基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法

本发明属于生物传感，具体涉及一种基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法。

背景技术：

1、抗生素是一类由微生物和高等植物产生的具有多种抗病原体活性的次级代谢产物，用于治疗畜牧业和水产养殖业的细菌感染。作为一种常用的氨基糖苷类抗生素，卡那霉素可有效治疗革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。然而，卡那霉素的过度使用导致其在动物源性食品中的残留，并且食用后可能对人体健康造成巨大威胁，例如氨基糖苷类肾毒性、过敏反应和耐药性。目前，卡那霉素的检测方法主要有高效液相色谱(hplc)、液相色谱-质谱(lc-ms)和免疫分析等，但这些方法检测程序复杂，精密仪器昂贵，无法快速检测。而比色法，因其操作简单、灵敏度高和结果直观受到广泛的关注。

2、然而，本技术发明人在前期研究中发现，在当前的快速比色检测方法中，大多数检测方法属于液相检测，虽然具有一定的检测效率，并能够满足当前现场检测的需求，但仍然存在以下缺点和不足：(1)由于便捷性不足和稳定性差，液相检测方法在现场即时检测中容易受到影响；(2)这些检测方法复杂，需要多步操作才能达到最终的检测目的；(3)有些检测方法对环境要求苛刻，对试剂的保存条件有较高的要求。因此，为了实现更加高效、准确、稳定的定量检测，迫切需要开发一种固相载体检测方法以适应当前的检测需求。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种灵敏度高、操作简单、抗干扰能力强、检测范围宽和检测限低的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

3、一种基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，包括以下步骤：

4、(1)多孔fe/ceo2 hb纳米酶的制备：

5、将乙酸铈和聚乙烯吡咯烷酮加入到乙醇和水的混合溶液中，得到a溶液；将铁氰化钾溶于水中，得到b溶液；将上述的a溶液和b溶液混合，静置，得到fe-ce前驱体；将上述的fe-ce前驱体在400℃～600℃进行高温碳化，得到fe/ceo2 hb；

6、(2)纳米酶水凝胶的制备：

7、(2.1)将步骤(1)得到的fe/ceo2 hb与核酸适配体混合，进行孵育，得到fe/ceo2hb@apt；

8、(2.2)将琼脂糖水凝胶和90℃～100℃的水混合，待温度冷却至45℃～50℃后，加入步骤(2.1)得到的fe/ceo2 hb@apt，搅拌，得到纳米酶水凝胶；

9、(3)已知抗生素浓度的检测体系的制备：

10、将步骤(2.2)得到的纳米酶水凝胶分别与不同浓度的含抗生素溶液混合，然后加入醋酸钠缓冲溶液，进行孵育，再加入过氧化氢溶液和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液进行显色反应，得到标准溶液；

11、(4)空白对照体系的制备：

12、将步骤(2.2)得到的纳米酶水凝胶与醋酸钠缓冲溶液混合，进行孵育，然后加入过氧化氢溶液和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液进行显色反应，得到空白对照体系溶液；

13、(5)测定步骤(3)得到的标准溶液和步骤(4)得到的空白对照体系溶液在652nm波长下的吸光度值，得到抗生素浓度与吸光度值的检测线性关系，根据含抗生素的待测样品的吸光度值，得到含抗生素的待测样品对应的抗生素浓度。

14、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(4)中，所述空白对照体系溶液呈深蓝色，当加入含抗生素的待测样品时，体系溶液蓝色变浅，可以实现定性检测待测样品中是否含有抗生素。

15、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(5)中，当抗生素为卡那霉素时，所述核酸适配体为卡那霉素核酸适配体，所述卡那霉素核酸适配体具有seqid no.1所示的核苷酸序列，所述卡那霉素浓度与吸光度值的的检测回归方程为：

16、△a＝-0.16lgckan(nm)+1.05   (1)

17、式(1)中，△a表示吸光度值；ckan为待测溶液中卡那霉素的浓度值，该浓度值对应的单位为nm，式(1)的相关系数r2＝0.990，卡那霉素的浓度范围为0.1nm～100nm，检测限为0.05nm。

18、所述卡那霉素核酸适配体具有seq id no.1所示的核苷酸序列，具体为：

19、tgg ggg ttg agg cta agc cga

20、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(1)中，所述乙酸铈、聚乙烯吡咯烷酮和铁氰化钾的质量比为0.1～0.3∶1～2∶0.1～0.3。

21、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(2.2)中，所述fe/ceo2 hb@apt和琼脂糖水凝胶的体积比为1∶1；

22、步骤(3)中，所述标准溶液中fe/ceo2 hb的浓度为1mg/l，所述标准溶液中核酸适配体的浓度为1mm～2mm。

23、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(2.1)中，所述孵育的时间为0.5h～1h；

24、步骤(2.2)中，所述搅拌的时间为15s～30s。

25、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(3)中，所述醋酸钠溶液的浓度为0.1m～0.2m，所述过氧化氢溶液的浓度为10mm～50mm，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为2mm～5mm，所述孵育的时间为15min～30min，所述显色反应的时间为10min～30min。

26、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(4)中，所述醋酸钠溶液的浓度为0.1m～0.2m，所述过氧化氢溶液的浓度为10mm～50mm，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为2mm～5mm，所述孵育的时间为15min～30min，所述显色反应的时间为10min～30min。

27、上述的基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，优选的，步骤(3)中所述的标准溶液和步骤(4)中所述的空白对照体系溶液的ph值均控制在4。

28、本发明的基本原理是：核酸适配体通过π-π叠加和静电相互作用吸附在fe/ceo2hb纳米酶的表面，阻挡多孔fe/ceo2 hb纳米酶的催化活性位点，从而抑制多孔fe/ceo2 hb催化过氧化氢溶液分解产生羟基自由基，减弱对于底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺的氧化能力，使得传感溶液颜色由深蓝色变为蓝色。由于稀土离子的富π电子和更加灵活的配位几何结构，当加入目标污染物(如抗生素)后，导致核酸适配体-目标污染物生成的结合物不能成功的从 fe/ceo2 hb纳米酶表面解吸下来，使得传感体系溶液由蓝色变为浅蓝色。另外，核酸适配体功能化的fe/ceo2 hb@apt可提高对目标识别的选择性，由于核酸适配体与抗生素(如卡那霉素)的亲和性更好，溶液颜色变化随着抗生素(如卡那霉素)浓度的增加而变浅。得益于水凝胶良好的生物相容性和稳定性，基于上述比色分析策略，在此基础上建立一个固相载体检测平台实现抗生素(如卡那霉素)的比色检测。

29、与现有技术相比，本发明的优点在于：

30、(1)本发明公开了一种基于纳米酶水凝胶比色检测抗生素的方法，一方面，ceo2作为一种重要的稀土氧化物材料，由于其丰富的氧空位缺陷、较高的储存氧和释放氧能力以及相对容易在ce3+和ce4+之间穿梭，这些在氧化过程中是非常重要的因素，同时，金属基体和金属氰化物离子的多样性使合成的fe-ce前驱体具有理想的催化性能；然后在400℃进行高温碳化得到fe/ceo2 hb，不仅保留了fe-ce前驱体的3d和多孔结构，还获得更加丰富的氧空位，使得fe/ceo2 hb表现出优异的催化性能。另一方面，核酸适配体是单链dna，修饰核酸适配体(dna)可以显著调节纳米酶模拟活性，由于带正电荷的fe/ceo2 hb和带负电荷的dna之间的静电作用或物理障碍阻碍了底物对纳米粒子的可及性，fe/ceo2 hb的催化活性在加入dna后被明显抑制；同时，由于核酸适配体具有亲和力高、特异性识别效果好、稳定性高等优点，通过修饰适配体构建复合纳米材料有利于提高目标识别能力；并且水凝胶作为三维交联聚合物网络结构，具有良好的生物相容性，同时水凝胶作为外部环境的屏障，可以在水凝胶基质中提供相对惰性的环境，提高了材料的稳定性和功能性，是一种开发固相检测器理想的载体。因此，基于上述比色分析策略，将修饰核酸适配体后的纳米酶与水凝胶结合，建立一个比色检测抗生素的固相载体平台。本发明的方法采用的纳米酶水凝胶具有高选择性、良好的稳定性及特异性等优点，可用于快速检测抗生素。本发明的方法，通过核酸适配体和水凝胶二者相互协同，搭建新的比色检测分析平台，这是对现有比色适配体传感器的一种改进，并且选用的材料都是生物相容性较好的材料，生物毒性低，其制得的分析管可实现高效、快速检测抗生素，不需要依靠大型检测设备，具有灵敏度高、操作简单、抗干扰能力强、检测范围宽和检测限低等优点，可应用于水体中抗生素(如卡那霉素)的特异性检测，具有很好的使用价值和应用前景。

31、(2)本发明的方法，采用的高过氧化物酶催化活性的fe/ceo2 hb纳米酶，通过简单的制备方法制得，相较于天然的辣根过氧化物酶，具有成本效益低、易批量制备、易改性和优良稳定性等优点，可作为天然酶的替代品。