液晶生物传感器组件以及其在胰岛素检测中的运用

1.本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种液晶生物传感器组件以及其在胰岛素检测中的运用。


背景技术：

2.胰岛素是机体内唯一能够降低血糖的激素，其含量的测定是评价糖尿病患者胰岛β细胞功能的常用临床指标，如糖尿病的诊断和治疗，因此胰岛素的研究及检测一直受到人们的广泛关注。
3.已报道的用于检测胰岛素的方法，其中包括基质辅助激光电离飞行时间质谱、酶联免疫分析、电化学免疫传感器、化学发光等。综合分析以上方法，我们发现这些检测方法能够实现生物样品中胰岛素的检测，但它们依然存在一定的缺陷，比如有些方法对胰岛素的检测限只能达到微摩尔或纳摩尔范围，显示出一般的灵敏度，此外，即使一些方法显示出理想的分析性能，但通常需要信号源的预先标记，这不仅需要较长的检测时间，并且还需要更高的试剂或设备成本。这些方法测试周期长、劳动密集、仪器复杂、不适合快速、灵敏、选择性的检测胰岛素。
4.生物传感器通常是由生物识别部分(敏感元件)和换能部分(信号处理元件)两大部分组成的分析设备。当待测物经过固定有敏感元件的载体时，待测物能够与敏感元件发生特异性的相互作用，导致物理或化学响应信号的改变。此时，生物响应信号能够被信号处理元件进行接收，加工，转换为电、光、声等信号，信号输出，实现对待测物的定性或定量研究。
5.液晶生物传感器利用液晶作为信号转化元件，将生物分子间的识别结合事件转化为光学信号输出。由于其操作简单、反应灵敏、样品消耗量少等优势引发科学家们的广泛关注。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了用于胰岛素检测的液晶生物传感器，该方法可快速、高效、灵敏、有选择性、高通量的检测出待测样品中的胰岛素，检测下限为0.1nmol/l。
7.本发明中胰岛素的检测原理如下：在硅烷化修饰的载玻片基底表面紧贴阵列孔，在阵列孔中放置铜网，然后滴加液晶，用毛细管移除多余的液晶形成均匀的液晶薄膜，形成液晶生物传感器。当溴化十六烷基三甲铵溶液加入液晶生物传感器的阵列光学池中，溴化十六烷基三甲铵与液晶分子相互作用，使液晶分子垂直有序排列，偏光显微镜下液晶图像呈现黑暗的光学形貌；当将核酸适配体溶液与上述溴化十六烷基三甲铵溶液的反应液加入液晶生物传感器的阵列光学池中，核酸适配体与溴化十六烷基三甲铵相互作用，维持液晶分子垂直有序排列，偏光显微镜下液晶图像呈现黑暗的光学形貌；当胰岛素、核酸适配体和溴化十六烷基三甲铵的反应液加入液晶生物传感器的阵列光学池中，胰岛素与核酸适配体
特异性结合能够导致适配体的构型发生转变，降低溴化十六烷基三甲铵在界面的浓度从而破坏原先形成的溴化十六烷基三甲铵单层膜，导致液晶分子由垂直排列转变为平行/倾斜排列，偏光显微镜下液晶图像逐渐呈现明亮光学形貌。
8.一方面，本发明提供一种用于胰岛素检测的液晶生物传感器组件，所述液晶生物传感器组件包括：
9.i).液晶生物传感器，所述液晶生物传感器为用二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵(dmoap)处理过的并将向列相液晶，例如4-氰基-4'-戊基联苯(5cb)滴加至铜网而得到的阵列光学池；
[0010]
ii).ph为6.2-7.4的磷酸缓冲液(pbs缓冲液)；
[0011]
iii).针对胰岛素的g-四链体型的核酸适配体；
[0012]
iv).溴化十六烷基三甲铵(ctab)，以及
[0013]
v).胰岛素标准品，
[0014]
所述传感器组件的胰岛素检测下限为0.1nmol/l。
[0015]
在具体实施方式中，液晶生物传感器i)通过如下步骤制备：
[0016]
1)采用洗液清洗玻璃基底，用水、无水乙醇冲洗，干燥后，将其浸泡于二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵水溶液中处理10～30min，用水、无水乙醇冲洗，氮气吹干，制得处理后液晶生物传感基底；
[0017]
2)在步骤1)制得的液晶生物传感基底上紧贴阵列孔，得到光学池，在光学池中放置铜网，在放置铜网的液晶生物传感基底表面滴加液晶5cb，形成液晶膜，制得液晶生物传感器。
[0018]
在具体实施方式中，步骤1)中，在通风橱中将适量新鲜配制的食人鱼溶液倒入载有玻璃基底的石英玻璃器皿，浸泡30～60min；然后分别依次用大量超纯水、无水乙醇冲洗。
[0019]
在具体实施方式中，所述洗液为“食人鱼”溶液，其采用质量浓度98％的浓硫酸和质量浓度30％双氧水按体积比为7:3的比例配制而成。
[0020]
在具体实施方式中，步骤1)中所述玻璃基底为载玻片。
[0021]
在具体实施方式中，步骤1)中所述干燥的步骤为：氮气吹干，在80～110℃条件下干燥过夜。
[0022]
在具体实施方式中，步骤1)中所述二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵水溶液是将二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵溶解于去离子水中配制而成，二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵在溶液中的体积分数为0.5％～1％。
[0023]
在具体实施方式中，所述pbs缓冲液组分如下：137mol/l nacl，2.7mmol/l kcl，4.3mmmol/l na2hpo4，1.4mmol/l kh2po4，hcl调节ph至7.4。
[0024]
另一方面，本发明提供一种上述液晶生物传感器组件用于检测胰岛素的用途。
[0025]
再一方面，本发明提供一种使用上述液晶生物传感器组件检测胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：
[0026]
1.将含有胰岛素的待测样品用pbs缓冲液稀释10～100倍，制得待测工作液溶液，以及用pbs缓冲液配制不同浓度的胰岛素标准品溶液；
[0027]
2.向步骤1制得的待测工作液溶液中加入用pbs缓冲液配制的核酸适配体溶液以及用pbs缓冲液配制的溴化十六烷基三甲铵溶液，恒温孵育，制备得到待测反应液，以及向
步骤1制得的胰岛素标准品溶液中加入用pbs缓冲液配制的核酸适配体溶液以及用pbs缓冲液配制的溴化十六烷基三甲铵溶液，恒温孵育，制备得到各个标准品反应液；
[0028]
3.将步骤2的各个标准品反应液加入液晶生物传感器的光学池中，并使用偏光显微镜观察相应的液晶光学图像，将其转化为灰度值，将灰度值与标准品的浓度进行线性拟合，得到浓度和灰度值之间的关系并绘制线性曲线；
[0029]
4.将步骤2制得的待测反应液加入液晶生物传感器的光学池中，并使用偏光显微镜观察液晶光学图像，并将其转化为样品灰度值；
[0030]
5.将步骤4中得到的样品灰度值代入步骤3的线性曲线，即得到待测样品中的胰岛素浓度。
[0031]
在具体实施方式中，在步骤1中，所述待测样品为受试者的尿液或血液。当待测样品为血液时，还对其进行前处理步骤，所述前处理包括将血液用孔径为0.22μm的过滤膜过滤，然后用pbs溶液稀释至10％备用。
[0032]
在具体实施方式中，在步骤1中，胰岛素标准品溶液的浓度在0.1nmol/l～1.0nmol/l范围内。
[0033]
在具体实施方式中，在步骤2中，核酸适配体溶液：待测工作液溶液：溴化十六烷基三甲铵溶液的体积比为1:1.25:1.125。
[0034]
在具体实施方式中，在步骤2中，核酸适配体溶液通过如下方式配制：将核酸适配体的冻干粉末溶解于pbs缓冲液中，涡旋混匀制得所述核酸适配体溶液。核酸适配体的检测终浓度上限为100nmol/l，对于其检测终浓度下限没有限定，优选地，在能够确保保持偏光显微镜下的液晶图片为暗场的情况下，添加尽可能多的适配体来捕获目标物。
[0035]
在具体实施方式中，步骤2中的反应条件为在35～38℃下孵育30～60min。
[0036]
在具体实施方式中，在步骤2中，溴化十六烷基三甲铵溶液通过如下方式配制：将溴化十六烷基三甲铵加入pbs缓冲液超声波溶解制得所述溴化十六烷基三甲铵溶液，溶解时间为30～40min；优选地，所述溴化十六烷基三甲铵的检测终浓度≥0.015mm，优选地，≥0.02mm。关于ctab检测终浓度的优化，需要说明的是，在本技术中共设置了0、0.001、0.005、0.01、0.015和0.02mm 6个浓度梯度，其中，当ctab浓度≤0.005mm时，结果显示偏光显微镜下均为亮场，剩余3个浓度在60min内可以随着时间的延长能够变暗，其中0.01mm的变化时间是30min，0.015mm的变化时间是20min，0.02的变化时间最快，因为本技术中为了得到快速响应的传感器，优选地，选择0.02mm的浓度。
[0037]
有益效果
[0038]
本发明通过基于适配体构象变化原理结合液晶双折射性能，从而通过偏光显微镜观察样品在液晶生物传感平台上的不同液晶光学形貌，实现检测样品中胰岛素的目的。
[0039]
本发明利用液晶生物传感器检测胰岛素的方法具有高通量，检测仪器易得，检测方法简单、快速、灵敏，试剂消耗少，样品处理时间短等优点，解决了现有检测方法复杂、成本高的问题。
附图说明
[0040]
图1为利用液晶生物传感器检测胰岛素的机理图。a：不存在胰岛素；b：存在胰岛素。
[0041]
图2为液晶生物传感器阵列光学池的示意图。
[0042]
图3为两组分体系中，分子间相互作用的分子动力学模拟。体系a为5cb和ctab；体系b为核酸适配体和ctab；体系c为胰岛素和核酸适配体。
[0043]
图4为多组分体系中，生物分子对5cb和ctab相互作用影响的分子动力学模拟。体系a为5cb和ctab；体系ⅰ为5cb、ctab和核酸适配体；体系ⅱ为5cb、ctab、核酸适配体和胰岛素。
[0044]
图5为不同浓度的溴化十六烷基三甲铵溶液修饰液晶生物传感器的偏光显微镜照片。溴化十六烷基三甲铵溶液的浓度为：a：0mm；b：0.001mm；c：0.005mm；d：0.01mm；e：0.015mm；f：0.02mm。
[0045]
图6为不同浓度的核酸适配体溶液和0.02mm溴化十六烷基三甲铵溶液反应液的液晶生物传感器上的偏光显微镜照片。核酸适配体溶液的浓度为：a：300nmol/l；b：250nmol/l；c：200nmol/l；d：150nmol/l；e：100nmol/l。
[0046]
图7示出：a：不同浓度胰岛素标准溶液、0.02mm溴化十六烷基三甲铵溶液和100nmol/l核酸适配体溶液的反应液加入液晶生物传感器上的偏光显微镜照片，其中胰岛素标准溶液的浓度为：a：0nmol/l；b：0.1nmol/l；c：0.2nmol/l；d：0.5nmol/l；e：0.8nmol/l；f：1.0nmol/l；b：偏光显微镜下液晶图片的灰度值vs.胰岛素浓度的线性曲线。
[0047]
图8为尿液样品基于液晶生物传感器检测胰岛素的偏光显微镜照片。a：1％尿液；b：胰岛素浓度为0.5nmol/l的1％尿液。
具体实施方式
[0048]
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明保护范围不限于此。
[0049]
实施例中的4-氰基-4'-戊基联苯(5cb)，购自东京仁成工业株式会社。
[0050]
若无其他特殊说明，本实施例中涉及的药品及试剂均为普通市售产品。
[0051]
下文中使用的核酸适配体序列：5'-ggtggtggggggggttggtagggtgtcttc-3'(seq id no.:1)
[0052]
实施例中pbs缓冲液组分如下：137mol/l nacl，2.7mmol/l kcl，4.3mmmol/l na2hpo4,1.4mmol/l kh2po4，hcl调节ph至7.4。
[0053]
本发明的检测原理如图1所示：当不存在胰岛素时，界面处的溴化十六烷基三甲铵单层膜依然维持液晶分子的垂直排列，偏光显微镜下液晶图像呈现明亮的光学形貌(图1a)；当加入胰岛素时，其与适配体特异性结合导致适配体的构型发生由g-四链体到伸展结构的转变，降低溴化十六烷基三甲铵在界面的浓度从而破坏原先形成的溴化十六烷基三甲铵单层膜，导致液晶分子由垂直排列转变为平行/倾斜排列，偏光显微镜下液晶图像呈现明亮的光学形貌(图1b)。基于以上原理，完成本发明。
[0054]
实施例1：液晶生物传感器的制备
[0055]
液晶生物传感器的制备方法如下：
[0056]
i、以载玻片为液晶生物传感器基底，将载玻片浸泡于“食人鱼”清洗液(采用质量浓度98％的浓硫酸和质量浓度30％双氧水按体积比为7:3的比例配制而成)中，浸泡60min，反应结束后，依次用大量去离子水和无水乙醇冲洗多次，氮气吹干，110℃烘箱中干燥2h。将
干燥后的载玻片浸入1％(v/v)的二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵(dmoap)水溶液中，室温反应30min；然后用去离子水和无水乙醇冲洗多次，氮气吹干，110℃烘箱干燥2h，制得液晶生物传感基底；
[0057]
ii、在步骤i制得的液晶生物传感基底上紧贴由硅胶橡胶电钻的孔洞阵列孔槽，夹紧即得到光学池，在每个光学池中各放置一个铜网，在放置铜网的液晶生物传感基底表面滴加液晶5cb，制得液晶生物传感器，如图2所示。在该步骤中，液晶的滴加量没有具体限定，只要使得标制备后的液晶生物传感器在偏光显微镜下是均匀的暗场即可。
[0058]
实施例2：分子动力学模拟
[0059]
分子动力学模拟所有均采用gromacs 4.5.3软件包。ctab和5cb采用gaff(general amber force field)力场，胰岛素核酸适配体和胰岛素使用amber ff99sb力场。在每个系统中使用具有周期性边界条件的简单点电荷水模型进行溶剂化，加入钠或氯抗衡离子以中和所有系统。采用最速下降算法，在容差值为10kj/mol/nm处使能量最小，接下来，在nvt和npt系综下进行分子动力学模拟。结果如图3所示，两物质的结合是均是自发进行。从图4可以看出生物分子在ctab修饰的液晶界面处的结合略微降低了5cb和ctab的相互作用(图4a)；利用均方根偏差(rmsd)考察了负载ctab的液晶薄膜的结构完整性，结果如图4b所示，表明生物分子的结合能够降低在液晶界面处ctab自组装膜的稳定性。
[0060]
实施例3：溴化十六烷基三甲铵浓度的确定
[0061]
溴化十六烷基三甲铵溶液是将溴化十六烷基三甲铵加入上述pbs缓冲液，超声波溶解时间为30min，配制成浓度分别为0mm、0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.015mm、0.02mm的溴化十六烷基三甲铵溶液，将上述不同浓度的溴化十六烷基三甲铵溶液分别加入实施例1制备的液晶生物传感器的光学池，加入体积为100μl，使用偏光显微镜进行观察，结果如图5所示，当溴化十六烷基三甲铵溶液的浓度＜0.02mm时，液晶呈现明亮的形貌；当溴化十六烷基三甲铵溶液的浓度≥0.02mm时，液晶呈现黑暗的形貌。
[0062]
实施例4：核酸适配体浓度的确定
[0063]
核酸适配体冻干粉末溶解于pbs缓冲液中，涡旋混匀，配制成浓度分别为300nmol/l、250nmol/l、200nmol/l、150nmol/l、100nmol/l的核酸适配体溶液，将上述不同浓度的核酸适配体溶液分别与上述0.02mm的溴化十六烷基三甲铵溶液涡旋混匀，37℃条件下孵育反应30min后加入液晶生物传感器的阵列光学池，滴加体积为100μl，使用偏光显微镜进行观察，结果如图6所示，当核酸适配体溶液的浓度≥250nmol/l时，液晶为全部明亮的形貌；当溶液的核酸适配体浓度从300nmol/l逐渐降低到100nmol/l时，液晶的形貌由全部明亮逐渐转化为全部黑暗，明亮的区域范围逐渐减少。
[0064]
实施例5：基于液晶生物传感器分析检测胰岛素标准品
[0065]
将标准品胰岛素(购自北京索莱宝科技有限公司)涡旋溶解于pbs缓冲液中，配制成浓度为0nmol/l、0.1nmol/l、0.2nmol/l、0.5nmol/l、0.8nmol/l、1.0nmol/l的胰岛素标准溶液；上述不同浓度的胰岛素标准溶液中添加核酸适配体溶液，混合均匀，核酸适配体和胰岛素标准溶液的体积比为1:1.25，核酸适配体在混合溶液中的终浓度为100nmol/l，37℃反应60min，得反应液
①
，将上述反应液
①
与溴化十六烷基三甲铵溶液，混合均匀，溴化十六烷基三甲铵溶液和反应液
①
的体积比为1:2，溴化十六烷基三甲铵在混合溶液中的终浓度为0.02mm 37℃反应30min，得反应液
②
。将反应液
②
加入液晶生物传感器的阵列光学池，滴加
体积为100μl，使用偏光显微镜进行观察，结果如图7a所示，当胰岛素标准溶液的浓度≥1.0nmol/l时，液晶呈现出明亮的形貌；当胰岛素标准溶液的浓度≤0.1nmol/l时，液晶呈现出黑暗的形貌；当胰岛素标准溶液的浓度由1.0nmol/l到0.1nmol/l逐渐降低时，液晶的形貌由全部光亮逐渐黑暗。用matlab(version 9.6.0，r2019a)软件对采集的光学图像进行像素分析，得到液晶图像的平均灰度值并用originpro9.1软件作图。胰岛素在0.1至1.0nm的浓度范围，其液晶图片的灰度值与胰岛素浓度具有良好的线性关系，相关系数为：0.987(图7b)。液晶生物传感器能够检测胰岛素的检测限为0.1nm。
[0066]
实施例6：尿液样品中胰岛素的检测
[0067]
一种基于液晶生物传感器的胰岛素的分析检测方法，步骤如下：
[0068]
(1)取健康人体尿液采用如上配制的pbs缓冲液稀释100倍，得体积分数为1％的尿液，将胰岛素标准品溶液与1％尿液涡旋混匀，使1％尿液中的胰岛素的浓度为0.5nmol/l，模拟糖尿病患者尿液，制得待测溶液；
[0069]
(2)向步骤(1)制得的待测溶液中加入核酸适配体溶液，核酸适配体溶液和待测溶液的体积比为1:1.25，核酸适配体在混合溶液中的浓度为100nmol/l，37℃反应60min，得反应液
①
；
[0070]
(3)将上述反应液
①
与溴化十六烷基三甲铵溶液，混合均匀，溴化十六烷基三甲铵溶液和反应液
①
的体积比为1:2，溴化十六烷基三甲铵在混合溶液中的浓度为0.02mm，37℃反应30min，得反应液
②
。将反应液
②
加入实施例1中制备的液晶生物传感器的阵列光学池，滴加体积为100μl，使用偏光显微镜进行观察。
[0071]
观察结果如图8所示，未加入胰岛素标准品溶液的1％尿液样品的液晶光学形貌为全部黑暗(图8a)，说明尿液样品不会对胰岛素的检测造成干扰；含胰岛素尿液样品的形貌为少许亮斑(图8b)，说明其胰岛素的浓度在0.1nmol/l～1.0nmol/l之间，与尿液样品中胰岛素的浓度为0.5nmol/l相符。
[0072]
此结果表明，本技术的液晶生物传感器组件能够有效地检测液体样品中的胰岛素，利用本发明的方法能够快速、灵敏、简便、阵列化地对微量胰岛素进行有效检测。
[0073]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。