本发明属于医药检测，具体涉及一种高效分离并检测4- 氯-6-乙基-5-氟嘧啶中有关物质的高效液相色谱法。
背景技术：
1、伏立康唑为氟康唑类抗真菌药，具有抗菌谱广、抗菌效力强、安全性好等优点，临床主要用于治疗急性或慢性深部真菌感染。
2、
3、4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶为制备伏立康唑的关键起始物料，其所含杂质成为伏立康唑制备中的有关物质而影响伏立康唑的质量和安全有效性。为此，需要开发一种高效分离并检测伏立康唑起始物料4- 氯-6-乙基-5-氟嘧啶中有关物质的方法，以简便、快速、精确控制药品质量，保障药品的有效性和安全性。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种结构如式i所示的4-氯-6-[1-(6-乙基- 5-氟-嘧啶-4-基)-乙基]-5-氟-嘧啶(下称式ⅰ化合物)：
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3、本发明的优选技术方案中，式ⅰ化合物参与伏立康唑的制备生成氯代二聚体、二聚体1的任一种。
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5、本发明的另一目的在于提供一种式ⅰ化合物的制备方法，包括如下步骤：将4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶溶于有机溶剂，搅拌条件下，在反应体系中加入三氯氧磷和水，将反应体系加热至50℃-85℃，搅拌反应24-120h，将反应体系降温至25℃以下后，加入盐溶液淬灭反应，搅拌，分层，收集有机层，在收集的有机层中加入干燥剂干燥10- 60min，过滤，将收集的滤液与硅胶均匀混合后，减压浓缩，所得固体颗粒上硅胶柱，硅胶柱经洗脱溶剂洗脱、分离和纯化，即得，其中，所述的有机溶剂选自1,2-二氯乙烷、氯仿、乙腈中的任一种或其组合。
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7、本发明优选的技术方案中，反应体系中的有机溶剂与4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶的体积质量比为1-10:1，优选为3-5:1。
8、本发明优选的技术方案中，反应体系中的三氯氧磷与4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶的摩尔比为0.1-5:1，优选为0.5-2：1。
9、本发明优选的技术方案中，反应体系中的水与4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶的质量比为0.01-1:1，优选为0.02-0.05：1。
10、本发明优选的技术方案中，反应体系中的反应温度为55-85℃，优选为60-80℃。
11、本发明优选的技术方案中，所述搅拌速度为100-300rpm，优选为 150-250rpm。
12、本发明优选的技术方案中，所述搅拌反应时间为48-72h。
13、本发明优选的技术方案中，收集的滤液与硅胶的体积质量比为3： 1-7：1，优选为5：1。
14、本发明优选的技术方案中，所述减压浓缩条件为30-60℃、压力≤-0.08mpa。
15、本发明优选的技术方案中，所述减压浓缩条件为40-50℃、压力≤-0.09mpa。
16、本发明优选的技术方案中，所述盐溶液选自氯化钠溶液、氯化铵溶液中的任一种或其组合。
17、本发明优选的技术方案中，所述盐溶液与反应液之间的体积比为1-10:1，优选为2-4:1。
18、本发明优选的技术方案中，所述干燥剂选自无水硫酸钠、无水硫酸镁中的任一种或其组合。
19、本发明优选的技术方案中，所述干燥剂的干燥时间为30-40min。
20、本发明优选的技术方案中，所述反应液干燥至含水量≤0.5％，优选为≤0.3％。
21、本发明优选的技术方案中，所述硅胶柱洗脱、分离与纯化的方法包括下述步骤：在收集滤液中加入硅胶，均匀混合后，减压浓缩得固体粉末，将制得的固体粉末上硅胶柱，先用正庚烷洗脱去除杂质，再改用正庚烷与乙酸乙酯的混合溶剂洗脱，收集并合并正庚烷与乙酸乙酯的洗脱液，减压蒸馏至无溶剂蒸出，即得，其中，收集滤液与硅胶之间的体积质量比为3：1-7：1。
22、本发明优选的技术方案中，正庚烷与乙酸乙酯的混合组成的洗脱溶剂中正庚烷：乙酸乙酯的体积比为1-10:1，优选为2-5:1。
23、本发明优选的技术方案中，所述减压蒸馏条件为40-80℃、压力≤-0.08mpa，优选为50-60℃，压力≤-0.09mpa。
24、本发明优选的技术方案中，所述式i化合物的纯度≥98％，优选≥99％。
25、本发明的另一目的在于提供式i化合物用作检测并控制4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶质量的标准品或对照品。
26、本发明的目的在于提供一种高效分离并检测4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶中有关物质的高效液相色谱法，所述色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相由磷酸盐缓冲液(a相)与乙腈(b相) 按照体积比为70:30-40:60组成，检测波长为250-270nm，流速为0.5- 2ml/min，柱温为30-40℃，进样量为5-20μl。
27、本发明优选的技术方案中，所述磷酸盐选自二水合磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵中的任一种或其组合。
28、本发明优选的技术方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1-5‰，优选为2-4‰。
29、本发明优选的技术方案中，所述磷酸盐缓冲液ph4.0-5.0，优选为ph4.5-4.9。
30、本发明优选的技术方案中，所述ph调节剂选自磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的任一种或其组合。
31、本发明优选的技术方案中，所述色谱柱的直径为3-5mm，长度 100-300mm，填料粒径为3-5μm。
32、本发明优选的技术方案中，所述色谱柱为c18柱，规格为 250mm*4.6mm，粒径5μm，优选为waters x-bridge c18柱。
33、本发明优选的技术方案中，所述流动相中a相：b相的体积比为62:38-58:42。
34、本发明优选的技术方案中，所述检测波长为258-262nm。
35、本发明优选的技术方案中，所述柱温为33-37℃。
36、本发明优选的技术方案中，所述流速为0.9-1.1ml/min。
37、本发明优选的技术方案中，检测器选自二极管阵列检测器或紫外检测器的任一种。
38、本发明优选的技术方案中，所述高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。
39、本发明优选的技术方案中，所述有关物质选自杂质a、式i化合物中的任一种或其组合，
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41、本发明优选的技术方案中，还包括将杂质a和式i化合物配制成杂质对照溶液。
42、本发明优选的技术方案中，所述杂质对照溶液的浓度为1- 10μg/ml，优选为2-5μg/ml。
43、本发明优选的技术方案中，还包括将4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶配制成供试品溶液。
44、本发明优选的技术方案中，所述供试品溶液的浓度为0.1- 1mg/ml，优选为0.4-0.6mg/ml。
45、本发明优选的技术方案中，采用稀释剂配置、溶解、稀释供试品溶液、杂质对照溶液的任一种。
46、本发明优选的技术方案中，所述稀释剂选自色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、流动相的任一种或其组合。
47、本发明的优选技术方案中，所述杂质a参与伏立康唑的制备反应，生成羟基伏立康唑。
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49、本发明的另一目的在于提供杂质a和/或式i化合物用作检测并控制4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶质量的标准品或对照品。
50、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
51、与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
52、1、本发明首次制备、分离和纯化式ⅰ化合物【4-氯-6-[1-(6-乙基- 5-氟-嘧啶-4-基)-乙基]-5-氟-嘧啶)】，制得式ⅰ化合物的纯度≥98％，将其用作检测并控制4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶质量的标准品或对照品，利于提高伏立康唑质量并实现药品质量可控，保障临床用药的有效性和安全性。
53、2、本发明科学筛选高效液相色谱法的色谱条件及洗脱条件，首次高效分离并检测4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶中的杂质a和式i化合物及其他有关物质，检测方法具有专属性强、稳定性好、重复性好、耐用性好、操作简便、用时短等优点，利于检测并控制4-氯-6-乙基-5-氟嘧啶质量，以保障伏立康唑原料药及制剂的质量和临床用药的安全有效性。