一种皮质醇检测试纸及其制备方法与流程

1.本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种皮质醇检测试纸及其制备方法。


背景技术：

2.现在一般使用酶联免疫法试剂测定动物皮质醇。酶联免疫法试剂存在以下缺点：对皮质醇测定工作环境要求高，孵育时间较长且步骤复杂，并需要借助恒温箱等，整个过程耗时长，需要十几小时。需要专业人员操作，检验需要电脑和专门仪器设备，测定成本高。


技术实现要素：

3.鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种皮质醇检测试纸及其制备方法，具有准确性好、检验时间短、操作简单、只需一步简单操作、不受人员场地等限制、非专业人员可操作、有便携式小仪器、可在非实验室地点操作等优点。
4.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
5.本发明提供一种皮质醇检测试纸，包括：硝酸纤维膜和与硝酸纤维膜连接的标记垫；硝酸纤维膜设置有c线、t线；采用独立c线体系，c线包被羊抗兔抗体，t线包被皮质醇抗原；标记垫喷涂有抗体微球偶联液，所述抗体微球偶联液为偶联皮质醇标记抗体、兔igg抗体的微球偶联液。
6.采用上述技术方案有益效果包括：
7.采用上述抗体，可以不受t线位置捕获抗原的竞争影响，采用了独立c线体系，可以使数据更具有真实性而，因为最终模拟曲线是样品浓度和t/c值，如果是常规c线，采用的是标记抗体的二抗，如果样品含目标检测物的浓度很低，那么t线的抗原就会竞争结合更多的标记偶联物，这样流过c线的偶联物就更少，那么进一步导致t/c值更加的拉大而不准确；而采用t/c这种方法，原因是往往个体不同的样品因为基质导致反应强度的变化，含有同样浓度目标检测物的两个不同个体的样本可能测出差距较大的t线吸光度值，同时c线吸光度值相应升高或降低，这时加入t/c算法能屏蔽掉样本误差，从而使检测结果更准确。
8.本发明提供的检测试纸检验时间短，一般完成检测只需要30min，且检验步骤非常简单，只需一步操作，非专业人员可操作。可以采用便携式小仪器，可在非实验室地点操作。
9.进一步，皮质醇抗原的使用浓度为1.5mg/ml，皮质醇标记抗体的使用浓度为0.5mg/ml，羊抗兔抗体的使用浓度为1.5mg/ml，兔igg抗体的使用浓度为1mg/ml。
10.采用上述技术方案有益效果包括：质醇抗原配液浓度稀释为1.5mg/ml，该浓度是结果梯度筛选出来的最佳浓度，nc膜的包被质醇抗原配液浓度上限一般在3ng/ml左右，超过此浓度将无法固定在膜上，很容易造成假阳性，在竞争法中包被浓度高会导致样本竞争不过t线抗原，灵敏度会降低，包被量过低免疫反应强度也会偏低，检测范围小。
11.进一步，还包括吸水滤纸、读数窗口、样品垫和支撑物；支撑物位于吸水滤纸、硝酸纤维素膜、标记垫、样品垫的下方；
12.吸水滤纸的一端与硝酸纤维素膜的一端连接，硝酸纤维素膜的另一端与标记垫的
一端连接，标记垫的另一端与样品垫的一端连接；
13.硝酸纤维素膜设有质控区和检测区，在质控区和检测区处开设有读数窗口，通过读数窗口可以观察位于质控区的c线和位于检测区的t线，在样品垫处开设有加样孔。
14.标记垫和样品垫的材质都可以采用玻璃纤维，有利于偶联混合物释放。
15.本发明还提供一种皮质醇检测试纸卡，包括上述皮质醇检测试纸。
16.采用上述技术方案有益效果包括：具有准确性好、检验时间短、操作简单、只需一步简单操作、不受人员场地等限制、非专业人员可操作、有便携式小仪器、可在非实验室地点操作、适用于哺乳动物等优点。
17.本发明还提供一种皮质醇检测试剂盒，包括上述皮质醇检测试纸卡。
18.采用上述技术方案有益效果包括：具有准确性好、检验时间短、操作简单、只需一步简单操作、不受人员场地等限制、非专业人员可操作、有便携式小仪器、可在非实验室地点操作等优点。
19.本发明提供一种皮质醇检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
20.(1)制备抗体微球偶联液，并将抗体微球偶联液喷涂在标记垫；所述抗体微球偶联液为偶联皮质醇标记抗体、兔igg抗体的微球偶联液；
21.(2)在t线的位置包被皮质醇抗原，在c线的位置包被羊抗兔抗体。
22.采用上述技术方案有益效果包括：具有准确性好、检验时间短、操作简单、只需一步简单操作、不受人员场地等限制、非专业人员可操作、有便携式小仪器、可在非实验室地点操作等优点。
23.进一步，步骤(1)包括以下步骤：
24.①
将微球清洗后，使用nhs和edc的混合溶液活化，离心，收集沉淀液；
25.②
使用偶联液将沉淀液与皮质醇抗体偶联，得到皮质醇抗体偶联液；使用偶联液将沉淀液兔igg抗体偶联，得到兔igg抗体偶联液；
26.③
终止反应，封闭，将皮质醇抗体偶联液、兔igg抗体偶联液分别复溶；
27.④
将皮质醇抗体偶联液与兔igg抗体偶联液混合，得到混合液，将混合液喷涂在标记垫，干燥。
28.采用上述技术方案有益效果包括：
29.进一步，步骤
①
中，nhs和edc的混合溶液中，nhs和edc的质量比为1:1。
30.采用上述技术方案有益效果包括：采用上述方法可以达到最佳试验效果。
31.进一步，使用偶联液将沉淀液与皮质醇抗体偶联，偶联液与皮质醇抗体的体积质量比为100μl：5μg。
32.采用上述技术方案有益效果包括：采用上述方法可以达到最佳试验效果。
33.进一步，使用偶联液将沉淀液兔igg抗体偶联，偶联液与兔igg抗体的体积质量比为100μl：10μg。
34.采用上述技术方案有益效果包括：采用上述方法可以达到最佳试验效果。
35.进一步，步骤
④
中，皮质醇抗体偶联液与兔igg抗体偶联液的体积比为200:24；喷涂的条件为3μl/cm；干燥的条件为37℃烘干2h。
36.采用上述技术方案有益效果包括：采用37℃烘箱烘干2h，此烘干条件能够在不破坏包被抗原的情况下让抗原稳定固定在nc膜上。
37.进一步，步骤(2)中，皮质醇抗原的使用浓度为1.5mg/ml，羊抗兔抗体的使用浓度为1.5mg/ml，
38.将皮质醇抗原划涂在硝酸纤维素膜形成t线、c线的划涂量为0.8μl/cm；
39.划涂后，37℃烘箱烘干2h。
40.采用上述技术方案有益效果包括：采用上述浓度，试验效果更好，可以避免假阳性、灵敏度会降低、检测范围小等问题。
41.采用37℃烘箱烘干2h，此烘干条件能够在不破坏包被抗原的情况下让抗原稳定固定在nc膜上。
42.进一步，样品垫和标记垫都可以经过预处理，标记垫处理后更有利于承载和释放偶联混合物。
43.进一步，还包括制作样品垫的步骤。
44.采用上述技术方案有益效果包括：
45.进一步，制作样品垫包括以下步骤：使用样品垫处理液浸湿玻璃纤维，然后45℃烘箱烘干2h。
46.采用上述技术方案有益效果包括：采用上述步骤有利于提高试验效果。
47.进一步，还包括组装成完整大卡，切割成试剂条，组装成试剂卡的步骤。
48.本发明提供一种皮质醇检测试纸的使用方法，包括以下步骤：将待测样品加到样品垫，检测t线od值和c线od值，根据关于t线od值与c线od值的比值、皮质醇浓度的标准曲线计算待测样品中皮质醇的浓度。
49.采用上述技术方案有益效果包括：可以根据t线显色强弱，测定样品中激素含量，具有准确性好、检验时间短、操作简单、只需一步简单操作、不受人员场地等限制、非专业人员可操作、有便携式小仪器、可在非实验室地点操作等优点。
附图说明
50.图1为试纸的结构示意图。
51.图2为的读数窗口和加样孔的外观图。
52.图1和图2中，各标号代表的含义如下：1、吸水滤纸，2、硝酸纤维素膜，3、标记垫，4、样品垫，5、c线，6、t线，7、读数窗口，8、加样孔。
53.图3为制备皮质醇检测试纸的工艺流程图。
54.图4为皮质醇标准曲线图，横坐标od代表试剂c线反应线吸光度值,纵坐标s代表样本的浓度(单位ng/ml)。
55.图5为荧光法和酶免法测得的浓度值对比结果图。
具体实施方式
56.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
57.如图1和图2所示，本发明提供一种皮质醇检测试纸，包括以下部分：吸水滤纸1、硝酸纤维素膜2、标记垫3、样品垫4和支撑物，支撑物位于吸水滤纸1、硝酸纤维素膜2、标记垫3、样品垫4的下方，用于支撑各部分。
58.吸水滤纸1的一端与硝酸纤维素膜2的一端连接，硝酸纤维素膜2的另一端与标记垫3的一端连接，标记垫3的另一端与样品垫4的一端连接。硝酸纤维素膜2设有质控区和检测区。在质控区和检测区处开设有读数窗口7，通过读数窗口7可以观察质控区c线5和检测区的t线6的变化情况，在样品垫4处开设有加样孔8，用于添加待检测样品。
59.采用独立c线体系，c线5的位置包被羊抗兔抗体；t线6的位置包被皮质醇抗原；标记垫3喷涂有抗体微球偶联液，所述抗体微球偶联液为偶联皮质醇标记抗体、兔igg抗体的微球偶联液。
60.上述皮质醇检测试纸可以进一步组装成试纸卡以及用于皮质醇检测的试剂盒。
61.下面通过实施例进行具体介绍。
62.实施例中，
63.本发明中的实验材料若无特别说明均可通过市购获得或者根据本领域常规方法制备。
64.本发明中的方法若无特别说明均可采用本领域常规方法进行。
65.nhs为n-羟基琥珀酰亚胺,edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，均可通过市购获得。
66.原料名称货号保存条件使用浓度皮质醇包被抗原c037-20℃1.5mg/ml皮质醇标记抗体m344-20℃0.5mg/ml羊抗兔抗体hds-a6008-20℃1.5mg/ml兔igg抗体hds-a6011-20℃1mg/ml
67.实施例1制备皮质醇检测试纸
68.如图3所示，本发明提供一种皮质醇检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
69.1、制备抗体微球偶联液
70.(1)清洗微球：在100μl洗液中加入10μl微球配液，轻拍混匀，超声后60s，洗涤两次，离心去上清，收集沉淀液备用。
71.洗液：0.02mol/l pbs，ph 7.4。
72.微球：粒径210nm，含有cooh基团；微球配液中，浓度含量为0.05％。
73.(2)微球活化：在沉淀液中加100μl洗液，轻拍混匀，超声后60s，加入10μl配制好的nhs和edc的混合溶液，nhs和edc的混合溶液中nhs和edc的质量比为1:1，混合溶液中，nhs的浓度为10mg/ml，edc的浓度为10mg/ml，使用洗液配制，现配现用，轻拍混匀，活化30min。离心去上清，收集沉淀液备用。
74.采用上述方法可以达到最佳试验效果。
75.(3)抗体偶联：在沉淀液中加偶联液100μl，轻拍混匀，超声60s，加入5μg皮质醇抗体混匀。同时偶联兔igg抗体,相同条件活化微球，活化微球用量为10μg。室温反应90min。
76.偶联液：0.02m硼酸缓冲液，ph8.0。
77.(4)终止反应：加入1m的乙醇胺0.5μl，轻拍混匀，终止30min。离心去上清备用。
78.(5)增加封闭：加入浓度为0.6％的酪蛋白溶液100μl，轻拍混匀，超声60s，封闭90min，离心去上清备用。
79.(6)复溶：在偶联皮质醇抗体的沉淀液(即步骤(5)中离心后去除上清的沉淀)中加
入200μl复溶液，轻拍混匀，超声备用。在偶联兔igg抗体的沉淀液中加入100μl复溶液，轻拍混匀，超声备用。
80.复溶液配制：以100ml为例，tris 1.2g、bsa 1g、蔗糖8g、海藻糖2.5g、酪蛋白纳0.7g，加超纯水定容至100ml。最终ph 8.0。
81.(7)喷涂：在200μl皮质醇抗体偶联液中加入24μl兔igg抗体偶联液，混匀，超声备用。将抗体微球偶联液使用喷金划膜仪喷涂在标记垫上，喷涂量为3μl/cm，37℃烘箱烘干2h后备用。
82.标记垫的材质为玻璃纤维，预先用标记垫处理液处理。标记垫处理液的配制方法包括以下步骤：以100ml为例，tris 0.3g、酪蛋白钠0.5g、pvp0.25g、吐温2020μl、定容至100ml，ph8.0。
83.2、包被抗体、抗原
84.t线位置包被皮质醇抗原，将皮质醇抗原配液，浓度稀释为1.5mg/ml，使用喷金划膜仪划涂在硝酸纤维素膜(nc膜)上，划涂量为0.8μl/cm，37℃烘箱烘干2h干燥后备用。
85.c线位置包被羊抗兔抗体，将羊抗兔抗体配液，浓度稀释为1.5mg/ml，使用喷金划膜仪划涂在硝酸纤维素膜(nc膜)上，划涂量为0.8μl/cm，37℃烘箱烘干2h干燥后备用。
86.3、样品垫制备
87.样品垫的制备：使用样品垫处理液浸湿玻璃纤维，然后45℃烘箱烘干2h后备用。
88.样品垫处理液配制：以100ml为例，tris 0.4g、酪蛋白钠0.7g、pvp 0.7g、nacl 1.3g、吐温200.2ml，加超纯水定容至100ml，ph8.6。
89.4、组装
90.将吸水滤纸、硝酸纤维素膜、标记垫、样品垫和支撑物以及上述材料组装成完整大卡，切割成试剂条，组装成试剂卡，待用。可以采用包括贴板、制半成品大板、切条、压卡、检测、装袋包装等步骤。
91.实施例2检测皮质醇
92.利用荧光免疫层析技术，采用竞争法检测皮质醇。检测时，样品中无皮质醇或少量皮质醇，检测线(t线)在光线照射信号值越强；样品中含有大量皮质醇检测线(t线)光线照射信号越弱。质控线(c线)在光线照射下都会出现一定信号值，也作为试剂的内控标准。
93.具体的，本发明提供上述试纸的检测方法，包括以下步骤：
94.制作t/c od值(即t线od值与c线od值的比值)与皮质醇浓度的标准曲线，检测待测样品的t/c od值，根据标准曲线计算待测样品中皮质醇的浓度。
95.1、待检样品的操作步骤可以包括以下步骤：
96.(1)将本发明的试纸从包装盒中取出，放在桌面上平衡30min；
97.(2)将检测样本取出放在桌面恢复至室温；
98.(3)拆开试纸包装，水平放于桌面，每个试纸的加样孔滴加约60μl样本，滴管约3滴，反应20min；
99.(4)将反应好的试纸条插入荧光读数仪根据荧光强弱进行读值，读取t线od值与c线od值，并计算t线od值与c线od值的比值，根据标准曲线计算待测样品中皮质醇的浓度。
100.2、以海南长臂猿粪便为例，将上述方法制备试纸条采用上述方法检测海南长臂猿粪便中皮质醇含量，并绘制标准曲线。
101.检测数据如表1所示。根据各个浓度平均值制备标准曲线，横坐标od代表试剂c线反应线吸光度值，纵坐标为皮质醇浓度。标准曲线如图4所示，从图4中可以看出，绘制的标准曲线r2＝0.99999，该试剂测得的数据符合logistic fit曲线。
102.也可以以t线od值与c线od值的比值为横坐标，以皮质醇浓度为纵坐标，绘制标准曲线，具体数据如果表1所示。加入t/c算法能屏蔽掉样本误差，可以使进一步提高检测结果的准确性。
103.表1
104.[0105][0106]
实施例3分别采用荧光法和酶免法检测结果比较
[0107]
1、采用荧光法对海南长臂猿粪便皮质醇含量进行检测
[0108]
(1)称取0.5(+/-0.02)克粪样至已编号的大玻璃试管中。记录表每份粪样的重量，粪样要尽量除尽杂质，封盖保存待测。
[0109]
(2)向每管加入5ml 90％的酒精；漩涡震荡至粪样与酒精充分混匀。
[0110]
(3)再次漩涡振荡每支试管10sec。离心机1,500rpm离心25min。
[0111]
(4)上清液保存至另一套编号与其相对应的玻璃试管中。
[0112]
(5)再次向原装有粪便试管中加入5ml 90％的酒精，漩涡震荡30秒钟；1,500rpm离心20分钟。
[0113]
(6)倒上清液于第一次提取时上清液的试管中。
[0114]
(7)水浴70℃干燥；用90％乙醇(约2ml)冲洗试管壁漩涡震荡5sec，干燥；使用1ml甲醇回收；
[0115]
(8)振荡，超声波溶解，通风橱内干燥；
[0116]
(9)使用1ml甲醇回收；振荡，超声波溶解15分钟，通风橱内干燥；
[0117]
(10)加入1ml 0.02mol/l的pbs稀释液(含有nah2po4、na2hpo4、nacl、milli-q h2o，ph＝7.0)，超声波溶解15min；
[0118]
(11)采用实施例2的方法对海南长臂猿粪便皮质醇含量进行检测。
[0119]
2、采用酶免法对海南长臂猿粪便皮质醇含量进行检测，包括以下步骤：
[0120]
(1)称取0.5(+/-0.02)克粪样至已编号的大玻璃试管中。记录表每份粪样的重量，粪样要尽量除尽杂质，封盖保存待测。
[0121]
(2)向每管加入5ml 90％的酒精；漩涡震荡至粪样与酒精充分混匀。
[0122]
(3)再次漩涡振荡每支试管10sec。离心机1,500rpm离心25min。
[0123]
(4)上清液保存至另一套编号与其相对应的玻璃试管中。
[0124]
(5)再次向原装有粪便试管中加入5ml 90％的酒精，漩涡震荡30秒钟；1,500rpm离心20分钟。
[0125]
(6)倒上清液于第一次提取时上清液的试管中。
[0126]
(7)水浴70℃干燥；用90％乙醇(约2ml)冲洗试管壁漩涡震荡5sec，干燥；使用1ml甲醇回收；
[0127]
(8)振荡，超声波溶解，通风橱内干燥；
[0128]
(9)使用1ml甲醇回收；振荡，超声波溶解15分钟，通风橱内干燥；
[0129]
(10)加入1ml 0.02mol/l的pbs稀释液(含有nah2po4、na2hpo、nacl、milli-q h2o，ph＝7.0)，超声波溶解15min；
[0130]
(11)利用酶免法测定。
[0131]
采用荧光法和酶免法检测的检测结果如表2和图5所示。图5为荧光和酶免浓度值对比的结果图，从图5中可以看出两种方案测定的皮质醇激素浓度变化趋势一致，说明荧光微球法与酶免法相比只是测定的浓度基数不同，但所反映浓度变化趋势一致。变化趋势说明反映的实际情况变化是一致的，趋势相同说明该方法的准确度很高。采用荧光微球法，大大降低了对激素测定实验环境的要求，大大减少了实验步骤，进而降低了实验过程中的人为误差，大大提高了激素的检测效率。
[0132]
表2荧光法和酶免法检测结果比较
[0133]
[0134][0135]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。