一种羧基微球偶联蛋白效率的检测方法与流程

本发明属于生物检测，具体涉及一种羧基微球偶联蛋白效率的检测方法。

背景技术：

1、化学发光免疫分析是高灵敏度的化学发光检测和高特异性的免疫反应相结合的检测技术。其通过抗原抗体的特异性结合检测免疫活性组分的存在和浓度，是目前体外诊断领域最重要的检测技术和流行趋势之一。如何提高检测的灵敏度和特异性是免疫检测技术的重要目标，利用磁珠微粒实现化学发光免疫分析的非均相分离有助于实现这个目标。一般对磁性微球的表面进行功能基团修饰，通过修饰的功能基团和抗体结合。包被在磁性微球上的抗体和需要检测的抗原特异性结合后经过洗涤和结合标记了发光物质的抗体，形成双抗体复合物，再次洗涤后加入发光催化剂，通过检测光子数完成抗原浓度的检测。

2、羧基是磁珠微球常用的修饰基团，以羧基为交联基团的磁微粒与edc反应活化后形成中间体，中间体和抗体的氨基反应，将抗体连接在磁珠的表面。磁珠偶联抗体的效率直接影响了法学发光免疫分析的灵敏度和特异性，因此如果能够简便准确的检测出磁珠抗体偶联的效率，则对提高偶联效率具有十分重要的作用。而且简便准确的磁珠偶联抗体效率检测方法也有利于磁珠包被抗体试剂的生产质量控制，从而减少检测试剂批间的差异性。因此建立简便准确的羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，对化学发光免疫分析具有十分重要的意义。

3、专利cn113390837a公开了一种磁珠蛋白偶联效率的检测方法，具体是：将活化后的磁珠与蛋白进行偶联反应，得到偶联蛋白的磁珠，然后对所述偶联蛋白的磁珠表面未反应的结合位点进行荧光标记，得到待测样品；对活化后的磁珠表面的全部结合位点进行荧光标记，得到阳性对照品；以磁珠、活化后的磁珠或者偶联蛋白的磁珠作为空白对照品；测定待测样品、阳性对照品、空白对照品的荧光值，计算磁珠的蛋白偶联效率。该专利检测方法的缺陷是：磁珠偶联的蛋白表面也存在大量的羧基，氨基活性基团的荧光染料无法实现定向偶联磁珠表面未反应的结合位点，会和偶联的蛋白结合，而且荧光物质会发生荧光猝灭现象，导致检测结果不准确。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种羧基微球偶联蛋白效率的检测方法。主要解决现有技术中磁珠蛋白偶联效率检测方法不准确的问题。

2、本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

3、一种羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，该检测方法为：向羧基样本中加入甲苯胺蓝溶液，混匀后离心，检测上清液在600～626nm波长的吸光度值，根据羧基浓度和1/吸光度值之间拟合的方程式计算各样本的羧基浓度，按下式计算羧基微球的蛋白偶联效率，

4、。

5、作为优选实施方案，所述羧基浓度和1/吸光度值之间拟合的方程式为：y＝-0.0003x3+0.0332x2-0.2993x+0.7326。

6、作为优选实施方案，所述羧基浓度和1/吸光度值之间拟合方程式的测定方法是：向具有相同量甲苯胺蓝溶液的不同组别中分别加入不同浓度梯度的赖氨酸溶液，混匀离心后，测定600～626nm波长的吸光度值，利用graphpad prism软件将羧基浓度和1/吸光度进行立方样条拟合，得到拟合方程式；所述甲苯胺蓝溶液的量需满足：与赖氨酸溶液中的羧基反应后仍有剩余的甲苯胺蓝。

7、作为优选实施方案，所述甲苯胺蓝溶液采用0.05-0.2m、ph4.5-5.5的mes缓冲液配制，甲苯胺蓝的浓度为0.1-1.0mmol/l，赖氨酸溶液的浓度梯度为0.0001-100mmol/l。

8、作为优选实施方案，所述甲苯胺蓝溶液采用0.1m、ph5.0的mes缓冲液配制，甲苯胺蓝浓度为0.5mmol/l，向9ml tbo溶液中加入0.1ml不同浓度的赖氨酸溶液。

9、作为优选实施方案，所述羧基微球为氧化硅羧基磁性微球、聚苯乙烯羧基磁性微球或聚乙二醇羧基微球。

10、作为优选实施方案，所述羧基微球偶联蛋白效率的检测方法包括如下步骤，

11、步骤1，向甲苯胺蓝溶液中加入不同浓度梯度的赖氨酸溶液，混匀离心后，测定600～626nm波长的吸光度值，利用graphpad prism软件将羧基浓度和1/吸光度进行立方样条拟合，得到拟合方程式：y＝-0.0003x3+0.0332x2-0.2993x+0.7326；

12、步骤2，分别向样本羧基微球溶液、偶联蛋白溶液、羧基微球偶联蛋白溶液中加入甲苯胺蓝溶液，混匀后离心，检测各样本上清液在600～626nm波长的吸光度值；

13、步骤3，根据拟合方程式，通过羧基微球溶液、偶联蛋白溶液、羧基微球偶联蛋白溶液的吸光度值计算获得偶联前羧基微球羧基总量、偶联前蛋白羧基总量、偶联后羧基微球偶联蛋白羧基总量；通过下述公式计算获得羧基微球的蛋白偶联效率，

14、

15、本发明中涉及的英文缩写注释如下：

16、mes：2-(n-吗啉代)乙磺酸

17、edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

18、nse：神经元特异性烯醇化酶

19、tbo：甲苯胺蓝

20、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

21、1，本发明提出了一种简便有效的羧基磁珠偶联蛋白效率的检测方法，通过阳离子染料甲苯胺蓝与磁珠微球或蛋白表面的羧酸根离子结合，用紫外检测偶联前后蛋白和羧基微球的羧基总量，从而准确检测羧基微球蛋白的偶联效率。

22、2，本发明提出的方法操作简单，无需复杂的操作步骤，通过紫外分光光度计便可准确测量检测羧基磁珠偶联蛋白的效率。

技术特征：

1.一种羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，其特征在于，该检测方法为：向羧基样本中加入甲苯胺蓝溶液，混匀后离心，检测上清液在600～626nm波长的吸光度值，根据羧基浓度和1/吸光度值之间拟合的方程式计算各样本的羧基浓度，按下式计算羧基微球的蛋白偶联效率，

2.根据权利要求1所述的羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，其特征在于，所述羧基浓度和1/吸光度值之间拟合的方程式为：y＝-0.0003x3+0.0332x2-0.2993x+0.7326。

3.根据权利要求2所述的羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，其特征在于，所述羧基浓度和1/吸光度值之间拟合方程式的测定方法是：向具有相同量甲苯胺蓝溶液的不同组别中分别加入不同浓度梯度的赖氨酸溶液，混匀离心后，测定600～626nm波长的吸光度值，利用graphpad prism软件将羧基浓度和1/吸光度进行立方样条拟合，得到拟合方程式；所述甲苯胺蓝溶液的量需满足：与赖氨酸溶液中的羧基反应后仍有剩余的甲苯胺蓝。

4.根据权利要求3所述的羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，其特征在于：所述甲苯胺蓝溶液采用0.05-0.2m、ph4.5-5.5的mes缓冲液配制，甲苯胺蓝的浓度为0.1-1.0mmol/l，赖氨酸溶液的浓度梯度为0.0001-100mmol/l。

5.根据权利要求4所述的羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，其特征在于：所述甲苯胺蓝溶液采用0.1m、ph5.0的mes缓冲液配制，甲苯胺蓝浓度为0.5mmol/l，向9mltbo溶液中加入0.1ml不同浓度的赖氨酸溶液。

6.根据权利要求1所述的羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，其特征在于：所述羧基微球为氧化硅羧基磁性微球、聚苯乙烯羧基磁性微球或聚乙二醇羧基微球。

7.根据权利要求1所述的羧基微球偶联蛋白效率的检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，

技术总结
本发明公开了一种羧基微球偶联蛋白效率的检测方法。所述检测方法为：向羧基样本中加入甲苯胺蓝溶液，混匀后离心，检测上清液在600～626nm波长的吸光度值，根据羧基浓度和1/吸光度之间拟合的方程式，计算获得偶联前羧基微球羧基总量、偶联前蛋白羧基总量、偶联后羧基微球偶联蛋白羧基总量；通过相关公式计算获得羧基微球的蛋白偶联效率。本发明提出了一种简便有效的羧基磁珠偶联蛋白效率的检测方法，通过阳离子染料甲苯胺蓝与磁珠微球或蛋白表面的羧酸根离子结合，用紫外检测偶联前后蛋白和羧基微球的羧基总量，从而准确检测羧基微球蛋白的偶联效率。

技术研发人员：王秀东,杜晔,张亚楠
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15