体步骤为；

21、（1）按每皿1 ml 0.1 m磷酸钾缓冲液(ph7.3) + 100 μl 1 mm dtt的比例配制混合溶液；

22、（2）将s（1）中所述混合溶液按1 ml皿加入3.5 cm细胞培养皿中；（加入混合溶液的体积可根据培养皿大小进行调整，使培养皿置于倾斜平台时液体刚好覆盖皿底面积的一半）；

23、（3）将上述装有混合溶液的空白对照组小皿转移至常规细胞培养箱中孵育，将装有混合溶液的暴露组小皿转移至暴露箱内的倾斜旋转平台上，关闭舱门，开始暴露；

24、（4）分别于30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h……各组取出3皿，加纯水补足至1 ml，立即加入50 μl 10 mm dtnb混匀，2 h内检测溶液在412 nm波长处的吸光值。

25、优选的，所述步骤s3中计算和校准臭氧实际效应浓度的方法为；

26、氧化效应用dtt的消耗量来表示，具体计算公示如下：

27、δdtt=(odt空白-odt)/od0*dtt0(式1)

28、其中；od0；初始（0 min）dtt磷酸钾缓冲液显色后的本底吸光值，

29、odt空白；不同时间节点空白对照组的dtt磷酸钾缓冲液显色后的吸光值，

30、odt；不同时间节点各暴露组dtt磷酸钾缓冲液显色后的吸光值，

31、dtt0；dtt的初始浓度（nmol），

32、检测不同设定浓度的臭氧的实际氧化效应，可通过调整dtt的初始量，保证整个检测过程中dtt足量，

33、臭氧实际效应浓度=(δdtt加盖/δdtt不加盖)*臭氧设定浓度(式2)

34、计算所得的臭氧实际效应浓度即为校准后的实际效应浓度。

35、（三）有益效果

36、与现有技术相比，本发明提供了一种针对体外细胞实验的臭氧气液界面暴露浓度的校准方法，具备以下有益效果：

37、综上所述，该方法采用化学方法对臭氧的实际效应浓度进行了监测和校准，可纠正因培养皿盖引起的实际效应浓度偏低的问题。与现有基于transwell小室的气液界面暴露技术相比，基于倾斜旋转方式的气液界面暴露体系易于搭建，成本低，一次能进行大量细胞的暴露；结合此项校准技术，校准后的实际效应浓度用于体外细胞毒理实验更加准确。