1.本发明属于检测领域，涉及一种生物诊断试剂盒，具体涉及一种检测血液中总tau蛋白的化学发光试剂盒及其制备方法。
背景技术：
2.阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，ad）是一种不可逆的、起病隐袭的、进展性的疾病，临床表现为记忆障碍、失语、失用、失认、执行功能障碍以及人格和行为改变等。ad不但严重危险人类健康，也降低患者的生活质量，同时给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。
3.ad常以记忆和认知障碍起病，进行性加重并逐渐丧失执行功能，进而完全丧失生活自理能力，导致患者死亡。ad病程可长达20～30年，可以分为3个时期：1)在认知功能损害约10年之前的阶段称为临床前ad，这一时期患者没有明显的症状，不易察觉；2)轻度认知障碍(mild cognitive impairment，mci)，具有轻微的认知功能减退；3)ad痴呆期，多表现为记忆力的丧失与认知功能的损伤，而且这种损伤是不可逆的。因此，在临床前ad和mci期进行早期诊断预测患者ad发病风险，是确认早期干预窗口、降低ad发生率、延缓ad发生的根本手段。早期阿尔茨海默病是可干预的，但检测却相对困难。如果可以在发病早期，甚至症状发生前就检测出阿尔茨海默病，及时进行干预，将对阿尔茨海默病的治疗起到重要作用。因此，对于ad患者而言，早期筛查诊断和干预尤为重要。
4.iwg于2014年修订了新的iwg诊断标准，即iwg-2诊断标准，发表于《lancet neurology》杂志上，这是目前为止最新的ad诊断标准。iwg-2诊断标准首次将ad生物标志物分为诊断标志物和进展标志物。脑脊液β-淀粉样蛋白和tau、淀粉样蛋白正电子发射型计算机断层显像(positron emission tomography，pet)和ad致病基因携带为ad的诊断标志物，而脑结构磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)和2-脱氧-d-葡萄糖为ad的进展标志物。目前，临床检测手段主要是精神量表测试结合核磁共振扫描，鉴定结果准确性较高，但对临床前ad的敏感性不佳。
5.目前，对阿尔茨海默病的诊断主要根据临床症状并排除其他疾病。由于该病症状的非特异性、程度评价的主观性及心理学、脑电图、ct、mri非特异性等原因，阿尔茨海默病的诊断缺乏精确性，通常来说，较难实现早期诊断。正电子发射型计算机断层显像和检测脑脊液中的标志物，成为诊断ad常用的技术手段。脑脊液生物标志物是目前公认的ad标志物，但是取样操作复杂且具有侵入性，限制了生物标志物在早期ad诊断中的使用；而pet等检测价格昂贵，对医疗设备要求高，不适合用于大规模人群筛查。人在正常状态下，每天有约500ml的脑脊液（cerebro-spinal fluid，csf）吸收入血，因此血液可以间接地反应中枢神经系统的改变，并且相对于csf标本，血液标本更容易获得。因血样采集创伤很小、成本低、采集技术难度低，更适用于大规模的社区筛选。ad与其他痴呆的不同点在于ad患者脑组织中出纳在β-淀粉样蛋白斑块和神经原纤维（tau蛋白）缠结。
6.与ad相关的血液标志物有aβ1-40、aβ1-42、总tau蛋白和p-tau蛋白等，这些血液中
的生物标记物的准确检测可以为ad的早期诊断和人群筛查提供重要依据。
7.然而，现有技术中存在对ad的生物标记物检测的试剂盒，有以下问题：不适用与血液的检测，操作复杂，检测时间长，灵敏度低，线性范围窄，不能实现自动化和大批量样本连续测定，临床应用作用非常有限。
技术实现要素：
8.针对现有技术中的上述技术问题，本发明的目的提供一种检测血液中总tau蛋白的化学发光试剂盒及其制备方法，以解决现有技术中在血液中检测ad标志物的灵敏度不高和操作复杂、检测时间长和不能实现自动化检测等技术问题。
9.本发明的技术方案如下：本发明的一种检测血液中总tau蛋白的化学发光试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素包被磁微粒、生物素标记的总tau抗体、碱性磷酸酶标记的总tau抗体、总tau定标品；所述血液为血清或血浆；所述链霉亲和素包被磁微粒，所述磁微粒的平均粒径为0.5～3μm，浓度0.4～1.5mg/ml下装量为5～8ml，优选为7ml；所述生物素标记的总tau抗体为识别总tau蛋白的单抗，浓度0.5～5ug/ml下装量为16～24ml，优选为18ml；所述碱性磷酸酶标记的总tau抗体为识别总tau蛋白的单抗，浓度0.5～3ug/ml下装量为16～24ml，优选为18ml。
10.进一步的，所述总tau定标品为用定标品缓冲液将总tau抗原配制成一系列浓度；所述定标品缓冲液为浓度为0.02～0.2mol/l，ph值7.0～7.5的磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液），所述磷酸盐缓冲液中包括2wt%的牛血清白蛋白（bsa）、20wt%的丙三醇和0.1～0.2vol%的防腐剂，所述防腐剂优选为叠氮钠或proclin300。
11.本发明所述的检测血液中总tau蛋白的化学发光试剂盒的制备方法，包括以下步骤：s1，取链霉亲和素包被磁微粒，用r1缓冲液清洗磁微粒，再用r1缓冲液把链霉亲和素磁微粒稀释到0.4～1.5mg/ml，作为试剂r1；所述r1缓冲液是浓度为0.02～0.2mol/l，ph值7.0～7.5的三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲液、磷酸盐（pbs）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲液中的一种或两种，所述r1缓冲液中包括0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1～0.2vol%的防腐剂，所述防腐剂优选为叠氮钠或proclin300；s2，配制生物素溶液；将识别总tau蛋白的抗体的储存溶液置换成磷酸盐缓冲液，得到抗体溶液；在所述抗体溶液中加入所述生物素溶液，所述抗体与所述生物素的摩尔比为1:（10～40）；在室温下反应20～50min；反应结束后除去未反应的生物素，得到生物素标记的总tau抗体；再用r2缓冲液将其稀释到0.5～5ug/ml，作为试剂r2；所述r2缓冲液是浓度为0.02～0.2mol/l，ph值7.0～7.4的三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲液、磷酸盐（pbs）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲液中的一种，所述r2缓冲液中包括1wt%的牛血清白蛋白（bsa）、0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1～0.2vol%的防腐剂，所述防腐剂优选为叠氮钠或proclin300；s3，将识别总tau蛋白的抗体与活化剂1反应20～60min，二者的质量比为1：2～1：60，得到活化的总tau抗体；将质量比为1：2～1：100的碱性磷酸酶与活化剂2反应5～30min，
得到活化的碱性磷酸酶；把所述活化的总tau抗体和所述活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1:（0.5～2）混合，反应5～24h，得到碱性磷酸酶标记的总tau抗体，用r3缓冲液将其稀释到0.5～3ug/ml，作为试剂r3；所述活化剂1是2-亚氨基硫烷盐酸盐（2-it）、n-琥珀酰亚胺-s-乙酰巯基乙酸酯（sata）、2-巯基乙胺盐酸盐（2-mea）、三（2-羧乙基）膦（tcep）中的一种；所述活化剂2是4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（简称sulfo-smcc）、4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基-（乙二醇）n（简称sulfo(peg)n）、琥珀酰亚胺4-[n-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸盐（简称smcc）中的一种；所述r3缓冲液是浓度为0.02～0.2mol/l，ph值7.0～7.5的三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲液、磷酸盐（pbs）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲液中的一种，所述r3缓冲液中包括0.01mol/l的氯化镁、0.1mmol/l的氯化锌、10wt%的牛血清、0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1～0.2vol%的防腐剂，所述防腐剂优选为叠氮钠或proclin300；s4，将所述试剂r1、试剂r2和试剂r3经过分装、封口和包装，即可得到所述化学发光试剂盒。
[0012]
与现有技术相比，本发明的试剂盒具有反应时间短、操作方便、自动化程度高、灵敏度高、线性范围宽等优点。
附图说明
[0013]
图1为实施例2得到的总tau的标准曲线图。
[0014]
图2为实施例2得到的总tau酶联免疫检测方法测定结果的标准曲线图。
[0015]
图3为实施例3得到的血清中ad组和正常人组总tau的箱式图。
[0016]
图4为实施例4得到的总tau的标准曲线图。
具体实施方式
[0017]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0018]
实施例1检测血液中总tau蛋白的化学发光试剂盒，按照以下步骤制备：（1）链霉亲和素包被磁微粒的制备：取链霉亲和素包被磁微粒，磁微粒的平均粒径为2.1μm，用浓度为0.1mol/l、ph值7.4的r1缓冲液清洗磁微粒，该r1缓冲液中含有0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1vol%的叠氮钠的三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲液；再用r1缓冲液把链霉亲和素磁微粒稀释到1.5mg/ml，作为试剂r1；（2）生物素标记的总tau抗体的制备：配制0.01mol/l的生物素溶液；将识别总tau蛋白的一个位点的抗体储存溶液置换成磷酸盐缓冲液，得到抗体溶液；在所述抗体溶液中加入所述生物素溶液，所述抗体与所述生物素的摩尔比为1:10；在室温下反应60min；反应结束后，采用脱盐柱除去未反应的生物素，得到生物素标记的总tau抗体；测试蛋白浓度，再用r2稀释液缓冲液将其稀释到5ug/ml，
作为试剂r2；该r2稀释液是浓度为0.1mol/l、ph值7.4的三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲液，含有1wt%的牛血清白蛋白、0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1vol%的叠氮钠；（3）碱性磷酸酶标记总tau抗体的制备：将识别总tau蛋白一个位点的抗体与活化剂1（2-亚氨基硫烷盐酸盐）置于室温条件下反应20min，二者的质量比为1：10，引入巯基得到活化的总tau抗体；将质量比为1:10的碱性磷酸酶与活化剂2（sulfo-smcc）置于室温条件下反应30min，引入马来酰亚胺基团得到活化的碱性磷酸酶；把所述活化的总tau抗体和所述活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1：0.5混合，置于室温条件下反应5h，得到碱性磷酸酶标记的总tau抗体，用r3缓冲液将其稀释到3ug/ml，作为试剂r3；该r3缓冲液是浓度为0.1mol/l、ph值7.4的三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲液，含有0.01mol/l的氯化镁、0.1mmol/l的氯化锌、10wt%的牛血清、0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1vol%的叠氮钠；（4）总tau定标品的制备：把总tau抗原用定标品稀释液稀释成梯度浓度为s1(0pg/ml)、s2(10pg/ml)、s3(40pg/ml)、s4(160pg/ml)、s5(640pg/ml)、s6(1000pg/ml)、s7(2000pg/ml)、s8(4000pg/ml)；分装，放在-70
°
c下保存；该定标品稀释液0.1mol/l、ph值7.4的磷酸盐缓冲液，含有2wt%的牛血清白蛋白、20wt%的丙三醇和0.1vol%的叠氮钠；（5）将所述试剂r1、试剂r2和试剂r3经过分装、封口和包装，即可得到所述化学发光试剂盒。
[0019]
实施例21、采用本发明的化学发光试剂盒的检测过程为：以全自动化学发光分析仪为检测工具，方法学模式为夹心法，即仪器依次加入50ul血液样品、50ul试剂r2（生物素标记的总tau抗体和r2稀释液），30ul试剂r1（链霉亲和素包被磁微粒和r1稀释液）和50ul试剂r3（碱性磷酸酶标记总tau抗体和r3稀释液），反应30min，磁分离清洗后，加入200ul底物，记录发光强度，测试总tau定标品，用发光值作为纵坐标，总tau浓度作为横坐标，绘制出标准曲线（见图1），由图1中可得到本发明的线性范围为10～4000pg/ml。
[0020]
2、对照试剂为酶联免疫测定试剂盒，其检测步骤为：按照酶联免疫测定试剂盒操作步骤，加入50ul标准品（酶联免疫测定试剂盒提供的测试样品），标准品浓度为s1(0pg/ml)、s2(31.25pg/ml)、s3(62.5pg/ml)、s4(125pg/ml)、s5(250pg/ml)，s6(500pg/ml)、s7(1000pg/ml)、s8(2000pg/ml)；再加入50ul总tau检测抗体，在4
°
c下反应1h；清洗，加入100ul抗兔igg-hrp反应30min；清洗，加入100ul底物液，反应30min，再加入100ul终止液（酶联免疫测定试剂盒提供的），检测吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度值为横坐标，结果见图2，由图2中可得到酶联免疫试剂的线性范围为31.25～2000pg/ml。
[0021]
对比图1和图2，可以明显得到看出本发明的化学发光试剂盒的灵敏度明显高于酶联免疫测定试剂盒，线性范围明显宽于酶联免疫测定试剂盒，且为自动化操作，反应时间短。
[0022]
实施例3
ad组和正常人血液中总tau检测方法：仪器依次加入50ul血液样品、50ul试剂r2（生物素标记的总tau抗体和r2稀释液），30ul试剂r1（链霉亲和素包被磁微粒和r1稀释液）和50ul试剂r3（碱性磷酸酶标记总tau抗体和r3稀释液），反应30min，磁分离清洗后，加入200ul底物，记录发光强度，测试总tau定标品，用发光值作为纵坐标，总tau浓度作为横坐标，绘制出标准曲线；测试14例ad血清样本和12例正常人血清样本，利用标准曲线计算出被测样本的总tau浓度，比较ad组和正常组结果的差别（见图3）。
[0023]
结果显示，血清中ad组总tau的浓度与正常人组有明显差异，ad组的总tau的浓度高于正常人组。实施例3体现了本发明可以测试出ad和正常人血液中的总tau蛋白的浓度，且体现了差异，可见本试剂盒适用于检测血液中的总tau蛋白浓度，这是现有方法中没有的。
[0024]
实施例4检测血液中总tau蛋白的化学发光试剂盒，按照以下步骤制备：（1）链霉亲和素包被磁微粒的制备：取链霉亲和素包被磁微粒，磁微粒的平均粒径为0.85μm，用浓度为0.1mol/l、ph值7.5的r1缓冲液清洗磁微粒，该r1缓冲液中含有0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1vol%的叠氮钠的三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲液；再用r1缓冲液把链霉亲和素磁微粒稀释到0.4mg/ml，作为试剂r1；（2）生物素标记的总tau抗体的制备：配制0.01mol/l的生物素溶液；将识别总tau蛋白的一个位点的抗体储存溶液置换成磷酸盐缓冲液，得到抗体溶液；在所述抗体溶液中加入所述生物素溶液，所述抗体与所述生物素的摩尔比为1:40；在室温下反应20min；反应结束后，采用脱盐柱除去未反应的生物素，得到生物素标记的总tau抗体；测试蛋白浓度，再用r2稀释液缓冲液将其稀释到0.5ug/ml，作为试剂r2；该r2稀释液是浓度为0.1mol/l、ph值7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲液，含有1wt%的牛血清白蛋白、0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1vol%的叠氮钠；（3）碱性磷酸酶标记总tau抗体的制备：将识别总tau蛋白一个位点的抗体与活化剂1（n-琥珀酰亚胺-s-乙酰巯基乙酸酯）置于室温条件下反应50min，二者的质量比为1：60，引入巯基得到活化的总tau抗体；将质量比为1：100的碱性磷酸酶与活化剂2（sulfo-smcc）置于室温条件下反应10min，引入马来酰亚胺基团得到活化的碱性磷酸酶；把所述活化的总tau抗体和所述活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1：2混合，置于室温条件下反应24h，得到碱性磷酸酶标记的总tau抗体，用r3缓冲液将其稀释到0.5ug/ml，作为试剂r3；该r3缓冲液是浓度为0.1mol/l、ph值7.5的磷酸盐缓冲液，含有0.01mol/l的氯化镁、0.1mmol/l的氯化锌、10wt%的牛血清、0.5wt%的明胶、0.1wt%的表面活性剂和0.1vol%的叠氮钠；（4）总tau定标品的制备：把总tau抗原用定标品稀释液稀释成梯度浓度为s1(0pg/ml)、s2(10pg/ml)、s3(40pg/ml)、s4(160pg/ml)、s5(640pg/ml)、s6(1000pg/ml)、s7(2000pg/ml)、s8(4000pg/
ml)；分装，放在-30
°
c下保存；该定标品稀释液0.1mol/l、ph值7.4的磷酸盐缓冲液，含有2wt%的牛血清白蛋白、20wt%的丙三醇和0.1vol%的叠氮钠；（5）将所述试剂r1、试剂r2和试剂r3经过分装、封口和包装，即可得到所述化学发光试剂盒。
[0025]
以全自动化学发光分析仪为检测工具，方法学模式为夹心法，即仪器依次加入50ul血液样品、50ul试剂r2（生物素标记的总tau抗体和r2稀释液），30ul试剂r1（链霉亲和素包被磁微粒和r1稀释液）和50ul试剂r3（碱性磷酸酶标记总tau抗体和r3稀释液），反应30min，磁分离清洗后，加入200ul底物，记录发光强度，测试总tau定标品，用发光值作为纵坐标，总tau浓度作为横坐标，绘制出标准曲线（见图4），由图1中可得到本发明的线性范围为10～4000pg/ml。
[0026]
由图1和图4可以看出，本发明的试剂盒灵敏度高、线性范围宽，自动化程度高，操作方便程度和反应时间都好于现有方法。