一种双电场驱动传感器的制备方法及其应用

1.本发明属于电化学传感器检测农药残留领域，具体涉及一种双电场驱动传感器的制备方法及其应用。


背景技术：

2.农药是用来预防、控制和减少有害生物的物质或混合物，随着现代农业的发展，农药的应用已成为作物生产中必不可少的环节之一。然而，农药的过度使用会导致地下水和食物污染，对人类和动物造成严重影响。人类长期接触农药对健康可导致有害影响，如神经毒性、遗传毒性、致突变性和致癌性。尽管各种基于实验室的分析方法，如气相色谱、高效液相色谱、质谱和酶联免疫吸附测定方法已被广泛应用，但它们都存在着各自的缺点，如使用昂贵的仪器、耗时的过程和需要受过专业培训的人员。电化学免疫传感器具有特异性强、灵敏度高等优点，常被用作有效的检测方法。然而，上述技术依赖于受体与目标分子的反应，这些反应通过扩散主导的运输动力学发生。在实际样品中，目标分析物在复杂的基质中浓度很低，免疫反应的进行可能需要几个小时甚至几天的时间，在极端情况下，甚至可能不会发生，这不利于实际样品中快速、灵敏地检测。
3.目前市场上并无成型的利用双电场驱动电化学传感器实现农药残留快速检测的设备。在现有的应用电化学免疫传感器检测农药残留技术中，专利“一种基于两种电化学方法联用的甲基对硫磷免疫传感器的制备方法及应用”cn105806922a公开了一种基于功能纳米材料的生物免疫传感器的制备方法，以及利用所述传感器对甲基对硫磷进行检测的方法。该方法得到的传感器携带方便，成本低廉。但该传感器制作的过程复杂，传感时间长，不适合快速检测。


技术实现要素：

4.针对传统电化学免疫传感器检测农药残留技术存在制作复杂，灵敏度低、响应速度慢等问题，本发明公开一种双电场驱动传感器的制备方法及其应用，结合外部互补的双电场驱动和抗原抗体反应的特异性，快速测定自然样品中的农药残留。
5.所述双电场驱动传感器的制备，包括柔性印刷基底的制作、双电场驱动模块的构建和工作电极的修饰。本发明采用柔性印刷电路技术制造柔性印刷基底，降低了传感器制作成本。根据柔性印刷电极上多个电极阵列能够有效的调节双电场分布。通过在电极表面修饰还原性氧化石墨烯(rgo)和金纳米粒子(aunps)赋予传感器良好的生物相容性、优良的催化性能和导电性能。同时引入农药抗体来选择性的识别农药分子。在外加双电场驱动的条件下，溶液中微流和颗粒的可以定向运动，分析物能快速流向生物传感器表面，从而提高了分析物与传感器表面抗体的结合效率，大大缩短了免疫传感器的反应时间。尤其是互补的双电场模式能有效的防止电压过大而在传感器表面产生气泡，从而建立了更有效的电场增强策略，提高了传感器灵敏度和检测效率。本发明根据以上原理设计出的双电场驱动传感器已经实现对自然样本中农药残留的选择性检测，同时具有制作简单，成本低，易携带，
检测时间短等优点。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.一种双电场驱动传感器的制备方法，包括以下步骤：柔性印刷基底的制作、双电场驱动模块的构建和工作电极的修饰。
8.步骤一、柔性印刷基底的制作：
9.利用计算机绘图软件设计电路形状；对柔性聚酰亚胺基板进行裁剪；在柔性聚酰亚胺基板的一端设置线路连接的n个导电孔并标记为n1、n2、n3……nn-1
、nn，n为不小于5的正整数；在柔性聚酰亚胺基板表面喷涂上一层均匀的铜膜；利用光刻技术将光致抗蚀剂按照预先设计的电路形状涂覆在铜膜上；将已涂覆光致抗蚀剂的柔性聚酰亚胺基板放置紫外在灯下进行曝光；曝光后的柔性聚酰亚胺基板利用化学显影剂进行显影；显影后，未曝光区域被溶解，留下曝光区域形成铜箔线路；将显影后的柔性聚酰亚胺基板浸渍在氰化亚金钾(kau(cn)2)溶液中，利用电镀技术在相对导电孔的另一端形成一个未闭合的圆环金膜作为对电极，对电极圆环金膜开口的一端与导电孔n1电性连接；在对电极的内部区域设有工作电极，与导电孔n2之间电性连接；在对电极未闭合圆环处的空白环形区域处涂覆圆弧型ag/agcl浆料，干燥后作为参比电极，参比电极与导电孔n3电性连接；此时形成的对电极、工作电极、参比电极称为三电极体系；在柔性聚酰亚胺基板表面上设有中空反应腔，三电极体系均在中空反应腔的中空区域内；且与中空反应腔不接触；最终得到柔性印刷基底；
10.步骤二、双电场驱动模块的构建：在步骤一所制备的柔性印刷基底的三电极体系的背面电镀出两组独立的铜箔区，每个铜箔区域由m个独立的铜箔片组成，m为正整数；每组铜箔区的面积分布可以通过铜箔片来调整；两组铜箔区分别通过柔性聚酰亚胺基板的导电孔n4、n5连接双通道信号发生器，提供偏置正弦电场；设定动态偏置电压和峰间电压；每个铜箔区被分配一组电场；在运行过程中开启双通道信号发生器，对该三电极体系反应腔的中空区域提供一组互补的电场环境；
11.步骤三、工作电极的修饰：
12.首先制备氧化石墨烯(go)溶液；然后将go溶液滴加在反应腔中的三电极体系表面，在电化学工作站进行电沉积，沉积后用蒸馏水冲洗工作电极；其次制备氯金酸(haucl4)溶液，将haucl4溶液滴加在反应腔中的三电极体系表面，在电化学工作站进行电沉积，沉积后用蒸馏水冲洗工作电极；然后将硫酸(h2so4)滴加在反应腔中的三电极体系表面对工作电极进行活化；活化后用蒸馏水冲洗工作电极，冲洗后向反应腔中的三电极体系表面滴加农药抗体进行孵育，农药抗体孵育完成后用蒸馏水冲洗工作电极；冲洗后继续向反应腔中的三电极体系表面滴加牛血清蛋白(bsa)进行孵育，bsa孵育完成后用蒸馏水冲洗工作电极；最终得到双电场驱动传感器。
13.进一步的，步骤一中所述铜膜厚度为15～25μm；所述光致抗蚀剂为线性酚醛树脂、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种；所述化学显影剂为碳酸钠或碳酸钾中的一种，浓度为0.1～0.4g/ml；所述氰化亚金钾溶液的浓度为1～5g/l。
14.进一步的，步骤一中所述圆环金膜厚度为0.2～0.7μm；所述工作电极呈三叉戟的形状，由十个电性连接的圆形金膜组成；三叉戟的每条边分别有三个圆形金膜，剩下的一个圆形金膜在三条边的交汇处，交汇处的圆形金膜与导电孔n2之间电性连接；
15.所述弧型ag/agcl厚度为0.1～0.5mm；所述干燥的温度为70～90℃，干燥的时间为
30～40min。
16.进一步的，步骤二中所述铜箔片数量m为10～20之间的偶数，铜箔片形状为正方形，边长为1～1.5mm。
17.进一步的，步骤二中所述双通道信号发生器为任意型号的具有双通道电场发生装置，动态偏置电压设置为峰间电压的40～60％，峰间电压设置为2～6v。
18.进一步的，步骤三中所述氧化石墨烯溶液的浓度为2～6mg/ml，滴加量为10-15μl,电沉积时间为5～8min；所述氯金酸溶液的浓度为1～3mm，滴加量为10-15μl，电沉积时间为3～5min；所述h2so4浓度为0.3～0.6m，滴加量为20-30μl，活化时间为150-300s。
19.进一步的，步骤三中所述农药抗体的浓度为5～20μg/ml，滴加量为10-15μl，孵育时间为40～70min；所述牛血清蛋白的浓度为0.5％～2％，滴加量为10-15μl，孵育时间为30～60min。
20.一种所述双电场驱动传感器应用于农残的检测，包括以下步骤：
21.步骤一、建立电流/浓度(i/c)标准曲线：
22.配制一系列不同浓度的农药标准液滴加到所述的双电场驱动传感器的反应腔中的三电极体系表面进行孵育，同时在孵育过程中开启双通道电场发生装置，将孵育完成的传感器用于差分脉冲伏安法(dpv)测试，产生电流峰值；根据对应的农药浓度和峰值大小建立标准曲线；
23.步骤二、根据建立的i/c标准曲线计算出待测农药浓度：
24.在双电场驱动条件下，取农药样品液滴加在反应腔中的三电极体系表面进行孵育；孵育后进行dpv测试，在电化学窗口中产生一定的电流强度，根据建立的i/c标准曲线计算出待测农药浓度。
25.进一步的，步骤一中所述农药为毒死蜱、甲基对硫磷、水胺硫磷、吡虫啉、对氧磷、莠去津、三唑磷、多菌灵、噻虫啉或卡巴呋喃的任意一种，所述农药标准液的浓度为0.01～550μg/l，滴加量为10-15μl，孵育时间为1～5min；
26.所述双通道电场发生装置的动态偏置电压设置为峰间电压的40～60％，峰间电压设置为2～6v。
27.进一步的，步骤二中所述农药样品液的滴加量为10-15μl，孵育时间为1～5min；所述双通道电场发生装置的动态偏置电压设置为峰间电压的40～60％，峰间电压设置为2～6v。
28.本发明还提供了上述双电场驱动传感器在实际样品农药残留快速检测中的应用。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
30.本发明所述的柔性印刷基底重量轻，可自由弯曲和折叠，便于携带，可根据灵活的设计实现电子元件组装和电路连接。
31.本发明所述的rgo和aunps材料的结合呈现出优良的导电性、高比表面积和优越的生物相容性。
32.本发明所设计的免疫传感器具有良好的选择性，有效克服了实际样品中其他组分的干扰。
33.本发明所述的双电场驱动模块向反应腔中提供了两个互补的电场，诱导溶液对流，有效的加速了农药分子向电极表面运动，使免疫反应在短时间内完成。
附图说明
34.图1为双电场驱动模块的电场分布示意图；
35.图2为本发明的双电场驱动传感器正(a)、反(b)实物图；
36.图3为工作电极的修饰过程；
37.图4中a为双电场驱动模块加速免疫反应图；b为单电场驱动模块加速免疫反应图；c为无电场驱动免疫反应图；
38.图5为甲基对硫磷测定的标准曲线图；
39.图中，1-柔性聚酰亚胺基板；2-导电孔；3-铜膜；4-铜箔线路；5-对电极；6-工作电极；7-参比电极；8-反应腔；9-铜箔片。
具体实施方式
40.为了方便理解本发明，下面结合实例详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明中除非另有限制，本说明书使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。一旦存在矛盾，可以根据具体情况理解本说明书中的定义。本发明所使用的反应腔8为透明塑料材质；
41.在不同电场驱动条件下甲基对硫磷孵育时间对照试验，包括以下步骤：
42.步骤一、柔性印刷基底的制作：利用计算机绘图软件设计电路形状；对柔性聚酰亚胺基板1进行裁剪(长：3cm，宽：1.5cm)；在柔性聚酰亚胺基板1的一端设置线路连接的5个导电孔2并标记为n1、n2、n3、n4、n5；在柔性聚酰亚胺基板1表面喷涂上一层均匀的厚度为20μm铜膜3；利用光刻技术将光致抗蚀剂线性酚醛树脂按照预先设计的电路形状涂覆在铜膜3上；将已涂覆光致抗蚀剂的柔性聚酰亚胺基板1放置紫外在灯下进行曝光；曝光后的柔性聚酰亚胺基板1利用0.2g/ml碳酸钠进行显影；显影后，未曝光区域被溶解，留下曝光区域形成铜箔线路4；将显影后的柔性聚酰亚胺基板1浸渍在4g/l氰化亚金钾(kau(cn)2)溶液中，利用电镀技术在相对导电孔2的另一端形成一个未闭合的厚度为0.3μm圆环金膜作为对电极5，对电极5圆环金膜开口的一端与导电孔n1电性连接；在对电极5的内部区域设有由十个圆形金膜组成的工作电极6，其呈三叉戟的形状，三叉戟的每条边分别有三个圆形金膜，剩下的一个圆形金膜在三条边的交汇处，每个金膜之间电性连接，金膜交汇处与导电孔n2之间电性连接；在对电极5未闭合圆环处的空白环形区域处涂覆厚度为0.5mm圆弧型ag/agcl浆料，放置在真空干燥箱75℃干燥40min后作为参比电极7，参比电极7与导电孔n3电性连接；此时形成的对电极5、工作电极6、参比电极7称为三电极体系；在三电极体系所形成的区域表面上设有透明的中空塑料反应腔8，三电极体系均在中空塑料反应腔8的中空区域内，且与中空塑料反应腔8不接触；最终得到柔性印刷基底；
43.步骤二、双电场驱动模块的构建：在步骤一所制备的柔性印刷基底的三电极体系的背面电镀出两组独立的铜箔区，每个铜箔区域由12个独立的铜箔片9组成；每组铜箔区的面积分布可以通过相互焊接独立的铜箔片9来调整；两组铜箔区分别通过柔性聚酰亚胺基板1的导电孔2的n4、n5连接双通道信号发生器(sdg6052x,北京博宇讯铭科技有限公司)提供偏置正弦电场，设定动态偏置电压为3v，峰间电压设置为6v；采用双电场模块时开启双通道信号发生器，每个铜箔区被分配一组电场，对该三电极体系反应腔8的中空区域提供一组互
补的电场环境；采用单电场模块时开启信号发生器单通道模式；
44.图1为双电场驱动模块的电场分布示意图；图2为本发明的双电场驱动传感器正反实物图。从图1可以看出反应腔中存在2组电场，电场1和电场2分别作用于两组独立的铜箔区。
45.步骤三、工作电极的修饰：首先制备4mg/ml的氧化石墨烯(go)溶液；然后将15μlgo溶液滴加在反应腔8中的三电极体系表面，在电化学工作站进行电沉积7min，沉积后用蒸馏水冲洗工作电极6；其次制备1mm氯金酸(haucl4)溶液，将12μl haucl4溶液滴加在反应腔8中的三电极体系表面，在电化学工作站进行电沉积250s，沉积后用蒸馏水冲洗工作电极6；然后将25μl、0.5m硫酸(h2so4)滴加在反应腔8中的三电极体系表面对工作电极进行活化；活化后用蒸馏水冲洗工作电极6，冲洗后向反应腔8中的三电极体系表面滴加12μl、15μg/ml甲基对硫磷抗体进行孵育50min，甲基对硫磷抗体孵育完成后用蒸馏水冲洗工作电极6；冲洗后继续向反应腔8中的三电极体系表面滴加15μl、1％的牛血清蛋白(bsa)孵育40min，bsa孵育完成后用蒸馏水冲洗工作电极6；图3为传感器工作电极功能修饰过程，最终修饰完成得到双电场驱动传感器。
46.步骤四、不同电场驱动条件下甲基对硫磷孵育时间对照试验：将100μg/l、12μl甲基对硫磷滴入所述的双电场驱动传感器反应腔8中的三电极体系表面孵育；甲基对硫磷孵育过程分为三组，第一组开启双电场模块，第二组开启单电场模块，第三组禁用电场模块；在第一组中，每15s测定一次电流强度；在第二组中，每30s测定一次电流强度；在第三组中，每15min测定一次电流强度；当电流强度不再发生明显变化时记录孵育时间。
47.图4中a～c为分别采用双电场驱动、单电场驱动、无电场驱动条件下的甲基对硫磷孵育时间，依次为60s、180s、90min。从图4可以看出，在有电场驱动条件下，免疫反应的时间大大缩短。特别是所述双电场驱动模块呈现出比单电场模块更短的反应时间，这得益于反应体系中两个互补的电场环境加速了甲基对硫磷分子与抗体之间的反应速率。
48.实施例1：
49.以检测实际样品中的甲基对硫磷为例，一种双电场驱动传感器的制备方法和应用，包括以下步骤：
50.步骤一、柔性印刷基底的制作：利用计算机绘图软件设计电路形状；对柔性聚酰亚胺基板1进行裁剪(长：3cm，宽：1.5cm)；在柔性聚酰亚胺基板1的一端设置线路连接的5个导电孔2并标记为n1、n2、n3、n4、n5；在柔性聚酰亚胺基板1表面喷涂上一层均匀的厚度为15μm铜膜3；利用光刻技术将光致抗蚀剂线性酚醛树脂按照预先设计的电路形状涂覆在铜膜3上；将已涂覆光致抗蚀剂的柔性聚酰亚胺基板1放置紫外在灯下进行曝光；曝光后的柔性聚酰亚胺基板1利用0.1g/ml碳酸钠进行显影；显影后，未曝光区域被溶解，留下曝光区域形成铜箔线路4；将显影后的柔性聚酰亚胺基板1浸渍在2g/l氰化亚金钾(kau(cn)2)溶液中，利用电镀技术在相对导电孔2的另一端形成一个未闭合的厚度为0.5μm圆环金膜作为对电极5，对电极5圆环金膜开口的一端与导电孔n1电性连接；在对电极5的内部区域设有由十个圆形金膜组成的工作电极6，其呈三叉戟的形状，三叉戟的每条边分别有三个圆形金膜，剩下的一个圆形金膜在三条边的交汇处，每个金膜之间电性连接，金膜交汇处与导电孔n2之间电性连接；在对电极5未闭合圆环处的空白环形区域处涂覆厚度为0.4mm圆弧型ag/agcl浆料，放置在真空干燥箱80℃干燥30min后作为参比电极7，参比电极7与导电孔n3电性连接；此时
形成的对电极5、工作电极6、参比电极7称为三电极体系；在三电极体系所形成的区域上设有透明的中空塑料反应腔8，且三电极体系在中空塑料反应腔8的中空区域内，且与中空塑料反应腔8不接触；最终得到柔性印刷基底；
51.步骤二、双电场驱动模块的构建：在步骤一所制备的柔性印刷基底的三电极体系的背面电镀出两组独立的铜箔区，每个铜箔区域由10个独立的铜箔片9组成；每组铜箔区的面积分布可以通过相互焊接独立的铜箔片9来调整；两组铜箔区分别通过柔性聚酰亚胺基板1的导电孔2的n4、n5连接双通道信号发生器(edu33212a,美国keysight公司)提供偏置正弦电场，设定动态偏置电压为2v，峰间电压设置为5v；每个铜箔区被分配一组电场；在运行过程中开启双通道信号发生器，对该三电极体系反应腔8的中空区域提供一组互补的电场环境；
52.步骤三、工作电极的修饰：首先制备3mg/ml的氧化石墨烯(go)溶液；然后将10μlgo溶液滴加在反应腔8中的三电极体系表面，在电化学工作站进行电沉积5min，沉积后用蒸馏水冲洗工作电极6；其次制备2mm氯金酸(haucl4)溶液，将10μl haucl4溶液滴加在反应腔8中的三电极体系表面，在电化学工作站进行电沉积200s，沉积后用蒸馏水冲洗工作电极6；然后将20μl、0.6m硫酸(h2so4)滴加在反应腔8中的三电极体系表面对工作电极进行活化；活化后用蒸馏水冲洗工作电极6，冲洗后向反应腔8中的三电极体系表面滴加10μl、20μg/ml甲基对硫磷抗体进行孵育40min，甲基对硫磷抗体孵育完成后用蒸馏水冲洗工作电极6；冲洗后继续向反应腔8中的三电极体系表面滴加15μl、2％的牛血清蛋白(bsa)孵育30min、bsa孵育完成后用蒸馏水冲洗工作电极6；最终修饰完成得到双电场驱动传感器。
53.步骤四、建立电流/浓度(i/c)标准曲线：将一系列不同浓度的甲基对硫磷(0.01～550μg/l)滴加到所述的双电场驱动传感器的反应腔8中的三电极体系表面进行孵育1min，同时开启双通道电场发生装置；在电场力的作用下，甲基对硫磷分子在短时间内达到电极表面，被甲基对硫磷抗体快速捕获；将孵育完成的传感器用于dpv测试，产生电流峰值；根据对应的甲基对硫磷浓度和峰值大小建立标准曲线。图5为本发明所述甲基对硫磷测定的标准曲线图，所述i/c标准曲线为：i＝0.013c+0.303,r2＝0.993，检测范围为0.1～300μg/l。
54.步骤五、实际样品的检测：
55.(1)白菜样品的预处理：取25g白菜样品，用去离子水清洗后切碎；切碎后的样品加入50ml乙腈放置在超声环境中30min进行萃取；将上清液用滤纸过滤后加入100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度线；得到农药样品液。
56.(2)根据建立的i/c标准曲线计算出待测甲基对硫磷浓度：在双电场驱动条件下，滴加12μl农药样品液在反应腔8中的三电极体系表面孵育1min，随后进行dpv测试，在电化学窗口中产生一定的电流强度，根据建立的i/c标准曲线计算出待测甲基对硫磷浓度。
57.为了进一步验证本发明所述一种双电场驱动免疫传感器的准确度和灵敏度，将本发明的所述体系与标准高效液相色谱(hplc)进行对照。在进行hplc检测前，将待测液用0.45μm滤膜过滤。在dpv试验和hplc测定中，每个样品测量三次取平均值以减小随机误差。
58.结果如表1所示，本方法检测结果与hplc结果的误差在5.2％以内，表明所建立的方法适用于实际样品的检测，并具有较好的准确性。另外，本方法的双电场驱动模块检测时间极短(1min)，能够适用于实际样品的快速检测。
59.表1本方法检测白菜样品与标准方法检测结果对比
[0060][0061]
综上所述，本发明是首次使用电化学免疫传感器结合双电场驱动模块来检测农药残留的体系。自制的柔性印刷电极能够通过外部的设计形成特定的电路，且重量轻，可弯折，便于携带；在工作电极表面修饰的rgo和aunps有效的增加了传感器工作电极表面的导电性；农药抗体的引入使传感器在复杂的样品环境中表现出优良的选择性；农药孵育过程中引入互补的双电场有效的有效改善了吸附效率，加速免疫反应的进行。该双电场驱动电化学免疫传感器具有制作简单，灵敏度高，选择性强等优势，为自然环境，农产品等复杂样品中农药残留检测提供了新前景。
[0062]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。