一种内源性标志物集合及其用于评估染料木素摄入情况的用途

1.本发明涉及食品营养领域。具体地说，本发明涉及一种内源性标志物集合及其用于评估染料木素摄入情况的用途。


背景技术：

2.染料木素(genistein)，是大豆异黄酮(soy isoflavones)的主要组分之一，广泛存在于大豆、苜蓿等植物饲料中。大豆异黄酮与人类雌激素17-β-雌二醇在结构上具有相似性，可与α和β雌激素受体结合，并模拟雌激素对靶器官的作用，在用于某些激素依赖性疾病时可发挥许多健康益处，因此又被称为“植物雌激素(phytoestrogen)”。此外，研究表明染料木素还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、改善骨质疏松等生物活性。
3.代谢组学是针对小分子代谢物的整体研究，通过采用高通量检测提供完整的体内代谢网络信息，探究生物体在内源性或外源性因素作用下，代谢产物种类和数量的变化及规律，并将其与所发生的生理变化相关联，结合深入数据挖掘，综合探究引起生理变化的多靶点效应。由于液相-质谱连用技术(lc-ms)具有分离能力好，以及高灵敏度和高分辨率等特点，被越来越多的应用于代谢组学研究中。并且随着技术的不断进步，超高效液相色谱-离子淌度-四级杆飞行时间质谱(uplc-ims-qtof-ms)分析技术为利用非靶向代谢组学在筛查内源性小分子物质中筛选生物标志物并且鉴定其结构提供了可靠的技术平台，因此得到了越来越多的应用。为了更充分的发掘数据中包含的潜在信息，多元变量统计分析逐渐发挥其独特的优势，目前在代谢组学中占据重要的地位。
4.目前，关于染料木素对机体影响的研究通常采用各种不同的模型鼠(如高脂血症模型鼠、肥胖模型鼠、去势模型鼠等)进行研究，所得数据结果仅局限于某种特定病理模型，不能反映日常摄入染料木素或大豆制品对正常健康人群(特别是女性人群)机体内分泌干扰的影响。既往研究表明染料木素的摄入情况对机体的代谢等过程有较大影响，但本领域尚无一种能够全面有效地评价染料木素摄入量是否过量或不足的方法。
5.因此，本领域需要开发一种能够评估健康动物或人群是否适宜补充染料木素和/或评估染料木素摄入量的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种能够评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或评估染料木素摄入量的方法。
7.本发明的另一目的是提供一组能够用于评价待测对象是否需要或适宜补充染料木素的生物标志物。
8.在本发明的第一方面，提供了一种内源性标志物集合，所述的集合包括n种选自下组的内源性标志物：
9.(a1)甲基丙二酸、
10.(a2)尿苷、
11.(a3)黄嘌呤、
12.(a4)次黄嘌呤、
13.(a5)谷氨酰胺、
14.(a6)鸟苷、
15.(a7)肌苷、
16.(a8)l-2-羟基戊二酸、
17.(a9)3,4-二羟基苯基乙二醇、
18.(a10)香草二醇、
19.(a11)氧戊二酸、
20.(a12)1-甲基烟酰胺、
21.(a13)丙戊酸、
22.(a14)地高辛、
23.(a15)11-脱氢皮质酮及同分异构体、
24.(a16)21-脱氧皮质醇及同分异构体、
25.(a17)17α-羟基孕烯醇酮、
26.(a18)石胆酸、
27.(a19)熊胆酸及同分异构体、
28.(a20)胆酸及同分异构体、
29.(a21)乙醇酸、
30.(a22)牛磺去氧胆酸、
31.(a23)雌酮、
32.(a24)皮质醇、
33.(a25)睾丸激素及同分异构体、
34.(a26)5,6-环氧-8,11,14-二十碳三烯酸、
35.(a27)17α-羟孕酮及同分异构体、
36.(a28)脱氧皮质酮、
37.(a29)花生四烯酸、
38.(a30)鹅去氧胆酸及同分异构体、
39.(a31)熊去氧胆酸及同分异构体、
40.(a32)鹅去氧胆酸甘氨酸结合物、
41.(a33)3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾酸、
42.(a34)24-羟基胆固醇及同分异构体、
43.(a35)硫酸胆固醇、
44.(a36)磷脂酰丝氨酸、
45.(a37)磷脂酰乙醇胺、
46.(a38)溶血磷脂酰胆碱、
47.(a39)磷脂酰胆碱；
48.其中，n为选自2～39的整数，所述内源性标志物集合用于：
49.(i)评估待测对象是否适宜补充染料木素；
50.(ii)评估待测对象染料木素摄入量。
51.在另一优选例中，所述的内源性标志物集合包括(a1)～(a39)。
52.在另一优选例中，所述的评估待测对象染料木素摄入量为定性评估。
53.在另一优选例中，所述的n选自下组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38和39。
54.在另一优选例中，所述内源性标志物是来源于待测对象的内源性标志物。
55.在另一优选例中，所述内源性标志物集合包括选自下组的内源性标志物：
56.1-甲基烟酰胺，丙戊酸，地高辛，鹅去氧胆酸及同分异构体，熊去氧胆酸及同分异构体，鹅去氧胆酸甘氨酸结合物，3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾酸，24-羟基胆固醇及同分异构体，硫酸胆固醇
57.在另一优选例中，所述内源性标志物集合包括选自下组的内源性标志物：
58.鹅去氧胆酸及同分异构体，熊去氧胆酸及同分异构体，鹅去氧胆酸甘氨酸结合物，硫酸胆固醇
59.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于血浆、尿液、粪便、肝脏或卵巢样本。
60.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于血浆、尿液或粪便样本。
61.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于血浆样本，并且所述内源性标志物集合包括选自下组的2种或以上内源性标志物：黄嘌呤、熊胆酸及同分异构体、胆酸及同分异构体、睾丸激素及同分异构体、5,6-环氧-8,11,14-二十碳三烯酸、花生四烯酸、鹅去氧胆酸甘氨酸结合物、和硫酸胆固醇。
62.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于尿液样本，并且所述内源性标志物集合包括选自下组的2种或以上内源性标志物：甲基丙二酸、尿苷、次黄嘌呤、谷氨酰胺、肌苷、l-2-羟基戊二酸、3,4-二羟基苯基乙二醇、香草二醇、氧戊二酸、丙戊酸、11-脱氢皮质酮及同分异构体、17α-羟基孕烯醇酮、皮质醇、17α-羟孕酮及同分异构体、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、和磷脂酰胆碱。
63.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于粪便样本，并且所述内源性标志物集合包括选自下组的2种或以上内源性标志物：鸟苷、1-甲基烟酰胺、地高辛、21-脱氧皮质醇及同分异构体、17α-羟基孕烯醇酮、石胆酸、熊胆酸及同分异构体、雌酮、鹅去氧胆酸及同分异构体、熊去氧胆酸及同分异构体、3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾酸、24-羟基胆固醇及同分异构体、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、和磷脂酰胆碱。
64.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于肝脏样本，并且所述内源性标志物集合包括选自下组的2种或以上内源性标志物：次黄嘌呤、乙醇酸、牛磺去氧胆酸、脱氧皮质酮、鹅去氧胆酸甘氨酸结合物、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、和磷脂酰胆碱。
65.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于卵巢样本，并且所述内源性标志物集合包括选自下组的内源性标志物：熊胆酸及同分异构体、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、和磷脂酰胆碱。
66.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括嘧啶代谢通路相关标志物，并且所述内源性标志物集合包括选自(a1)～(a2)的一种或多种标志物。
67.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括嘌呤代谢通路相关标志物，并且所述
内源性标志物集合包括选自(a3)～(a7)的一种或多种标志物。
68.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括氨基酸代谢通路相关标志物，并且所述内源性标志物集合包括选自(a8)～(a11)的一种或多种标志物。
69.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括胆汁分泌通路相关标志物，并且所述内源性标志物集合包括选自(a12)～(a14)的一种或多种标志物。
70.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括固醇类激素合成通路相关标志物，并且所述内源性标志物集合包括选自(a15)～(a17)的一种或多种标志物。
71.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括胆汁酸合成通路相关标志物，并且所述内源性标志物集合包括选自(a18)～(a22)和(a30)～(a35)的一种或多种标志物。
72.在另一优选例中，所述的胆汁酸合成通路为初级和/或次级胆汁酸合成通路。
73.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括卵巢类固醇合成通路相关标志物，并且所述内源性标志物集合包括选自(a23)～(a29)的一种或多种标志物。
74.在另一优选例中，所述的内源性标志物包括甘油磷脂代谢通路相关标志物，并且所述内源性标志物集合包括选自(a36)～(a39)的一种或多种标志物。
75.在另一优选例中，与一参考值进行比较，如所述内源性标志物集合中的一个、或多个、或全部内源性标志物水平高于参考值，则表明：
76.(iii)所述对象染料木素摄入量过多；和/或
77.(iv)所述对象不宜补充染料木素，
78.其中，所述高于参考值是指，样本中内源性标志物水平(f1)比参考值(f0)的比值(即f1/f0)≥1.5，优选地≥2，更优选地≥2.5。
79.在另一优选例中，与一参考值进行比较，如所述内源性标志物集合中的一个、或多个、或全部内源性标志物水平低于参考值，则表明：
80.(iii)所述对象染料木素摄入量不足；和/或
81.(iv)所述对象适宜补充染料木素，
82.其中，所述低于参考值是指，样本中内源性标志物水平(f1)比参考值(f0)的比值(即f1/f0)≤0.7，优选地≤0.5，更优选地≤0.4。
83.在另一优选例中，所述的参考值指该内源性标志物在正常生理状态下的表达水平。
84.在另一优选例中，通过质谱法对各个内源性标志物进行鉴定，较佳地，通过色谱质谱联用，如液相色谱-质谱(lc-ms)法。
85.在另一优选例中，所述的补充染料木素包括补充染料木素单体、补充含染料木素的药物组合物、食物组合物或保健品组合物、补充含染料木素的药物原材料或食物原材料、或其提取物、或其制品、或其组合。
86.在另一优选例中，所述的补充包括为治疗性目的补充、和为保健性目的补充。
87.在另一优选例中，所述的补充包括口服补充。
88.在另一优选例中，所述的含染料木素的药物原材料和食物原材料包括大豆、苜蓿、槐角、山豆根、或其组合。
89.在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。
90.在另一优选例中，所述的对象为雌性动物。
91.在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括：猪、牛、马、羊、犬、猫、禽类、啮齿类等
动物。
92.在另一优选例中，所述的对象不患有代谢性疾病。
93.在另一优选例中，所述的代谢性疾病包括脂类代谢疾病、糖代谢疾病、氨基酸代谢疾病和嘌呤代谢疾病。
94.在另一优选例中，所述的代谢性疾病优选为高脂血症、性激素紊乱。
95.在另一优选例中，所述的对象为非更年期人群、或非卵巢切除人群。
96.在本发明的第二方面，提供了一种试剂组合，所述试剂组合包括用于检测如本发明第一方面所述的内源性标志物集合中各个内源性标志物的试剂。
97.在另一优选例中，所述的试剂包括用于质谱法检测如本发明第一方面所述的内源性标志物集合中各个内源性标志物的物质。
98.在另一优选例中，所述的试剂组合用于：
99.(i)评估待测对象是否适宜补充染料木素；和/或
100.(ii)评估待测对象染料木素摄入量。
101.在另一优选例中，所述的评估待测对象染料木素摄入量为定性评估。
102.在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括如本发明第二方面所述的试剂组合。
103.在另一优选例中，在所述试剂盒中，还包括如本发明第一方面所述的内源性标志物集合中各个内源性标志物，作为标准品。
104.在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，优选地，所述的说明书记载了用于评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或定性评估待测对象染料木素摄入量。
105.在另一优选例中，可选地，所述说明书还记载了所述内源性标志物集合中各个内源性标志物的水平的参考值。
106.在另一优选例中，所述说明书记载了评估待测对象是否适宜补充染料木素的方法，所述方法包括步骤：
107.(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中所述集合中各个内源性标志物的水平进行检测；
108.(2)将步骤(1)测得的水平与参考值进行比较；
109.较佳地，所述的参考值包括来源于健康对照者的所述集合中各个内源性标志物的水平。
110.在另一优选例中，所述的内源性标志物来源于血浆、尿液或粪便样本。
111.在另一优选例中，所述的说明书进一步记载了，如所述内源性标志物集合中的一个、或多个、或全部内源性标志物水平高于参考值，则表明：
112.(i)所述对象染料木素摄入量过多；和/或
113.(ii)所述对象不宜补充染料木素，
114.其中，所述高于参考值是指，样本中内源性标志物水平(f1)比参考值(f0)的比值(即f1/f0)≥1.5，优选地≥2，更优选地≥2.5。
115.在另一优选例中，所述的说明书进一步记载了，如所述内源性标志物集合中的一个、或多个、或全部内源性标志物水平低于参考值，则表明：
116.(i)所述对象染料木素摄入量不足；和/或
117.(ii)所述对象适宜补充染料木素，
118.其中，所述低于参考值是指，样本中内源性标志物水平(f1)比参考值(f0)的比值(即f1/f0)≤0.7，优选地≤0.5，更优选地≤0.4。
119.在本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的内源性标志物集合、或如本发明第二方面所述的试剂组合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或评估待测对象染料木素摄入量。
120.在本发明的第五方面，提供了一种评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或评估待测对象染料木素摄入量的装置，其包括：
121.(a)检测模块，用于接收来源于待测对象的样品，并对所述样品中如本发明第一方面所述的内源性标志物集合中的各个标志物水平进行检测；
122.(b)数据处理模块，用于将检测模块(a)测得的水平与参考值进行比较。
123.在另一优选例中，所述的数据处理模块(b)输出样本中内源性标志物水平(f1)比参考值(f0)的比值(即f1/f0)。
124.在另一优选例中，所述的装置还包括(c)输出模块，用于输出结果，
125.其中，f1/f0≥1.5，优选地≥2，更优选地≥2.5时，输出结果为：所述对象染料木素摄入量过多和/或所述对象不宜补充染料木素；
126.f1/f0≤0.7，优选地≤0.5，更优选地≤0.4时，输出结果为：所述对象染料木素摄入量不足和/或所述对象适宜补充染料木素。
127.在本发明的第六方面，提供了一种评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或评估待测对象染料木素摄入量的方法，包括步骤：
128.(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中如本发明第一方面所述的内源性标志物集合中的各个标志物水平进行检测；
129.(2)将步骤(1)测得的水平与一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；
130.较佳地，所述的参考值包括来源于健康对照者的所述集合中各个内源性标志物的水平。
131.在另一优选例中，如所述内源性标志物集合中的一个、或多个、或全部内源性标志物水平高于参考值，则表明：
132.(i)所述对象染料木素摄入量过多；和/或
133.(ii)所述对象不宜补充染料木素，
134.其中，所述高于参考值是指，样本中内源性标志物水平(f1)比参考值(f0)的比值(即f1/f0)≥1.5，优选地≥2，更优选地≥2.5。
135.在另一优选例中，如所述内源性标志物集合中的一个、或多个、或全部内源性标志物水平低于参考值，则表明：
136.(i)所述对象染料木素摄入量不足；和/或
137.(ii)所述对象适宜补充染料木素，
138.其中，所述低于参考值是指，样本中内源性标志物水平(f1)比参考值(f0)的比值(即f1/f0)≤0.7，优选地≤0.5，更优选地≤0.4。
139.在另一优选例中，通过质谱法对各个内源性标志物的水平进行检测，较佳地，通过色谱质谱联用，如气相色谱-质谱法(gc-ms)或液相色谱-质谱(lc-ms)法。
140.在另一优选例中，在步骤(i)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。
141.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
142.下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
143.图1展示了本发明方法的实验流程图。
144.图2展示了染料木素(genistein)对氨基酸代谢和嘌呤代谢通路的影响。
145.图3展示了染料木素对甘油磷脂代谢、固醇类激素合成、卵巢固醇生成以及初级、次级胆汁酸合成以及胆汁分泌代谢通路的影响。
具体实施方式
146.本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一组内源性标志物，其水平受到染料木素摄入的影响，能够用于评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或评估待测对象染料木素摄入量。具体地，本发明基于uplc-ims-qtof-ms技术筛查了染料木素内分泌干扰效应，进行了代谢组学分析，全面、完整地获得了染料木素干扰健康雌性机体内分泌代谢通路信息，并基于此筛选出了本发明的内源性标志物集合。在此基础上，完成了本发明。
147.术语
148.本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
149.在本发明中，术语“标志物”或“生物标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的标志物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(例如dna)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(ko/og标记)等。生物标志物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。
150.在本发明中，术语“参照值”、正常值”和“参考值”均具有本领域技术人员通常理解的含义，是指健康对照的参考值或正常值。绝大多数正常人的某指标值范围称为该指标的正常范围，该绝大多数可以是90％、95％、99％等，优选为95％。本领域的技术人员清楚，在样品数量足够多情况下，每个标志物的正常值(绝对值)的范围可以通过检验和计算方法得到。因此，当利用除质谱以外的其他方法来检测生物标志物的水平时，这些生物标志物水平的绝对值，可以直接与正常值比较，从而评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或评估待测对象染料木素摄入量。在本发明中，还可以使用统计方法。
151.根据本发明，术语“个体”或“对象”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，优选地为人。
152.根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。
153.需要说明的是，在此提供术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。
154.染料木素
155.染料木素(genistein)，是大豆异黄酮(soy isoflavones)的主要组分之一，广泛存在于大豆、苜蓿等植物饲料中。大豆异黄酮与人类雌激素17-β-雌二醇在结构上具有相似性，可与α和β雌激素受体结合，并模拟雌激素对靶器官的作用，在用于某些激素依赖性疾病时可发挥许多健康益处，因此又被称为“植物雌激素(phytoestrogen)”。此外，研究表明染料木素还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、改善骨质疏松等生物活性。
156.染料木素的化学结构式如下：
[0157][0158]
内源性标志物集合
[0159]
本发明提供了如本发明第一方面所述的内源性标志物集合。
[0160]
本发明的内源性标志物涉及多个代谢过程，代表性的内源性标志物包括：
[0161]
皮质醇(cortisol)：皮质醇是糖皮质激素的一种，其在操纵情绪和健康、免疫细胞和炎症等方面具有特别重要的功效。尿游离皮质醇可以有效、正确地反映肾上腺皮质的功能状态。皮质醇的正常参考范围应该在88.3～257.9纳摩/24小时尿；
[0162]
胆酸及同分异构体(cholic acid isomer)：血清胆汁酸是反映急性肝细胞损伤的又一敏感指标。血清胆汁酸水平与肝胆疾病密切相关，胆汁酸增高时主要见于肝胆疾病。正常人空腹血清总胆汁酸小于10微摩尔/升。
[0163]
评估方法和待测对象
[0164]
本发明提供了一种评估待测对象是否适宜补充染料木素和/或定性评估待测对象染料木素摄入量的装置和方法。
[0165]
本发明的实施例中验证了染料木素对雌性健康大鼠多个内源性标志物的影响。基于该实验结果，本发明提供了一种评估方法，如待测对象体内所述内源性标志物已高于正常生理值，则不适宜补充染料木素，和/或存在染料木素摄入过量的情况；反之，如待测对象体内所述内源性标志物低于于正常生理值，则待测对象适宜补充染料木素，和/或染料木素摄入不足。
[0166]
进一步地，基于本发明的实验结果，本领域技术人员能够预测染料木素对其他性别的、或患有疾病的动物也能够产生类似影响。因此，使用本发明的内源性标志物集合进行评估的待测对象不受具体实施例限制。具体地，本发明所用的“待测对象”可以包括人和非人哺乳动物；可以包括雄性动物和雌性动物；也可以包括健康动物和患病动物。
[0167]
在本发明的优选实施方式中，所述的待测对象包括健康雌性动物。
[0168]
本发明的主要优点包括：
[0169]
1)本发明首次从代谢水平上揭示染料木素(genistein)影响健康雌性机体代谢通路的内源性标志物，并且从所涉及的代谢通路揭示染料木素对代谢通路的影响。
[0170]
2)本发明的标志物可在血浆、粪便、尿液等多种样本中进行检测，取材方便、操作步骤简单。
[0171]
3)本发明可用于不患有代谢性疾病人群，尤其是妇女人群的定期监测，对于调整饮食结构和指导保健品、药品使用有重要意义。
[0172]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0173]
下述实施例采用了基于液相色谱-质谱技术的用于筛查染料木素影响内分泌内源性标志物的代谢组学分析方法。该方法基于代谢组学技术结合正交偏最小方差判别分析(opls-da)的染料木素(genistein)影响健康雌性机体内分泌内源性标志物的筛选方法，方法包括样品处理，数据采集，数据预处理，内源性标志物的筛选、鉴定等步骤。
[0174]
具体地，本发明以雌性sd大鼠血浆、尿液、粪便、肝脏和卵巢为研究对象，采用代谢组学方法，用超高效液相色谱-vion离子淌度四极杆飞行时间质谱(uplc-vion-ims-qtof-ms)技术建立了血浆、尿液、粪便、肝脏和卵巢的代谢指纹图谱，结合主成分分析(pca)和正交偏最小方差判别分析(opls-da)进行数据分析处理，筛找染料木素(genistein)干扰机体内分泌的潜在生物标志物，构建筛查染料木素影响内分泌的生物标志物的代谢组学分析方法。整体实验流程图如图1所示。
[0175]
实施例1动物饲养及生物样品采集
[0176]
1.1动物实验
[0177]
动物实验在上海交通大学实验动物中心进行。20只雌性sd大鼠(体重约为200g)在spf级别实验室喂养。大鼠饲养环境为：12小时昼夜更替，环境温度：25
±
1℃，湿度：50
±
5％。大鼠购入后先适应性喂养一周，之后将大鼠随机分为2组，分别为正常饲养组(n＝10)和染料木素组(n＝10)。染料木素组每日灌胃220mg/kg剂量的染料木素，正常组灌胃等体积生理盐水。喂养4周。
[0178]
1.2生物样品采集
[0179]
喂养结束前三天将动物转移至代谢笼中，用于收集动物粪便和尿液。收集到的粪便和尿液置于-80℃冰箱保存。动物安乐死前禁食12小时。大鼠经异氟烷麻醉后从腹主动脉采集血液。血液收集于edta抗凝管中并轻轻摇晃，使抗凝管中涂料与血液混合均匀。3600转/分钟(rpm)条件下离心15分钟(min)，取得上清血浆，置于-80℃冰箱保存。采血后对动物实施安乐死，并采集肝脏和卵巢。用生理盐水清洗去除脏器表面血液后，分别用锡箔纸包好并置于液氮中急冻，之后转移至-80℃冰箱保存。
[0180]
取得健康雌性大鼠血液、组织、尿液、粪便样本，并置于-80℃冰箱保存。
[0181]
实施例2生物样品预处理和质谱分析
[0182]
2.1血液样品预处理
[0183]
准确移取100微升(μl)血浆于1.5毫升(ml)离心管中，加入300μl乙腈，涡旋30秒(s)混匀，之后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清于waters全回收样品瓶中。
[0184]
2.2组织样品预处理
[0185]
组织样品置于室温解冻，准确称取一定质量组织样本(精确到0.1毫克(mg))，加入无菌生理盐水，质量体积比为1：9，例如称取100.0mg肝组织加入900μl无菌生理盐水，4℃，6500rpm条件下匀浆60s，准确量取匀浆液300μl于干净的1.5ml离心管中，加入3倍体积的acn(900μl)，涡旋1min，之后于4℃，10000rpm条件下，离心10min，取上清于waters样品瓶中，用于后续uplc i-class/vion-ims-qtof-ms分析。
[0186]
2.3尿液样品预处理
[0187]
尿液样品置于室温解冻，涡旋30s，混匀后准确量取200μl尿液于1.5ml离心管中，加入800μl超纯水，在4℃条件下，12000rpm，离心10min，取上清于waters样品瓶中，用于后续uplc i-class/vion-ims-qtof-ms分析。
[0188]
2.4粪便样品预处理
[0189]
将冻存于-80℃冰箱的粪便样品取出后，直接置于真空冷冻干燥仪中进行干燥。冻干后将粪便样品磨粉，准确量取干燥的粪便粉末125mg(准确到0.1mg)于干净的1.5ml离心管中，加入1.0ml超纯水，先涡旋30s，之后超声60s，使其充分溶解，3600rpm条件下离心10min，移取上清液。再分别用1ml甲醇和1ml异丙醇各重复提取一次，取得上清后合并，混匀后再次于4℃，12000rpm条件下离心10min，取上清于waters样品瓶中，用于后续uplc i-class/vion-ims-qtof-ms分析。
[0190]
2.5样品质谱分析
[0191]
(1)液相色谱条件
[0192]
采用waters公司acquity i-class超高效液相色谱系统，色谱柱为：waters cortecs c18柱,1.6μm，2.1mm
×
50mm；柱温：45℃；流速：0.4ml/min；流动相a：含0.1％甲酸-水；流动相b：含0.1％甲酸-乙腈；洗针液：h2o/acn(v/v,10/90)；进样体积：1μl；梯度洗脱条件：初始，99％a，1％b；1min，99％a，1％b；3.5min，80％a，20％b；9min，100％b；11min，100％b；11.1min，99％a，1％b；13min，99％a，1％b。
[0193]
(2)质谱条件
[0194]
采用waters公司vion离子淌度四极杆飞行时间质谱(vion-ims-qtof-ms)，采集模式：mse(低能量/高能量切换扫描)，离子模式：电喷雾正离子/负离子(esi+/esi-)分别扫描；毛细管电压：2kv；锥孔电压：40v；雾化气温度：450℃；雾化气流量：900l/h；锥孔反吹气：50l/h；离子源温度：115℃；扫描范围：50-1000m/z；扫描速度：0.2s；碰撞能量：6ev/20-45ev。
[0195]
质谱在线校正为：250pg/μl的亮氨酸脑啡肽，流速：10μl/min，采集时间：0.5s，采集间隔：0.5s，碰撞能量：6ev。
[0196]
实施例3内源性标志物分析鉴定
[0197]
3.1质谱数据预处理和多元变量统计分析
[0198]
使用waters公司的unifi软件采集质谱数据，之后将原始质谱数据导入progenesis qi软件进行前处理(包括归一化、数据转化、中心化、标准化等步骤)，再将处理后的数据导入到ezinfor软件，采用主成分分析(pca)、正交偏最小方差判别分析(opls-da)等进行多元统计分析。
[0199]
3.2内源性标志物筛选及鉴定
[0200]
经progenesis qi处理后的数据导入到ezinfor软件进行正交偏最小方差判别分析(opls-da)，选择vip》1，fc》2，p《0.05作为候选生物标志物。然后根据hmdb(https://hmdb.ca/)
检索得到的生物标志物，并根据所得到的一级和二级质谱信息对所得候选物质进行鉴定，并确定最终的生物标志物。之后通过kegg(http://www.kegg.com/)和metaboanalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)数据库分析生物学标志物所影响的代谢途径。
[0201]
结果：基于上述代谢组学和多元变量统计分析，在雌性sd大鼠血液、尿液、粪便、肝脏和卵巢中共发现染料木素(genistein)的代谢物总计71、475、786、436和498种，从中筛选出39种差异性生物标志物，标志物相关信息如表1所示，其中部分标志物在不同样本和脏器中均有检出。
[0202]
表1.染料木素干扰代谢通路的内源性标志物
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207][0208]
infinity*：差异倍率极大。
[0209]
实施例4筛选潜在内源性标志物主要影响的代谢通路
[0210]
对实施例3中获得的内源性标志物数据，通过kegg(http://www.kegg.com/)和metaboanalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)数据库分析生物学标志物所影响的代谢途径。
[0211]
结果
[0212]
经分析得出，筛选出的生物标志物主要影响体内氨基酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、甘油磷脂代谢、固醇类激素合成、卵巢类固醇生成、初级和次级胆汁酸合成以及胆汁分泌。所影响的代谢通路如图2和图3所示。
[0213]
讨论
[0214]
与现有技术中使用染料木素作用于高血脂模型、去势模型等特殊疾病模型不同，本发明选取健康动物作为模型，通过4周喂养，充分模拟了日常食源性摄入染料木素的情况，从而全面、完整地获得了在健康动物中，染料木素干扰健康雌性机体内分泌代谢通路的相关信息。
[0215]
既往研究虽然公开了染料木素具有类雌激素等效应，但本发明首次研究了其对于健康雌性机体内代谢标志物的具体影响种类和影响幅度。本发明通过大量研究，筛选出了39种内源性标志物。服用染料木素4周后，这些内源性标志物均出现了明显的上升，其水平均达到未服用组的近2倍或以上，部分标志物水平甚至达到了未服用组的百倍以上。并且，所述标志物涉及氨基酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、甘油磷脂代谢、固醇类激素合成、卵巢类固醇生成、初级和次级胆汁酸合成以及胆汁分泌等多个代谢过程。
[0216]
基于染料木素对这些内源性标志物的显著影响，本发明提供了用于健康个体，尤其是女性个体是否适宜补充染料木素或含染料木素的药物或食品的内源性标志物集合和方法。
[0217]
本发明提供的方法，其样本可来自于血浆、尿液、粪便、肝脏或卵巢。在本发明提供的内源性标志物集合中，包含了17种尿液样本可检出的内源性标志物和15种粪便样本可检出的内源性标志物，因此特别适用于无创的尿液和粪便样本的检测，取材方便，操作步骤简单。
[0218]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。