基于RGO-CMCS-Hemin/Pt@PdNPs比色传感器检测GP73的方法

基于rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps比色传感器检测gp73的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米材料结合适配体检测gp73的方法。


背景技术：

2.目前高尔基体糖蛋白73（gp73）常用的检测方法主要是酶联免疫吸附测定（elisa），利用抗原和抗体结合，通过滴加底物溶液发生显色反应，从而采用酶标仪进行定量测定。但此方法所用试剂盒造格昂贵，且所用抗体不易保存。公开号为cn 111378627 a的发明专利，涉及高尔基体蛋白73单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒及其在检测高尔基体蛋白73中的应用，但该方法耗时过长，且对抗体保存要求较高。公开号为cn 109254152 a的发明专利，公开了一种gp73抗体修饰纳米金，采用基于纳米金探针的酶联免疫吸附试验高灵敏检测gp73的方法，但该方法对操作环境和技术要求较高。因此，需要建立一种快速、灵敏、简单检测gp73的方法。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-氯化血红素/纳米铂@钯纳米材料（rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps），构建夹心型比色传感器，实现gp73的可视化检测。
4.为解决该技术问题，首先通过分步还原法制备rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps纳米酶；其次利用π-π的共轭作用、静电吸附作用以及-nh3与-cooh结合将氨基化的gp73适配体（apt）结合到rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps表面作为识别探针；以未修饰gp73适配体（apt ι）为捕获探针；当有靶向gp73存在时，捕获探针和识别探针同时与gp73特异性结合，形成夹心型比色传感器。最后利用rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps的类过氧化物酶性质，催化h2o2分解为h2o和o2，进而将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）氧化为氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（oxtmb），使溶液由无色变为深蓝色，利用紫外-分光光度计测量652 nm处的紫外吸收峰；对比吸光度的差异，从而实现对gp73的检测，最低检测限为5.0 ng/ml。
5.本发明按照以下步骤进行：步骤1：rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps-gp73apt识别探针的制备（1）还原性氧化石墨烯（rgo）的制备称取氧化石墨烯（go）置于纯水中，超声破碎，制成go悬浮液，再加入抗坏血酸（aa）还原，得到rgo悬浮液；（2）还原性氧化石墨烯-氯化血红素(rgo-hemin)的制备在氯化血红素（hemin）粉末中加入氨水至纯水中溶解，得到氯化血红素溶液。在rgo溶液加入氯化血红素（hemin），搅拌反应，得到均匀的rgo-hemin分散液；（3）还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-氯化血红素（rgo-cmcs-hemin）的制备在rgo-hemin溶液中加入羧甲基壳聚糖（cmcs）溶液，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙
基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基琥珀酰亚胺（edc/nhs）活化，搅拌反应，得到rgo-cmcs-hemin分散液；（4）rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps复合材料的制备在rgo-cmcs-hemin分散液中加入氯铂酸钠（na2ptcl6）、氯钯酸钠（na2pdcl6）和水合肼（n2h4·
h2o），放置在磁力搅拌器上搅拌后取出，得到 rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps溶液；（5）rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps-apt识别探针的制备将apt溶液和rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps溶液混合，孵育，即得rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps-apt溶液。
6.步骤2：比色生物传感界面的构建（1）将未修饰的gp73适配体（apt ι）溶液室温孵育，加入牛血清白蛋白（bsa）溶液封闭非特异性识别位点；（2）将gp73溶液滴加到apt ι溶液中，室温孵育，得到apt ι/gp73溶液；（3）在apt ι/gp73溶液中滴加rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps-apt溶液，室温孵育，得到apt ι/gp73/rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps-apt溶液。
7.步骤3：gp73工作曲线及标准曲线的绘制（1）将含有显色体系tmb-h2o2的磷酸盐缓冲溶液加入步骤2得到的溶液中，反应一段时间。采用紫外-分光光度计的分光光度法在500-800 nm范围内进行测量，记录652 nm处的吸光度；（2）分别对不同浓度的gp73进行检测，记录652 nm处的吸光度；根据吸光度与gp73浓度的关系，绘制gp73的工作曲线；计算出该方法的最低检测限。
8.步骤4：实际血清样本中gp73的检测（1）将人血清样本与gp73标准溶液以1:1的比例充分混合，制成待测混合液；（2）将所得的待测混合液加入到步骤2得到的溶液中，再加入含有显色体系tmb-h2o2的磷酸盐缓冲溶液，反应一段时间；采用紫外-分光光度计的分光光度法进行测量，记录652 nm处的吸光度；（3）根据步骤3所得到的工作曲线，计算实际血清样品中gp73的浓度。
9.作为优选：步骤1中所述rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps溶液和gp73apt溶液的体积比为1:3；搅拌时间为12h；步骤2中所述gp73溶液的孵育温度为25 o
c；所述gp73溶液的孵育时间为40 min；其余溶液的孵育时间为1 h；步骤3和步骤4中所述显色体系tmb-h2o2溶液中磷酸盐缓冲液ph=4.0；所述反应时间为10min。
10.其中，步骤1制备的rgo-cmcs-hemin/pt@pd nps-apt识别探针为步骤3和步骤4的实施提供了具有大比表面积和高催化性能的纳米酶，并能够特异性识别gp73；步骤2中生物传感界面的构建为步骤3中gp73的检测提供了坚实的载体，步骤3的工作曲线绘制为步骤4实际血清样本中gp73 的含量计算提供必不可少的计算依据。可见步骤1-4相互配合，共同作用，才能利用rgo-cmcs
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hemin/pt@pd nps-apt识别探针构建夹心型比色传感器实现
cmcs-hemin材料制备成功。
17.（3）在rgo-cmcs-hemin溶液中分别加入2ml20mmol/lna2ptcl6和20mmol/lna2pdcl6，加入5μln2h4·
h2o，搅拌12h后取出，得到浓度为1.0mg/mlrgo-cmcs-hemin/pt@pdnps溶液。使用tecnaig2f30s-twin投射电子显微镜进行表征，图2c为rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps的tem图，褶皱膜状结构上明显分散着纳米颗粒，证明ptnps和pdnps已成功附着在rgo-cmcs-hemin表面，表明rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps纳米材料制备成功。
18.（4）将gp73apt溶液和rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps溶液混合，孵育过夜，即得rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps-gp73apt溶液。使用日立高新技术公司生产的uh5300紫外-可见光光度计进行分析，图3为rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps纳米材料和rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps-gp73apt的紫外光谱图，两者的吸光度有明显差异，证明rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps-gp73apt识别探针制备成功。
19.步骤2：比色生物传感界面的构建（1）将3μl浓度为3μmol/l未修饰的gp73适配体（aptι）在室温下孵育1h，得到捕获探针aptι溶液。
20.（2）滴加3μl质量分数为1%的bsa溶液进行封闭，室温孵育1h。将3μl不同浓度gp73滴加到封闭后的捕获探针aptι的表面，25℃孵育40min，得到aptι/gp73溶液。
21.（3）将3μlrgo-cmcs-hemin/pt@pdnps-gp73apt滴加到aptι/gp73表面，孵育1h，得到aptι/gp73/rgo-cmcs-hemin/pt@pdnps-gp73apt溶液。
22.步骤3：gp73工作曲线及标准曲线的绘制在步骤2构建的gp73比色生物传感器中加入9μl浓度为125mmol/lph值为4.0含有显色体系tmb-h2o2的磷酸盐缓冲溶液，1.5μl浓度为50mmol/l的tmb和1.5μl浓度为100mmol/l的h2o2溶液。利用紫外-分光光度计测量652nm处的吸光度。不同gp73浓度的工作曲线及标准曲线见图3。gp73浓度在10~110ng/ml范围内，吸光度（y）与gp73浓度（x）呈线性关系，其工作曲线为：y=0.0030x+0.3337，相关系数为0.9947。将空白对照的三倍标准偏差定义为检测下限，通过公式c
lod
=3sb/b计算得到该方法的最低检测限为5.0ng/ml。
23.步骤4：实际血清样本中gp73的检测通过加标法在最佳条件下检测人血清样本中的gp73水平。将正常人血清样本分别与50.0ng/ml，80.0ng/ml，100.0ng/ml的gp73溶液按照1：1的比例充分混合，制成混合液。在步骤2构建的gp73比色生物传感界面滴加3μl混合液，放入25oc孵育箱中孵育40min。按照步骤3所述，将所得溶液置于含有显色体系tmb-h2o2的磷酸盐缓冲溶液（ph=4.0）中进行扫描，记录吸光度。通过步骤3得到的gp73标准曲线：y=0.0030x+0.3337，计算人血清样品中gp73的浓度，结果见表1所示，其回收率在98.199%-106.505%范围内，相对标准偏差为1.900%-5.444%范围内。这些结果表明，所开发的gp73比色传感器可应用于实际样本分析。
24.表1实际血清样本中gp73的检测结果
。
25.（注：血清样本来自中国人民解放军第九二四医院（中国桂林）广西代谢病研究重点实验室，并遵循中国人民解放军第九二四医院广西代谢病研究重点实验室伦理委员会要求。样本1的afp含量为3.12 ng/ml，样本2的afp含量为7.37 ng/ml）。