一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置及方法

1.本发明属于光学领域，涉及一种生物成像装置及方法，尤其涉及一种基于宽光谱偏焦技术和宽光谱相位恢复方法实现生物切片、细胞或细菌等生物样品成像的装置及方法。


背景技术：

2.生物成像是了解生物结构和功能的最直观测量手段，在临床医学诊断领域越来越受重视。无论是生物还是医学研究领域，清晰直观的图像在探寻疾病的发病机理、临床表现以及疾病诊断均具有重大意义。
3.光学显微成像技术可直观观测生物样品，大致可分为三类：
4.一是传统光学显微成像技术，包括明场显微成像技术、暗场显微成像技术和荧光显微成像技术。明场显微成像技术的成像对比度差，在观察弱吸收和弱散射的生物样品时需要染色，损失生物细胞活性；相较于明场显微成像技术，暗场显微成像技术提高了成像对比度，但成像光强太弱，成像质量不高；荧光显微成像技术只能针对标记了荧光染料的细胞结构进行观测，并且在活体细胞检测时，短波长激发光容易对活体细胞产生不可逆转的光毒性损伤。
5.二是定性显微成像技术，包括相衬显微成像技术和微分干涉相衬显微成像技术。相衬显微成像技术主要用于观察未染色的透明生物样品，将不可见的相位变化转化为可见的强度变化，其观测效果远远优于明场显微成像技术，它的不足之处便是光晕现象影响细胞观测，以及环形光束照明降低了光源的利用率，此外透射光和衍射光强度比例调制比较难实现；而微分干涉相衬显微成像技术克服了相衬显微成像技术的光晕现象，成像质量更高，但光路系统更为复杂。
6.三是定量显微成像技术，前两类显微成像技术都只能定性观察，而定量显微成像技术可实现定量相位测量，包括有基于干涉的显微成像技术、基于强度传输方程的显微成像技术以及基于迭代的显微成像技术。其中，基于干涉的显微成像技术，光学系统复杂，对实验条件的稳定性、光源的相干性以及干涉条纹的分辨率要求高，而且相位的求解需要解包裹，因此并未得到广泛应用；基于强度传输方程的显微成像技术，属于非干涉技术，在待测平面的光强和光强轴向微分已知的情况下，通过数值求解光强传输方程直接获取相位信息，但该技术依赖小离焦范围内的相衬信息来恢复相位时，相位低频部分的相衬度较低，采用大离焦又会使相位高频部分的相衬度减弱；基于迭代的显微成像技术，多次在待测物面和衍射面之间迭代计算，并进行振幅替换，相位保留的投影操作，直至求解待测物面的相位，该技术的代表是叠层显微成像技术，虽然分辨率高，但计算耗时，并且实验操作的扫描过程十分复杂，另外，基于迭代的显微成像技术属于非干涉技术，采用的相干光源极易在实际的探测光强中引入干涉条纹，影响相位测量精度，最终影响生物样品的成像清晰度。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于解决现有基于迭代的显微成像中的叠层显微成像技术计算耗时、扫描过程复杂以及采用相干光源极易在实际的探测光强中引入干涉条纹，影响生物样品成像清晰度的技术问题，而提供一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置及方法。
8.为了解决上述技术问题，本发明所提供的技术解决方案是：
9.一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置，其特殊之处在于，包括照明单元、分束镜、光谱测量单元及生物成像单元；
10.所述照明单元发出宽光谱的照明光入射到分束镜，分为反射光束和透射光束；
11.所述光谱测量单元包括沿分束镜反射光路依次设置的第三透镜和光谱仪；
12.所述生物成像单元包括沿分束镜透射光路依次设置的第四透镜和探测器；所述分束镜与第四透镜之间用于放置待测生物样品；
13.所述探测器可在第四透镜的负离焦面a、焦平面b及正离焦面c位置处沿光轴方向移动，用于接收相应的探测光强；
14.定义透射光束传输方向为正方向，所述负离焦面a与焦平面b的距离为-δz，所述正离焦面c与焦平面b的距离为δz，其中f为第四透镜的焦距。
15.进一步地，一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置还包括一维平移台，所述一维平移台用于放置探测器，通过一维平移台的轴向平移，使探测器可以在第四透镜的负离焦面a、焦平面b以及正离焦面c三个位置移动探测。
16.进一步地，一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置还包括二维平移台，所述二维平移台用于放置生物样品，通过移动二维平移台，实现生物样品的二维扫描测量，以选定一个合适的生物样品的待测区域。
17.进一步地，所述照明单元采用柯勒照明，包括白光光源、沿白光光源出射光路依次设置的第一透镜、第二透镜以及滤光片，所述白光光源发出的白光经过第一透镜汇聚、第二透镜准直后，再通过滤光片滤光后形成宽光谱的照明光，宽光谱的照明光避免了相干光照明时，附加的干涉条纹对成像清晰度的影响。
18.进一步地，所述照明单元还包括依次设置在第一透镜和第二透镜之间的第一光阑和第二光阑，所述第一光阑、第二光阑用于去除杂散光。
19.同时，本发明还提供一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
20.1)光谱仪测量宽光谱照明光的光谱成分
21.光谱仪测量宽光谱照明光的光谱成分，得到宽光谱照明光中的波段组成：λ＝[λ1,
····
λi,
···
λn]，i∈[1,n]，λi表示第i个波长信息，各个波长所占权重α＝[α1,
····
αi,
···
αn]，并且α1+
···
αi+
···
αn＝1；
[0022]
2)宽光谱偏焦技术获得探测光强
[0023]
探测器依次在距离焦平面-δz的负离焦面a、焦平面b和距离焦平面δz的正离焦面c三个位置处探测，获取相应的三个探测光强i-δz
(x1,y1)，if(x2,y2)和i
δz
(x3,y3)；其中，(x1,y1)，(x2,y2)和(x3,y3)分别为负离焦面a、焦平面b和正离焦面c的坐标，离焦量
f为第四透镜的焦距；
[0024]
3)基于宽光谱相位恢复方法实现生物样品成像
[0025]
3.1)初始假设焦平面b光场分布为：
[0026]
uf(x2,y2)＝[α1uf(x2,y2,λ1),
···
αiuf(x2,y2,λi),
···
αnuf(x2,y2,λn)]，i∈[1,n]；
[0027]
其中，uf(x2,y2,λi)＝exp[jφf(x2,y2,λi)]，φf(x2,y2,λi)为波长λi对应的相位假设初值，定义迭代次数为m，m为大于等于1的整数，初始迭代次数m＝1；
[0028]
3.2)焦平面b光场uf(x2,y2)正向衍射传输至正离焦面c，正离焦面c光场分布为：
[0029]uδz
(x3,y3)＝p
weight
[uf(x2,y2),δz]＝{α1p[uf(x2,y2,λ1),δz],
···
αip[uf(x2,y2,λi),δz],
···
αnp[uf(x2,y2,λn)],δz}；
[0030]
其中，p
weight
为多波长权重角谱传输算子，p为单波长角谱传输算子；
[0031]
3.3)用正离焦面c实际的探测光强i
δz
(x3,y3)，替代正离焦面c的计算光强，保留相位，求得更新的正离焦面c光场分布u'
δz
(x3,y3)；
[0032]
3.4)更新的正离焦面c光场u'
δz
(x3,y3)逆向传输至焦平面，焦平面b的更新光场分布为
[0033]
3.5)用焦平面b实际的探测光强if(x2,y2)，替代焦平面b的计算光强，保留相位，求得更新的焦平面b光场分布
[0034]
3.6)更新的焦平面b光场分布逆向传输至负离焦面a，负离焦面a的光场分布为
[0035]
3.7)用负离焦面a实际的探测光强i-δz
(x1,y1)，替代负离焦面a的计算光强，保留相位，求得更新的负离焦面a光场分布u'-δz
(x1,y1)；
[0036]
3.8)更新的负离焦面a光场u'-δz
(x1,y1)正向传输至焦平面b，焦平面b的更新光场分布为
[0037]
3.9)用焦平面b实际的探测光强if(x2,y2)，替代焦平面b的计算光强，保留相位，求得更新的焦平面b光场分布
[0038]
3.10)更新的焦平面b光场逆向传输至生物样品面，获得生物样品面的光场分布为：光场分布为：
[0039]
其中，γ
weight
为多波长权重透镜传输算子，γ为单波长透镜传输算子，(x0,y0)为生物样品面的坐标；
[0040]
3.11)计算误差评价函数mse或均方根rms，当误差评价函数mse或均方根rms小于相应的阈值时，迭代停止，执行3.12)；否则，m＝m+1，相应的阈值时，迭代停止，执行3.12)；否则，m＝m+1，返回3.2)；
[0041]
3.12)根据更新的焦平面b光场求得生物样品的相位分布：
实现生物样品成像，其中angle代表求相位操作。
[0042]
进一步地，步骤3.3)中，所述更新的正离焦面c光场分布u'
δz
(x3,y3)通过以下公式获得：
[0043][0044]
步骤3.5)中，所述更新的焦平面b光场分布通过以下公式获得：
[0045][0046]
步骤3.7)中，所述更新的负离焦面a光场分布u'-δz
(x1,y1)通过以下公式获得：
[0047][0048]
步骤3.9)中，所述更新的焦平面b光场分布通过以下公式获得：
[0049][0050]
进一步地，步骤3.11)中，所述误差评价函数mse的计算公式为：
[0051]
m＝1时，mse＞10-5
；
[0052]
m》1时，
[0053]
所述误差评价函数mse的阈值为10-5
。
[0054]
进一步地，步骤1)中，所述照明单元采用柯勒照明，用于提供宽光谱照明光。
[0055]
本发明相比现有技术具有的有益效果如下：
[0056]
1、本发明提供的一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置，在生物成像光路中，利用探测器分别在第四透镜的负离焦面a、焦平面b以及正离焦面c三个位置处探测，获得相应的探测光强，并结合基于宽光谱的相位恢复方法即可求解生物样品的相位信息，从而实现对生物样品的成像，相较于叠层显微成像技术，不包含复杂的扫描过程，实验操作简便。
[0057]
2、本发明提供的一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置，采用宽光谱的柯勒照明，相较于相干光照明时，不会引入附加的干涉条纹影响相位测量精度，提高了生物样品的成像精度。
[0058]
3、本发明提供的一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置，探测器设置在一维平移台上，通过一维平移台的轴向平移可以方便探测器在第四透镜的负离焦面a、焦平面b以及正离焦面c三个位置移动探测，获取相应的探测光强。
[0059]
4、本发明提供的一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置，生物样品设置在二维平移台上，通过移动二维平移台，可以实现生物样品的二维扫描测量，方便选定一个合适的生物样品待测区域。
[0060]
5、本发明提供的一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像方法，可实现对生物样品的无染色及定量相位成像。
[0061]
6、本发明提供的一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像方法，成像速度快，在活体生物样品实时成像领域，具有应用前景。
附图说明
[0062]
图1为本发明基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置实施例的结构示意图；
[0063]
图2为本发明基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像方法实施例步骤3)的流程图。
[0064]
附图标记说明如下：
[0065]
1-白光光源；2-第一透镜；3-第一光阑；4-第二光阑；5-第二透镜；6-滤光片；7-分束镜；8-第三透镜；9-光谱仪；10-生物样品；11-二维平移台；12-第四透镜；13-探测器；14-一维平移台。
具体实施方式
[0066]
为使本发明的优点和特征更加清楚，以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0067]
如图1所示，本发明一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像装置，包括照明单元、分束镜7、光谱测量单元及生物成像单元；照明单元采用柯勒照明，包括白光光源1以及沿白光光源1出射光路依次设置的第一透镜2、第一光阑3、第二光阑4、第二透镜5以及滤光片6，白光光源1发出的白光经过第一透镜2汇聚、第二透镜5准直后，再通过滤光片6滤光后形成宽光谱的照明光，为生物成像光路提供均匀的宽光谱照明光，避免了相干光照明时，附加的干涉条纹对成像清晰度的影响，第一光阑3、第二光阑4用于去除杂散光；照明单元发出宽光谱的照明光入射到分束镜7，分为反射光束和透射光束；光谱测量单元包括沿分束镜7反射光路依次设置的第三透镜8和光谱仪9；生物成像单元包括沿分束镜7透射光路依次设置的第四透镜12和探测器13；所述分束镜7与第四透镜12之间放置了待测生物样品10。定义透射光束传输方向为正方向，假设第四透镜12的焦平面b为原点，负离焦面a与焦平面b的距离为-δz，正离焦面c与焦平面b的距离为δz，其中f为第四透镜12的焦距。探测器13设置在一维平移台14上，通过一维平移台14轴向平移使探测器13分别在第四透镜12的负离焦面a、焦平面b以及正离焦面c三个位置接收相应的探测光强；生物样品10设置在二维平移台11上，通过移动二维平移台11，实现生物样品10的二维扫描测量，以选定一个合适的生物样品10的待测区域。
[0068]
照明单元的白光光源1发出的白光经过第一透镜2汇聚、第二透镜5准直后，再通过滤光片6滤光后形成宽光谱的照明光；分束镜7对宽光谱照明光进行分束，分为反射光束和透射光束两路。反射光束通过第三透镜8进入光谱仪9，组成光谱测量光路，由光谱仪9测量宽光谱照明光的光谱成分；生物成像单元通过移动二维平移台11，实现生物样品10的二维扫描测量，以选定一个合适的生物样品10的待测区域，经分束镜7分束后的透射光束照射待测生物样品10，通过第四透镜12会聚后，探测器13通过一维平移台14的轴向平移，分别在第四透镜的负离焦面a、焦平面b和正离焦面c三个位置处探测，接收相应的探测光强。利用探
测器13探测的多幅探测光强以及基于宽光谱的相位恢复方法，即可实现对生物样品的成像。
[0069]
本发明还提供一种基于宽光谱偏焦相位恢复的生物成像方法，包括以下步骤：
[0070]
1)光谱仪9测量宽光谱照明光的光谱成分
[0071]
照明单元采用柯勒照明，发出的宽光谱照明光经分束镜7反射，反射光束通过第三透镜进入光谱仪9，经光谱仪9测量，宽光谱照明光中的波段组成如下：λ＝[λ1,
····
λi,
···
λn]，i∈[1,n]，λi表示第i个波长信息，各个波长所占权重α＝[α1,
····
αi,
···
αn]，并且α1+
···
αi+
···
αn＝1；
[0072]
2)宽光谱偏焦技术获得探测光强
[0073]
通过移动二维平移台11，实现生物样品10的二维扫描测量，首先选定一个合适的生物样品10的待测区域；定义透射光束传输方向为正方向，照明单元发出的宽光谱照明光经分束镜7分束后的透射光束照射待测生物样品10，通过第四透镜12会聚后，探测器13通过一维平移台14轴向平移，依次在距离焦平面-δz的负离焦面a、焦平面b和距离焦平面δz的正离焦面c三个位置处探测，获取相应的三个探测光强i-δz
(x1,y1)，if(x2,y2)和i
δz
(x3,y3)；其中，(x1,y1)，(x2,y2)和(x3,y3)分别为负离焦面a、焦平面b和正离焦面c的坐标，离焦量其中f为第四透镜(12)的焦距；
[0074]
3)基于宽光谱相位恢复方法实现生物样品成像
[0075]
基于宽光谱相位恢复方法实现生物样品成像具体步骤如下，相应的算法流程如图2所示：
[0076]
3.1)根据步骤1)获得的宽光谱照明光中的波段组成及权重，初始假设焦平面b的光场分布表达式为：
[0077]
uf(x2,y2)＝[α1uf(x2,y2,λ1),
···
αiuf(x2,y2,λi),
···
αnuf(x2,y2,λn)]，i∈[1,n]；
[0078]
其中uf(x2,y2,λi)＝exp[jφf(x2,y2,λi)]；其中φf(x2,y2,λi)为波长λi对应的相位假设初值，定义迭代次数为m，m为大于等于1的整数，初始迭代次数m＝1；
[0079]
3.2)焦平面b光场uf(x2,y2)正向衍射传输至正离焦面c，正离焦面c光场为u
δz
(x3,y3)＝p
weight
[uf(x2,y2),δz]＝{α1p[uf(x2,y2,λ1),δz],
···
αip[uf(x2,y2,λi),δz],
···
αnp[uf(x2,y2,λn)],δz}；其中，p
weight
为多波长权重角谱传输算子，代表各个波长对应的光场分别衍射传输至正离焦面c，p为单波长角谱传输算子；按权重计算求得u
δz
(x3,y3)；
[0080]
3.3)利用探测器13接收的正离焦面c实际的探测光强i
δz
(x3,y3)，替代正离焦面c的计算光强，保留相位，求得更新的正离焦面c光场分布：
[0081]
3.4)更新的正离焦面c光场u'
δz
(x3,y3)逆向传输至焦平面b，焦平面b的更新光场分布为
[0082]
3.5)利用探测器13接收的焦平面b实际的探测光强if(x2,y2)，替代焦平面b的计算
光强，保留相位，求得更新的焦平面b光场分布：
[0083]
3.6)更新的焦平面b光场分布逆向传输至负离焦面a，负离焦面a的光场分布为
[0084]
3.7)利用探测器13接收的负离焦平面a实际的探测光强i-δz
(x1,y1)，替代负离焦面a的计算光强，保留相位，求得更新的负离焦面a光场分布：
[0085]
3.8)更新的负离焦面a光场u'-δz
(x1,y1)正向传输至焦平面b，焦平面b的更新光场分布为
[0086]
3.9)再次利用探测器13接收的焦平面b实际的探测光强if(x2,y2)，替代焦平面b的计算光强，保留相位，求得更新的焦平面b光场分布为：
[0087]
3.10)更新的焦平面b光场逆向传输至生物样品面，获得生物样品面的光场分布为：光场分布为：其中，γ
weight
为多波长权重透镜传输算子，γ为单波长透镜传输算子，(x0,y0)为生物样品面的坐标；
[0088]
3.11)计算误差评价函数mse或均方根rms，根据误差评价函数mse或均方根rms是否小于相应的阈值来判断迭代是否停止；
[0089]
本实施例中计算误差评价函数mse，误差评价函数mse根据下式计算：
[0090]
m＝1时，mse＞10-5
；
[0091]
m》1时，
[0092]
当误差评价函数mse《10-5
时，迭代停止，执行3.12)；否则m＝m+1，返回3.2)；
[0093]
3.12)根据更新的焦平面b光场求得生物样品10的相位分布：实现生物样品10的成像，其中angle代表求相位操作。
[0094]
以上，仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，对于本领域的普通专业技术人员来说，可以对上述实施例所记载的具体技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所保护技术方案的范围。