基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其应用

1.本发明涉及电化学传感器构建及其应用，尤其是涉及基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其在镉大米分析检测中的应用，属于功能纳米材料和化学生物传感技术领域。


背景技术：

2.重金属一般指比重大于5的金属，如镉、汞、锌、铁、镍、钴、铜、铅、铬等。随人类开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，不少有害重金属进入大气、水、土壤中存留、积累和迁移，引起环境污染，危害国民经济建设；再通过食物链进入人体，严重威胁人类健康、社会和谐发展。频繁爆发的重金属污染事件，引起公共卫生领域、广大人民群众和全社会的高度关注。因此，对浓度低的重金属离子进行高灵敏、准确、快速的现场检测，非常重要。电化学方法一直是重金属离子现场快速检测的研究重点，但存在三个方面的挑战：重金属传感器的灵敏度亟待提高；重金属传感器的小体积分析系统极度缺乏；重金属传感器的普适性亟待改善。
3.自从20年前美孚石油公司的研究人员发现介孔硅之后，近些年来对有序的介孔二氧化硅的研究已经得到越来越广泛的关注。好的介孔硅纳米载体应该同时显示多种优良的生物性能，如
①
高的可见度，
②
良好地分散性，
③
对组织活细胞的靶向特异性，
④
对货物大浓度的负载能力，
⑤
触发或控制货物的释放。这些优异的性能使得介孔硅功能复合纳米材料在生物医药、分析传感领域的应用研究取得了较大的进展。通过对其进行特定的化学修饰、生物修饰、物理修饰，在药物可控释放、分析传感检验等领域展示了广阔的应用前景。
4.本发明专利，基于封装了亚甲基蓝(mb)的氨基化纳米介孔硅材料，利用自制的带负电的氧化铟锡(ito)电化学池设计了一种普适性的重金属离子电化学传感器。其主要的原理如下：利用与重金属离子具有良好作用的适配体，当其存在时引发适配体与纳米介孔硅复合材料的脱离，从而mb被释放。释放的mb信号分子被带负电的ito电极捕获，从而将大量的信号分子聚集于电极表面实现重金属离子的检测。利用上述所提分析检测原理，基于新型ito电化学系统，我们针对6种不同的重金属离子验证本专利中所设计的重金属离子电化学传感器的普适性，随后选择镉离子(cd
2+
)作为主要研究对象，对不同浓度的cd
2+
进行了分析研究，并将该传感器应用于镉大米的分析检测，为重金属离子分析研究领域的发展提供了新思路。本专利主要有助于解决以下三个方面的问题：重金属传感器的普适性；重金属传感器的灵敏度；重金属传感器的小体积分析系统。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其应用。
6.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其应用，具体步骤如下：
7.(1)纳米介孔硅材料的制备及功能化
8.将0.5～1.0g(2～2.7mmol)十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于200～480ml的二次蒸馏水中，加入1.0～3.5ml 1.0～2.0mol/l氢氧化钠水溶液，该混合溶液被放置于20～40℃环境中充分搅拌，搅拌均匀后将温度提高到60～80℃并额外搅拌1～2h，再以0.5～1.0ml/min的速度逐滴加入原硅酸酯(teos)(2.0～5.0ml 10.0～21.9mmol)，继续搅拌直到看到大量白色物质生成，用甲醇洗涤后放入真空干燥箱中50～100℃干燥6～12h，此时得到的物质命名为a1。随后，称取0.5～1.0g a1分散到60～80ml甲苯中，然后加入1～5ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，混合均匀后在n2气氛下回流过夜，过滤，通过甲苯和甲醇交替洗涤，然后将固体放入15～25℃真空干燥箱中干燥，得固体a2。称取0.5～1.0g已合成的固体a2加入50～100ml甲醇和0.5～0.75ml浓盐酸的混合溶液，于37～50℃搅拌4～6h，过滤后室温下真空干燥10～12h，得固体a3，即纳米介孔硅材料。称取5～10mg a3粉末于0.5～1.0ml水中，超声分散1.0～1.5h，即得到分散良好的介孔硅溶液(浓度：5～10mg/ml)。
9.(2)纳米介孔硅@亚甲基蓝复合材料的制备
10.取10～100μl 0.1～1mm亚甲基蓝溶液(mb)添加到上述介孔硅溶液中，搅拌下孵育6～12h，静置10～30min后将得到的悬浮液离心(1～5min，1000～5000rpm)，之后用pbs(10mm，ph 7.0)洗涤3次，最后将获得的沉淀物溶于0.5～1.0ml pbs(10mm，ph 7.0)中。
11.(3)重金属离子适配体包覆纳米介孔硅@亚甲基蓝复合材料的制备
12.将步骤(2)中得到的纳米介孔硅@亚甲基蓝复合材料分散到含有5～10μm重金属离子适配体的0.5～1.0ml(10mm，ph 7.0)溶液中，混匀后在1～4℃下放置3～6h，混合液离心(1～5min，2000～5000rpm)，并用pbs洗涤1～3次。然后，将得到包覆材料分散在0.5～1.0ml pbs(10mm，ph 7.0)中。
13.(4)承载小体积样本电化学基底的构建
14.将购买的ito整块电极用钻石刀隔成0.5～1cm
×
0.5～1cm矩阵，再将分割好的pcr管套用胶黏在ito矩阵中，简单的ito电化学池就制备好。随后，ito表面依次用丙酮，无水乙醇，蒸馏水清洗数次，除去电极表面的杂质，用氮气干燥电极。接着将电极放入0.5～1.0mol/l hcl中浸泡5～10min，再用蒸馏水洗净电极表面。将清洗干净后的电极浸入0.5～1∶0.5～1∶2～5(v/v/v)h2o2/nh3·
h2o/h2o的混合溶液中反应0.5～1h，即可得到表面接上-oh的ito，接着用二次蒸馏水将电极表面清洗干净，用n2干燥电极。
15.(5)普适型重金属离子电化学传感器的研究
16.在4～12℃环境中，取100～500μl pbs(100mm，ph 7.0)放入步骤(5)ito电化学池中，分别取1～5μl不同重金属离子加入并混合，随后，加入30～45μl步骤(3)中复合材料，利用方波伏安法(swv)不断地收集释放的mb分子的信号值。
17.基于以上(1)-(5)步骤，针对6种不同的重金属离子(如cd
2+
，hg
2+
，pb
2+
，cu
2+
，ag2和tl
+
)，通过改变步骤(3)中适配体类型，其它步骤不变，可实现对6种不同重金属离子的检测，验证所制备传感器的普适性。
18.基于以上(1)-(5)步骤，选择cd
2+
作为研究对象，步骤(3)中所用适配体为cd
2+
适配体，通过改变步骤(5)中cd
2+
浓度(最终浓度：0，0.01，0.03，0.05，0.1，0.5，1，3，5，8，10，20和
30μm)，其它步骤不变，可实现对cd
2+
的检测，验证其灵敏度。
19.其中所用到的dna链如下：
[0020][0021][0022]
利用上述基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其应用，利用方波伏安法(square wave voltammetry)，设置电位范围为-0.35～-0.1v，振幅为0.025v。利用所制备ito电化学系统对亚甲基蓝(mb)的电化学响应验证本专利涉及方法的普适性，并以cd
2+
作为研究对象，通过改变cd
2+
浓度获得一系列不同浓度cd
2+
对应的电流大小，建立电流响应与cd
2+
浓度之间的线性关系，根据两者之间的线性关系，确定镉大米样品中cd
2+
浓度(含量)。
[0023]
发明原理：本发明是基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其应用，基于封装mb作为电子转移介质的氨基化纳米介孔硅材料，设计了一种普适型重金属离子电化学传感器。利用与重金属离子具有良好作用的dna适体，当其存在时引发适体与介孔硅复合材料的脱离，从而mb被释放。释放的mb信号分子被带负电的ito电极捕获，从而将大量的信号分子聚集于电极表面实现重金属离子的检测。本专利利用上述所提分析检测原理，基于新型ito电化学系统不仅实现了不同浓度cd
2+
的分析检测，而且为实际镉大米样本中cd
2+
的高灵敏检测提供了一种新的思路。
[0024]
现有技术相比，本发明的优点在于：本发明基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其应用，显然，在一定浓度范围内，cd
2+
浓度越大，复合材料上的cd
2+
适配体通过特异性结合作用与cd
2+
结合的越多，介孔硅中的mb释放的越多，电流响应越明显；同理，cd
2+
浓度越小，结合的适配体越少，电流响应越微弱。实验结果表明，电流的大小与cd
2+
浓度在一定范围内呈现线性关系，成功实现对cd
2+
的分析检测。其优点在于：
[0025]
(1)优秀的普适性。本专利针对6种金属离子(cd
2+
，hg
2+
，pb
2+
，cu
2+
，ag
+
和tl
+
)进行了研究，通过引入相对应的适配体，证明了该重金属离子电化学生物传感器具有普适性，应用价值高。
[0026]
(2)性能优越的ito电化学池。利用简单的ito玻璃和常见的pcr管构建了一种可以同时充当电解质溶液容器和工作电极的ito电化学池，制备容易，使用方便，适用于小体积样本直接分析，具有极大的优势。
[0027]
(3)高灵敏度。本发明基于cd
2+
与其适配体的特异性结合作用以及ito电极对mb的感知作用，得到一条线性方程：电流响应对cd
2+
浓度线性相关方程为y＝0.2874x+0.7603，r2＝0.9923，线性范围为0.01～10μm，检测限为0.0026μm(s/n＝3)；说明该电化学传感器可对cd
2+
实现高灵敏度检测。
[0028]
(4)高特异性。采用cd
2+
适配体进行电化学传感器的制作，对cd
2+
检测：其他对照离
子如hg
2+
，pb
2+
，cu
2+
，ag
+
和tl
+
等对体系均无干扰，有助于实现复杂样本镉大米中cd
2+
的分析检测。
[0029]
(5)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
[0030]
(6)制备与检测方法试剂用量少、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对cd
2+
的高灵敏检测。
[0031]
综上所述，本发明是基于纳米介孔硅复合材料的普适型重金属离子电化学传感器构建及其应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度cd
2+
的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
[0032]
图1为本发明传感器对不同金属离子的响应的实验图；
[0033]
图2为本发明传感器对cd
2+
分析检测的实验图；
[0034]
图3为本发明传感器对不同浓度cd
2+
的电流响应对浓度的校准曲线图；
[0035]
图4为本发明传感器对cd
2+
的特异性实验图。
[0036]
图5为本发明传感器对复杂样本中cd
2+
分析检测实验图。
具体实施方式
[0037]
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0038]
实施例1 所制备重金属离子电化学传感器普适性验证
[0039]
(1)纳米介孔硅材料的制备及功能化
[0040]
将1.0g(2.7mmol)十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于480ml的二次蒸馏水中，加入3.5ml 2.0mol/l氢氧化钠水溶液，该混合溶液被放置于40℃环境中充分搅拌，搅拌均匀后将温度提高到80℃并额外搅拌2h，再以1ml/min的速度逐滴加入原硅酸酯(teos)(5.0ml21.9mmol)，继续搅拌直到看到大量白色物质生成，用甲醇洗涤后放入真空干燥箱中100℃干燥12h，此时得到的物质命名为a1。随后，称取1.0g a1分散到80ml甲苯中，然后加入5ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，混合均匀后在n2气氛下回流过夜，过滤，通过甲苯和甲醇交替洗涤，然后将固体放入25℃真空干燥箱中干燥，得固体a2。称取1.0g已合成的固体a2加入100ml甲醇和0.75ml浓盐酸的混合溶液，于50℃搅拌6h，过滤后室温下真空干燥12h，得固体a3，即纳米介孔硅材料。称取10mg a3粉末于1ml水中，超声分散1.5h，即得到分散良好的介孔硅溶液(浓度：10mg/ml)。
[0041]
(2)纳米介孔硅@亚甲基蓝复合材料的制备
[0042]
取100μl 1.0mm亚甲基蓝溶液(mb)添加到上述介孔硅溶液中，搅拌下孵育12h，静置30min后将得到的悬浮液离心(5min，5000rpm)，之后用pbs(10mm，ph 7.0)洗涤3次，最后将获得的沉淀物溶于1.0ml pbs(10mm，ph 7.0)中。
[0043]
(3)重金属离子适配体包覆纳米介孔硅@亚甲基蓝复合材料的制备
[0044]
将步骤(2)中得到的纳米介孔硅@亚甲基蓝复合材料分散到含有10μm重金属离子适配体的1.0ml(10mm，ph 7.0)溶液中，混匀后在4℃下放置6h，混合液离心(5min，5000rpm)，并用pbs洗涤3次。然后，将得到包覆材料分散在1.0ml pbs(10mm，ph 7.0)中。
[0045]
(4)承载小体积样本电化学基底的构建
[0046]
将购买的ito整块电极用钻石刀隔成1cm
×
1cm矩阵，再将分割好的pcr管套用胶黏在ito矩阵中，简单的ito电化学池就制备好。随后，ito表面依次用丙酮，无水乙醇，蒸馏水清洗数次，除去电极表面的杂质，用氮气干燥电极。接着将电极放入1.0mol/l hcl中浸泡10min，再用蒸馏水洗净电极表面。将清洗干净后的电极浸入1∶1∶5(v/v/v)h2o2/nh3·
h2o/h2o的混合溶液中反应1h，即可得到表面接上-oh的ito，接着用二次蒸馏水将电极表面清洗干净，用n2干燥电极。
[0047]
(5)普适型重金属离子电化学传感器的研究
[0048]
在4℃环境中，取500μl pbs(100mm，ph 7.0)放入步骤(5)ito电化学池中，分别取5μl不同重金属离子加入并混合，随后，加入45μl步骤(3)中复合材料，利用方波伏安法(swv)不断地收集释放的mb分子的信号值。
[0049]
基于以上(1)-(5)步骤，针对6种不同的重金属离子(如cd
2+
，hg
2+
，pb
2+
，cu
2+
，ag
+
和tl
+
)，通过改变步骤(3)中适配体类型，其它步骤不变，可实现对6种不同重金属离子的检测，验证所制备传感器的普适性。
[0050]
如图1所示，当无dna存在时，由于大量游离的mb存在，显示出最大的电化学信号；当无重金属离子的时候，dna将mb全部封闭在纳米介孔材料中，因此电化学信号较小或是基本没有电化学信号；当有不同重金属离子存在时，能够观察到一系列较好的电化学信号，不管选用哪一种重金属离子及其适配体参与传感策略的构建，都能够引起纳米介孔硅中mb分子的释放，说明我们的传感策略具有极好的普适性，具有较强的应用价值。
[0051]
实施例2 cd
2+
分析检测
[0052]
基于以上(1)-(5)步骤，选择cd
2+
作为研究对象，步骤(3)中所用适配体为cd
2+
适配体，其它步骤不变，考察该传感器在cd
2+
分析检测中的应用。如图2所示，在10μm cd
2+
存在的条件下，具有较好的电化学信号，在无cd
2+
存在的条件下，电化学信号可以忽略，说明该传感器能够较好地实现cd
2+
的分析检测。
[0053]
基于以上(1)-(5)步骤，选择cd
2+
作为研究对象，步骤(3)中所用适配体为cd
2+
适配体，通过改变步骤(5)中cd
2+
浓度(最终浓度：0，0.01，0.03，0.05，0.1，0.5，1，3，5，8，10，20和30μm)，其它步骤不变。如图3所示，随着cd
2+
浓度的增加，电流强度不断增加，且传感器对cd
2+
的电流响应与浓度呈良好的线性关系，传感器的电流响应对cd
2+
浓度数目线性相关方程为y＝0.2874x+0.7603，r2＝0.9923，线性范围为0.01～10μm，检测限为0.0026μm(s/n＝3)，说明传感器对cd
2+
实现高灵敏检测。
[0054]
实施例3 选择性实验
[0055]
如图4所示，基于以上(1)-(5)步骤，选择cd
2+
作为研究对象，步骤(3)中所用适配体为cd
2+
适配体，对比于其他的重金属离子，如cd
2+
，hg
2+
，pb
2+
，cu
2+
，ag
+
和tl
+
，该传感器只对cd
2+
具有较好响应，具有较好的选择性。
[0056]
实施例4 镉大米样本中的测试
[0057]
镉大米研磨后，将其静置与1.0mm的盐酸溶液中过夜，过滤并离心后取稀释后的上清液(10％)进行实验，随后采用浓度添加实验进行测试。如图5所示，随着不同浓度的cd
2+
添加到样本中(最终浓度：0，0.03，0.1，1～和5μm)，本专利中所涉及的传感器都能够很好地感知cd
2+
，说明该传感器能够较好地应用于实际cd
2+
样本分析。
[0058]
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的
普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。