一种非诊断目的的循环信号放大光电化学检测合胞病毒RNA的方法

一种非诊断目的的循环信号放大光电化学检测合胞病毒rna的方法
技术领域
1.本发明属于分析化学、海洋监测和医学领域，具体涉及一种非诊断目的的循环信号放大光电化学检测合胞病毒rna的方法。


背景技术：

2.呼吸道合胞病毒是副病毒科肺炎病毒属的一员，是引起儿童和老年人呼吸道感染的最主要的病毒病原体之一。它是一种rna病毒，其传播途径是空气飞沫传播和密切接触传播，潜伏期在三到七天，呼吸道合胞病毒感染导致了广泛的临床表现，例如：中耳炎、轻度上呼吸道感染以及潜在致命的下呼吸道疾病。
3.越来越多的具有表面积大特征的二维材料被用作纳米贵金属的支撑材料，以提高纳米复合材料的导电性、生物相容性和催化能力。然而一些二维材料，如石墨烯和二硫化钼等，仍然有明显的缺点，包括：由于界面稳定而难以功能化；活性位点易于丢失。碳化钛mxene具有表面积大的纳米结构，具有优异的电子转移能力，催化能力和生物相容性等。该纳米材料独特的性质使得其具备在生物传感方面的应用潜能。在多种光敏材料中，具备层状结构的过渡金属二硫化物由于其优异的力学，物理学以及化学性能也受到很大的期待。尤其是稳定的半导体材料二硒化钨，它具有存在可调谐的带隙，载流子迁移率高和体积小等优点，在光照条件下表现出了优异的性能，二硒化钨也是一种很具前景的传感材料。应用这些新型纳米材料可以提高光致电化学响应信号，从而提高光致电化学分析测定的灵敏度。到目前为止，呼吸道合胞病毒还没有广泛使用的商业疫苗，利巴韦林和帕利维祖单抗是治疗逆转录病毒感染的唯一选择，但并不完全有效。因此，一种快速和敏感的诊断方法对呼吸道合胞病毒感染的诊断和治疗至关重要。因此，该发明提供了一种非诊断目的的循环信号放大光电化学检测合胞病毒rna的方法，方法具有灵敏度高，选择性好，应用前景广阔等特点。


技术实现要素：

4.本发明旨在发明一种非诊断目的的循环信号放大光电化学检测合胞病毒rna的方法。实现本发明目的技术方案是：首先，通过用多层碳化钛纳米片（ti3c2）以及二硒化钨纳米片（wse2）修饰碳糊电极（cpe），然后将金纳米粒子的分散液滴落在修饰电极上，待成膜后，所形成的电极通过金硫键修饰前引物。呼吸道合胞病毒核酸（rsv rna）用作目标物样品溶液，然后通过原位重组酶聚合酶扩增（rpa）。rpa的产物链接有生物素，进而与链霉亲和素碱性磷酸酶（sa-alp）结合。碱性磷酸酶alp催化磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/l磷酸氢钠-磷酸二氢钠）中的对氨基苯基磷酸单钠（4-app）的水解反应，生成电子供体对氨基苯酚（4-ap）。由于4-ap与磷酸盐缓冲溶液中的方酸（sqa）以及三(2-羧乙基)膦（tcep）的氧化还原作用，使得溶液中的电子不断增加，进而使得pec信号增强，随着合胞病毒rna浓度的增加，更多的sa-alp连接到电极上。基于
alp的酶催化，电子的不断产生增强了光电流响应。基于rpa与双氧化还原循环放大技术的策略，建立了光电流响应与合胞病毒rna浓度之间的关系，方法具有灵敏度高，选择性好，应用前景广阔等特点。这种基于双氧化还原循环放大技术结合原位重组酶聚合酶扩增为pec分析方法发展开辟了新的道路。提供一种非诊断目的的循环信号放大光电化学检测合胞病毒rna的方法。
5.本发明是通过以下措施来实现的：一种非诊断目的的循环信号放大光电化学检测合胞病毒rna的方法，其特征是包括以下步骤：（1）金纳米粒子的合成；（2）碳化钛的制备与剥离；（3）多层碳化钛纳米片的制备；（4）二硒化钨纳米片的制备；（5）合胞病毒rna的提取、纯化；（6）合胞病毒rna的测定；（7）氧化还原循环放大技术的可行性；（8）光致电化学（pec）信号测试。
6.优选的，所述的金纳米粒子的合成包括以下步骤：首先，室温下在18 ml超纯水中加入0.5 ml的100 mmol/l氯金酸；然后，加入0.5 ml的100 mmol/l的柠檬酸钠，持续搅拌5分钟，接着迅速加入0.85 ml的0.1 mol/l的硼氢化钠，直至溶液颜色由橘黄色变为橙红色后，停止反应，即可获得平均粒径为4~10 nm的金纳米粒子。盛在棕色容器于4 ℃冰箱中保存。
7.优选的，所述的碳化钛的制备与剥离包括以下步骤：称取氟化锂1.6 g，缓慢加入到盛有20 ml浓度为9 mol/l的盐酸中，搅拌5分钟后，缓慢在10分钟内加入0.1g~10 g max钛碳化铝（ti3alc2），然后在45 ℃条件下搅拌2小时~64小时。待上述反应完成后离心沉淀，用去离子水洗涤沉淀，离心的转速保持在3500 r/min，每次离心5分钟，离心6~8次，并使得上清液的ph大于6即可。收集沉淀，得到碳化钛。
8.优选的，所述的多层碳化钛纳米片的制备包括以下步骤：将上述收集的沉淀碳化钛溶于1 ml~1000 ml的去离子水中，在氩气保护的氛围下，超声0.2小时~30小时，最后以3500 r/min的转速离心0.1小时~10小时，收集上清液，得到含多层碳化钛纳米片ti3c2的溶液。
9.优选的，所述的二硒化钨纳米片的制备包括以下步骤：将10 mg~7500 mg二硒化钨粉末与1,2-二氯苯（dcb）混合制备得到初始分散液，在冰水浴中超声剥离0.1小时~10小时，在5000 r/min的转速下离心30分钟。弃掉沉淀，收集上清液，将上清液用氯仿多次循环洗涤离心，去除溶液中的dcb，最后将收集到的沉淀分散在n,n-二甲基甲酰胺dmf中，得到二硒化钨纳米片，待用。
10.优选的，所述的合胞病毒rna的提取、纯化包括以下步骤：使用tianamp病毒dna/rna试剂盒（杭州荣耀科学有限公司，杭州，中国）提取合胞病毒rna，并转录出dna，制备含目标dna的样品溶液。
11.优选的，所述的合胞病毒rna的测定包括以下步骤：根据twistamp basic rt试剂盒，设计引物序列。得到最优的一对前后引物，引物
由生工生物工程上海股份有限公司（上海，中国）合成。
12.前引物序列为：5
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sh
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atacactatt caacgtagta caggaga-3’；后引物序列为：5
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biotin
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tgaatttatg atttgcatct tcagtgatt-3’；目标dna序列为：5
’‑
caggattaat aggtatgcta tatgctatgt ccagattagg aagggaagac actataaaga tacttaaaga tgctggatat catgttaaag ctaatggagt agatataaca acatatcgtc aagatataaa tggaaaggaa atgaaattcg aagtattaac attatcaagc ttgacatcag aaatacaagt caatattgag ata-3’。
13.将制得的多层碳化钛纳米片与二硒化钨纳米片混合，超声1小时~8小时后得到复合材料的wse2/ti3c2混合液，然后取其1
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l~45
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l滴于碳糊电极表面，待干后得到修饰电极wse2/ti3c2/cpe，随后将金纳米粒子滴在修饰电极表面，得到aunps/wse2/ti3c2/cpe。通过金硫键的方式连接带有巯基基团的前引物序列。将巯基化的前引物（1
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l~45
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l，0.001
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mol/l~1
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mol/l）滴到工作电极表面上，孵育2小时~64小时。之后，通过用磷酸盐缓冲液（ph为7.0）洗涤3次来去除未结合的前引物。然后，将mch（1
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l~45
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l，0.001 mmol/l~10 mmol/l）滴加到材料与引物修饰的工作电极上，孵育24小时，得前引物修饰的aunps/wse2/ti3c2/cpe。然后，配置扩增溶液：向0.2 ml twistamp反应管中加入29.5 μl rehydration buffer、体积为1
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l~24
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l浓度为0.001
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mol/l~100
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mol/l的后引物、13.2
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l不含dnase的二次蒸馏水，最后再加入1
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l~25
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l 280 mmol/l醋酸镁溶液。取上述扩增溶液1
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l~20
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l、含目标dna的样品溶液1 μl~25 μl混合，然后滴于前引物修饰的aunps/wse2/ti3c2/cpe电极表面。在37 ℃下固相等温扩增30分钟。扩增完后得到末端带有生物素（biotin）的dna双链修饰的工作电极；再将电极插入sa-alp溶液中，反应0.2小时~4小时后以磷酸缓冲溶液冲洗电极3次。由于biotin与sa-alp的作用而将alp连接在电极上。
14.将所得电极插入含有对氨基苯基磷酸单钠（4-app）、方酸（sqa）和三(2-羧乙基)膦（tcep）的磷酸盐缓冲溶液中，进行pec测定，根据pec信号强度实现合胞病毒rna含量的测定。
15.优选的，所述的氧化还原循环放大技术的可行性包括以下步骤：为了研究双氧化还原循环放大技术的可行性，分别在含有4-ap、tcep和sqa的磷酸盐缓冲溶液中，对aunps/wse2/ti3c2修饰的碳糊电极进行了pec检测。
16.优选的，所述的光致电化学测试包括以下步骤：实验是在25 ℃条件下进行的，以10 w led灯作为激发光，每隔10秒钟开关灯一次，pec信号是由chi仪器与光源系统耦合收集，其中施加偏压为0.2 v，在含有tcep和sqa以及对氨基苯基磷酸单钠的溶液中进行测试，获得i-t曲线进行数据的收集和定量分析。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）aunps/wse2/ti3c2修饰电极的光致电化学信号强于单独的wse2或ti3c2修饰电极。最佳实验偏压为0.2 v，wse2/ti3c2混合液体积最优体积为15
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l；（2）随着合胞病毒rna浓度从0.2 fmol/l增加到80 fmol/l，pec响应相应持续增加。光电流响应与合胞病毒rna浓度的对数值之间存在良好的线性关系。方法具备优异的检测分析性能，较宽的检测范围以及较低的检测限。
附图说明
18.图1 方法的分析特性。光电流随浓度变化情况（a）；光电流与浓度对数关系（b）。
19.图2 重复性、储存稳定性、选择性。方法测定合胞病毒rna的重复性，合胞病毒rna浓度为80.0 fmol/l（a）；修饰电极在储存一个月后在周期性关-开-关光下5个周期的基于时间的光电流响应，即长期存储稳定性（b）；方法的选择性，从上到下依次为：人超肺病毒（hmpv）、人鼻病毒（rv）、腺病毒（adv）和甲型流感病毒（flu-a）与rsv的混合溶液（干扰物质浓度为10.0 fmol/l，rsv浓度为1.0 fmol/l）；rsv；人超肺病毒；人鼻病毒；腺病毒和甲型流感病毒（c）。
20.图3 材料的形貌表征。wse2的tem(a)。ti3alc2的sem (b)，ti3c2和wse2/ti3c2的sem (c)。
21.图4 电极的pec响应性能。不同电极在磷酸盐缓冲溶液中的pec响应：cpe，wse2/cpe，ti3c2/cpe，wse2/ti3c2/cpe，aunps/wse2/ti3c2/cpe（对应曲线顺序为由下到上）（a）；aunps/wse2/ti3c2/cpe在含有不同小分子的磷酸盐缓冲溶液中的pec响应（从右到左分别为tcep/sqa/4-ap，sqa/4-ap，tcep/4-ap，tcep/sqa，4-ap，sqa，tcep，磷酸盐缓冲溶液）（b）。
具体实施方式
22.下面的实例将进一步说明本发明的操作方法，但不构成对发明的进一步限制。
23.实例1：分析特性粉末二硒化钨（wse2）购自百灵威科技有限公司（北京，中国）。max（ti3alc2）是从科学指南针费曼纳米获得的。（浙江，中国）。氯金酸（haucl4•
4h2o）从上海试剂有限公司（上海，中国）订购。6-巯基己醇（mch）是从生工生物工程上海股份有限公司订购的（上海，中国）订购的。4-氨基苯基磷酸酯单钠（4-app）从上海惠诚生物科技有限公司（上海，中国）获得。链霉亲和素结合碱性磷酸酯酶（sa-alp）、4-氨基苯酚（4-ap）、n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、方酸（sqa）和三(2-羧乙基)膦（tcep）以及所有其他试剂均从阿拉丁（上海，中国）获得。通过将0.2摩尔每升nah2po4和0.2摩尔每升nahpo4含0.1摩尔每升氯化钾的储备溶液混合来制备磷酸盐缓冲溶液。引物是由生工生物工程上海股份有限公司合成的。化学试剂为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用。所有水溶液均使用aquapro ultrapure水系统（重庆颐洋企业发展有限公司）（重庆，中国）中的超纯水制备。
24.使用chi和10 w led的检测系统进行pec测量，其中使用10 w led灯作为光源。在chi电化学工作站上测量光电流。使用cpe或修饰cpe作为工作电极，使用饱和甘汞电极（sce）作为参比电极，并使用铂丝作为对电极。通过电化学阻抗谱（eis）在含有0.1 mol/l kcl的5.0 mmol/l [fe(cn)6]
3-/4-溶液中，在直流电为0.2 v的情况下进行电化学表征。通过透射电子显微镜（tem，jem-2100，usa）和扫描电子显微镜（sem，jem-2100，usa）观察wse2/ti3c2和aunps结构特征。
[0025]
增强光致电化学信号未：在含有sqa和tcep的磷酸盐缓冲溶液中，tcep将sqa还原为环丁烷辛醇cbo。然后通过4-ap将产生的cbo逐步氧化为cbt，4-ap被氧化而提供电子生成4-醌亚胺4-qi。tcep再次将生成的环丁酮cbt还原为cbo。该催化循环允许电子连续地供应至溶液，从而导致光电流响应的放大。aunps吸收可见光，并且可以将电子转移到wse2的cb。此外，ti3c2的ef低于wse2的cb，因此这种能级结构更便于电子的转移。最后，电子被转移到
cpe表面以产生光电流信号，产生增强的光致电化学信号。
[0026]
配置0.2 fmol/l到80 fmol/l浓度依次增加的目标rna溶液，按技术方案测定光致电化学信号，根据光致电化学信号得标准曲线。本发明研究了不同浓度的目标rna与光致电化学信号之间的关系，如图1所示。得到目标rna的标准曲线，线性范围及线性方程。当目标rna的浓度在0.2 fmol/l到80 fmol/l时，随着目标rna浓度的变化，其光致电化学信号与浓度成良好的线性关系，i = 0.7730 log c（fmol/l）+ 6.932（r2=0.9964），其中i、c和r代表pec响应、合胞病毒rna的浓度和相关系数，检测限为0.01 fmol/l。该方法具备优异的检测分析性能，较宽的检测范围以及较低的检测限。
[0027]
实例2：重复性、储存稳定性、选择性以合胞病毒rna浓度为80.0 fmol/l时，考察了方法的重复性，如图2a所示。
[0028]
通过对浓度为80.0 fmol/l的合胞病毒rna每六天测量一次，考察了修饰电极的长期储存稳定性。储存30天后，对修饰电极进行连续五个周期的监控，光电流响应表明没有明显变化。因此，修饰电极表现出优异的稳定性，如图2b所示。
[0029]
通过测试干扰物质（甲型流感病毒rna（flu-a），腺病毒rna（adv），人鼻病毒rna（rv）和人的超肺病毒rna（hmpv））的信号响应，来考察pec方法的选择性。将1.0 fmol/l 合胞病毒rna作为检测样品进行测试时，记录到了显着提高的光电流响应，干扰物质和空白测试的光电流响应相当，表明方法具有好的选择性。当10.0 fmol/l干扰物质与1.0 fmol/l 合胞病毒rna混合时，与单独的合胞病毒rna相比，其光电流响应没有显著变化。表明，pec方法对合胞病毒rna分析显示出极好的选择性，如图2c所示。
[0030]
实例3：材料的形貌表征tem表征了wse2和aunps的形貌。如图3所示，wse2呈现不规则的六边形形状，并且在剥离后，wse2变得越来越薄。aunps具有良好的均匀球形形状，尺寸范围为6~10 nm。ti3alc2呈现出具有光滑表面的块状形态。ti3alc2的侧面如图3c所示，但层状结构并不明显。在氟化锂与盐酸蚀刻max后，使得块状ti3alc2转变为典型的器官状结构，al层被剥离去除后得到图中风琴状形貌，该外观表明已成功制备了ti3c2。
[0031]
实例4：材料的pec性能表征研究了修饰电极的基本特性。在磷酸盐缓冲液中检测到该过程。如图4a所示，wse2的光电流响应为111.4 na，ti3c2的光电流响应为211.1 na。但是，当wse2和ti3c2结合在一起时，光电流响应会显着增强（425.6 na）。添加aunps可以稍微改善光电流响应（512.7 na）。aunps可能会增加电极的电导率。
[0032]
然后，评估wse2/ti3c2/aunps/cpe在不同磷酸盐缓冲液中的pec性能（图4b）。tcep、sqa、4-ap的光电流响应分别为1510 na，1644 na和2242 na。可以看出，这些分子均可以或多或少增强光电流响应。这三种物质很容易被修饰电极材料的的光生空穴氧化并抑制电子-空穴对的重组。对于tcep/sqa系统，与单独的tcep或sqa的光电流响应没有显着差异。对于tcep/4-ap系统，4-ap很容易被氧化进而提供电子生成4-醌亚胺（4-qi），由于4-qi又可被tcep还原生成4-ap，导致光电流响应比单独的tcep或4-ap的响应高得多。并且光电流响应为3155 na。类似地，sqa/4-ap的信号增强是由于sqa，环丁酮（cbt）和4-ap之间的反应使cbo再生而引起的，光电流响应达到2882 na。但是，在tcep/sqa/4-ap系统中观察到最高光电流（11180 na）。这些结果清楚地表明，tcep、sqa和4-ap的共存对wse2/ti3c2/aunps/cpe的响应
有极好的影响。tcep/sqa/4-ap系统具有提高生物分析灵敏度的巨大潜力。
[0033]
实例5：样品检测为了研究该方法的实际检测性能，通过加标回收的方法对其进行了测试，首先收集健康人鼻咽部位吸取液，制备成溶液并将浓度分别配置为1.0 fmol/l、3.0 fmol/l、5.0 fmol/l、7.0 fmol/l的合胞病毒rna加入到该溶液中，通过tianamp病毒dna/rna试剂盒提取溶液中的合胞病毒rna，进行pec信号测试，结果如表1所示。
[0034]
实例6：海岸带样本测定为了研究该方法的实际检测性能，通过加标回收的方法对其进行了测试，首先收集海岸带的海水（1、2号样品）、污水（3、4号样品）、土壤（5、6号样品）样本，制备成溶液并将浓度配置为10.0 fmol/l的合胞病毒rna加入到该溶液中，通过tianamp病毒dna/rna试剂盒提取溶液中的合胞病毒rna，进行pec信号测试，结果如表2所示。对海岸带的海水、污水、土壤样本中含量测定，结果显示该方法适用于海岸带样本中合胞病毒测定。