一种基于凝集素与适配体双识别同时检测三种致病菌的方法

1.本发明属于食品检测技术领域，特别是涉及一种基于凝集素与适配体双识别同时检测三种致病菌的方法。


背景技术：

2.表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,sers)技术作为一种生物指纹识别技术，近年来为快速、准确检测致病菌提供了新的研究视角。1974年，fleischmann等人进行吡啶拉曼光谱检测时发现，将吡啶吸附在具有粗糙表面的银电极上，可以观察到特征峰峰强和峰形更优异的吡啶分子拉曼光谱。1977年，van duyne课题组在fleischmann等人实验基础上通过系统计算发现，当单位吡啶分子吸附在粗糙银电极表面上，所测得拉曼光谱信号强度要比直接检测吡啶分子所得的信号强度强约105～106倍。对于致病菌的检测主要分为有标记检测和无标记检测，无标记检测主要是通过致病菌与纳米粒子的结合观察细菌的指纹图谱，存在难以调控，重复性差的特点，并且，致病菌之间的指纹图谱差别很微弱，有些很难依据致病菌的sers指纹图谱直接区分，增加了现场检测的难度。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种基于凝集素与适配体双识别同时检测三种致病菌的方法，通过三种具有高强度sers信号且相互无干扰的sers探针与致病菌进行特异性结合，并通过与致病菌具有广泛的捕获功能的凝集素功能化的磁性纳米粒子与致病菌一起形成“三明治”夹心结构，解决了现有提出的问题。
4.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
5.本发明为一种基于凝集素与适配体双识别同时检测三种致病菌的方法，包括：
6.stp1、将凝集素磁性纳米粒子与三种不同类型的致病菌共同孵育1h，在外加磁场的作用下，用pbs洗涤除去未结合的致病菌；
7.stp2、制备适配体功能化的三种不同类型的sers探针，然后将其与捕获有致病菌的凝集素磁性纳米粒子共同孵育30min,形成“三明治”夹心结构进行三种不同类型致病菌的同时定量检测；
8.所述三种sers探针包括au-4 mpba@ag-p1 sers探针、au@dtnb@ag-p2sers探针和au@ag@pb@ag-p3 sers探针；
9.stp3、用pbs洗涤3次去除未结合的sers探针，磁分离后原体积复溶，并使用便携式拉曼光谱仪进行分析；在stp3中，采用200mw功率的785nm激光记录拉曼光谱，积分时间为500ms，累积3次记录的所述拉曼光谱是重复测5次的平均值，且所有拉曼光谱都进行基线校正；
10.所述stp1和stp3中的pbs浓度为0.1m、ph＝7.4；0.1m、ph＝7.4的pbs溶液的配制具体为：精确称量7.8g磷酸二氢钠(nah2po4),加入475ml去离子水，搅拌充分溶解，然后称2.0g naoh配制成1.0m的naoh溶液调上述溶液的ph至7.4，转移至500ml的容量瓶中，再添加去离
子水至500ml，充分混合备用。
11.进一步地，三种致病菌的分别为大肠杆菌(e.coil)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)；
12.三种适配体分别为大肠杆菌适配体(p1:5
’‑
cooh-gca atg gta cgg tac ttc ctc ggc acg ttc tca gta gcg ctc gct ggt cat ccc aca gct acg tca aaa gtg cac gct act ttg cta a-3’)；
13.金黄色葡萄球菌适配体(p2:5
’‑
cooh-atc cgt cac acc tgc tct act ggc cgg ctc agc atg act aag aag gaa gtt atg tgg tgt tgg ctc ccg tat-3’)；
14.铜绿假单胞菌适配体(p3:5'-sh-ccc ccg ttg ctt tcg ctt ttc ctt tcg ctt ttg ttc gtt tcg tcc ctg ctt cct ttc ttg-3')；
15.凝集素磁性纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
16.stp01、氨基改性磁性纳米粒子(fe3o4@sio
2-nh2)的制备：
17.stp11、将2.1gfecl3·
6h2o、4g无水naac和1g聚乙二醇加入到60ml的乙二醇中，搅拌完全溶解后置于100ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在195-198℃下反应8h；
18.stp12、冷却后用水和乙醇交叉洗涤数次，于真空干燥箱中60℃干燥得到fe3o4nps；
19.stp13、取200gfe3o4nps加入到60ml无水乙醇和15ml水中，并超声充分分散；
20.stp14、依次加入3ml氨水、0.4mlteos后搅拌1.5h，最后用水和乙醇交叉洗涤数次，60℃干燥6h，得到二氧化硅包覆的磁性纳米粒子fe3o4@sio2；
21.stp15、将上述得到的fe3o4@sio2分散到100ml含5ml aptes的无水乙醇中，机械搅拌混合物的同时60℃回流12h；最后磁铁收集，并用水和乙醇洗涤数次，真空干燥后得到氨基修饰的磁性材料，产品记为amnps；
22.stp02、硼酸修饰fe3o4@sio2的制备：
23.将100mg的amnps溶50ml甲醇中，加入200mg fpba和250mg nabh3cn，超声分散后，室温搅拌24h，产物用水和甲醇交叉洗涤数次，60℃真空干燥过夜，得到的产物称为fpba-amnps；
24.stp03、将凝集素(cona)溶解在浓度为0.1m、ph为7.4的pbs中配制成浓度为5mg/100ml的储备溶液；将100mg的fpba-amnps加入储备溶液中，室温机械搅拌15min,然后储存在4℃的环境中即可。
25.三种sers探针的制备均包括金纳米粒子的制备：
26.首先取100ml 0.01％haucl4·
4h2o(aq)于三颈烧瓶中，置于回流装置，磁力搅拌加热至沸腾；然后迅速加入1ml 3％的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌30min，此时溶液为酒红色；最后，将所得金纳米粒子(aunps)自然冷却至室温，装于干净的器皿中，使用前4℃保存。
27.au-4 mpba@ag-p1 sers探针的制备还包括将1ml1mm的4-mpba添加到10ml所制备的aunps中；磁力搅拌反应15min后离心弃上清，用去离子水重新溶解，得到au-4 mpba；然后依次加入1ml20 mm的agno3和1ml0.02g/ml的抗坏血酸；磁力搅拌反应10min后，通过离心去除未反应的过量材料并重新溶解在去离子水中以获得au-4 mpba@agnps，与适配体p1共同震荡孵育10min,得到适配体功能化的au-4 mpba@ag-p1npssers探针。
28.au@dtnb@ag-p2 sers探针的制备还包括将1ml10mm的dtnb添加到10ml所制备的aunps中；磁力搅拌反应15min后离心弃上清，用去离子水重新溶解，得到au-dtnb；然后依次
加入1ml20mm的agno3和1ml0.02g/ml的抗坏血酸；磁力搅拌反应10min后，通过离心去除未反应的过量材料并重新溶解在去离子水中以获得au-dtnb@agnps，与适配体p2共同震荡孵育10min,得到适配体功能化的au-4 dtnb@ag-p2npssers探针。
29.au@ag@pb@ag-p3 sers探针的制备还包括将1ml0.1 g/ml的抗坏血酸添加到10ml所制备的aunps中；磁力搅拌反应15min后，加入1ml20mm的agno3继续磁力搅拌15min，得到au@ag纳米粒子；然后依次加入1ml1mm的fecl3
·
6h2o和1ml1mm的k4[fe(cn)6]
·
3h2o，磁力搅拌反应10min后，离心去除上清液在加入200μl10mm的agno3磁力搅拌10min，离心除去未反应的过量材料并重新溶解在去离子水中以获得au@ag@pb@agnps,与适配体p3共同震荡孵育10min,得到适配体功能化的au@ag@pb@ag-p3npssers探针。
[0030]
在我们的实验中，使用休克冷冻的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为模型。细菌细胞在nutrient broth(nb)固体培养基上，37℃培养24小时。然后，用5ml的无菌水洗涤细菌，并在4℃4000rpm下离心收集5ml细菌混悬液，然后用pbs洗涤三次。最后，用pbs缓冲液将细菌细胞稀释至所需浓度，使用紫外分光光度计od600进行测定。
[0031]
便携式表面增强拉曼光谱仪的激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400-2500cm-1
，积分时间为500ms，每个样品重复扫描3次后取平均图谱，并进行了基线校正。将2ml cona@fpba-amnps和1ml细菌悬液(浓度因实验目的不同而不同)加入到5ml离心管中。然后将混合物在摇动下孵育1小时。之后，细菌/cona@fpba-amnps复合物在磁场下被分离，并用pbs洗涤以去除未结合的细菌。随后，将1ml不同的sers探针(au-mpba@ag-p1，au-dtnb@ag-p2，au@ag@pb@ag-p3)添加到上述磁分离后的细菌/cona@fpba-amnps复合物中。将得到的sers探针/细菌/cona@fpba-amnps三明治结构进行磁分离，用pbs缓冲液洗涤3次，然后用1ml pbs复溶并用便携式拉曼仪进行致病菌的定量检测。
[0032]
本发明具有以下有益效果：
[0033]
本发明采用三种具有高强度sers信号且相互无干扰的sers探针与致病菌进行特异性结合，并通过与致病菌具有广泛的捕获凝集素功能化的磁性纳米粒子与致病菌一起形成“三明治”夹心结构；且利用硼酸亲和与凝集素相连，制备过程简单，稳定性好，具有极低检出限，为致病菌在sers检测中达到现场实时检测提供基础研究，选用三种互不干扰的sers探针为从复杂基质中同时检出三种不同类型的致病菌提供了技术保障。
[0034]
1、本发明旨在可以对目标致病菌进行特异性结合，并且通过强的拉曼信号对复杂样品中三种不同类型的致病菌进行同时定量检测，并且由于凝集素功能化的磁性材料对致病菌进行捕获，提高了富集分离的效率，可以使整个检测过程在1h内完成。
[0035]
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037]
图1为基于双识别配体对三种食源性致病菌的sers检测原理示意图；
[0038]
图2为au-mpba@ag-p1，au-dtnb@ag-p2，au@ag-pb@ag-p3三种sers探针的制备原理
示意图；
[0039]
图3为au-mpba@agnps、au-dtnb@agnps的表征图；
[0040]
图4(a)为aunps的tem图；
[0041]
图4(b)为au@agnps的tem图；
[0042]
图4(c)为au@ag-pbnps的tem图；
[0043]
图4(d)为aunps的粒径分布图；
[0044]
图4(e)为au@agnps的粒径分布图；
[0045]
图4(f)为au@ag-pb nps的粒径分布图；
[0046]
图4(g)为au@ag-pb@ag nps的tem图；
[0047]
图4(h)为au@ag-pb@ag nps的haadf-stem图像，au(紫色)、ag(绿色)、fe(黄色)、k(红色)；
[0048]
图4(i)为au@ag-pb@ag nps的粒径分布图；
[0049]
图5a(a)为fe3o4的tem；
[0050]
图5a(b)fe3o4@sio2的tem；
[0051]
图5a(c)为fe3o4的sem；
[0052]
图5a(d)为fe3o4@sio2的sem；
[0053]
图5b为fe3o4、fe3o4@sio2、amnp、fpba-amnps的ft-ir光谱；
[0054]
图5c为fe3o4、fe3o4@sio2、fpba-amnps的xrd光谱；
[0055]
图5d为fe3o4和fpba-amnps的xps光谱；
[0056]
图6(a)为fe3o4、fe3o4@sio2、fpba-amnps的磁滞曲线；
[0057]
图6(b)为fpba-amnps对cona的吸附平衡和模型拟合；
[0058]
图6(c)为fpba-amnps对cona结合的scatchard拟合数据；
[0059]
图6(d)为fpba-amnps对cona吸附的再生能力；
[0060]
图7(a)为au-dtnb@ag、au-mpba@ag、au@ag-pb@ag以及三种sers探针的混合物的拉曼光谱；
[0061]
图7(b)为au-dtnb@ag、au-mpba@ag和au@ag-pb@ag的三种sers探针混合检测不同浓度的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的三种混合菌的拉曼光谱；
[0062]
图7(c)为混合检测中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、单核细胞李斯特菌、伤寒杆菌和志贺氏博格迪的sers信号比较；
[0063]
图7(d)为1078cm-1
处的拉曼峰强度与金黄色葡萄球菌浓度的关系(n＝5)；
[0064]
图7(e)为1334cm-1
处的拉曼峰强度与大肠杆菌浓度的关系(n＝5)；
[0065]
图7(f)为2081cm-1
处的拉曼峰强度与铜绿假单胞菌浓度的关系(n＝5)。
具体实施方式
[0066]
一种基于凝集素与适配体双识别的同时检测三种致病菌的方法，包括：
[0067]
stp1、将凝集素磁性纳米粒子与三种不同类型的致病菌共同孵育1h，在外加磁场的作用下，用浓度为0.1m，ph＝7.4的pbs洗涤除去未结合的致病菌；通过凝集素磁性纳米粒子与致病菌的结合实现对致病菌的有效富集、分离；0.1m、ph＝7.4的pbs溶液的配制具体为：精确称量7.8g磷酸二氢钠(nah2po4),加入475ml去离子水，搅拌充分溶解，然后称
2.0gnaoh配制成1.0m的naoh溶液调上述溶液的ph至7.4，转移至500ml的容量瓶中，再添加去离子水至500ml，充分混合备用。
[0068]
三种致病菌的分别为大肠杆菌(e.coil)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)；
[0069]
stp2、制备适配体功能化的三种不同类型的sers探针，然后将其与捕获有致病菌的凝集素磁性纳米粒子共同孵育30min,形成“三明治”夹心结构进行三种不同类型致病菌的同时定量检测；
[0070]
三种适配体分别为：
[0071]
大肠杆菌适配体(5
’‑
cooh-gca atg gta cgg tac ttc ctc ggc acg ttc tca gta gcg ctc gct ggt cat ccc aca gct acg tca aaa gtg cac gct act ttg cta a-3’)；
[0072]
金黄色葡萄球菌适配体(5
’‑
cooh-atc cgt cac acc tgc tct act ggc cgg ctc agc atg act aag aag gaa gtt atg tgg tgt tgg ctc ccg tat-3’)；
[0073]
铜绿假单胞菌适配体(5'-sh-ccc ccg ttg ctt tcg ctt ttc ctt tcg ctt ttg ttc gtt tcg tcc ctg ctt cct ttc ttg-3')；
[0074]
三种sers探针包括au-4 mpba@ag-p1 sers探针、au@dtnb@ag-p2 sers探针和au@ag@pb@ag-p3 sers探针；
[0075]
stp3、用浓度为0.1m，ph＝7.4的pbs洗涤3次去除未结合的sers探针，磁分离后原体积复溶，并采用200mw功率的785nm激光记录拉曼光谱，积分时间为500ms，累积3次；记录的拉曼光谱是重复测5次的平均值，且所有拉曼光谱都进行基线校正析。
[0076]
在我们的实验中，使用休克冷冻的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为模型。细菌细胞在nutrient broth(nb)固体培养基上，37℃培养24小时。然后，用5ml的无菌水洗涤细菌，并在4℃4000rpm下离心收集5ml细菌混悬液，然后用pbs洗涤三次。最后，用pbs缓冲液将细菌细胞稀释至所需浓度，使用紫外分光光度计od600进行测定。
[0077]
便携式表面增强拉曼光谱仪的激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400-2500cm-1
，积分时间为500ms，每个样品重复扫描3次后取平均图谱，并进行了基线校正。将2ml cona@fpba-amnps和1ml细菌悬液(浓度因实验目的不同而不同)加入到5ml离心管中。然后将混合物在摇动下孵育1小时。之后，细菌/cona@fpba-amnps复合物在磁场下被分离，并用pbs洗涤以去除未结合的细菌。随后，将1ml不同的sers探针(au-mpba@ag-p1，au-dtnb@ag-p2，au@ag@pb@ag-p3)添加到上述磁分离后的细菌/cona@fpba-amnps复合物中。将得到的sers探针/细菌/cona@fpba-amnps三明治结构进行磁分离，用pbs缓冲液洗涤3次，然后用1ml pbs复溶并用便携式拉曼仪进行致病菌的定量检测。
[0078]
凝集素磁性纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
[0079]
stp01、氨基改性磁性纳米粒子(fe3o4@sio
2-nh2)的制备：
[0080]
stp11、将2.1gfecl3·
6h2o、4g无水naac和1g聚乙二醇加入到60ml的乙二醇中，搅拌完全溶解后置于100ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在195-198℃下反应8h；
[0081]
stp12、冷却后用水和乙醇交叉洗涤数次，于真空干燥箱中60℃干燥得到fe3o4nps；
[0082]
stp13、取200gfe3o4nps加入到60ml无水乙醇和15ml水中，并超声充分分散；
[0083]
stp14、依次加入3ml氨水、0.4mlteos后搅拌1.5h，最后用水和乙醇交叉洗涤数次，
60℃干燥6h，得到二氧化硅包覆的磁性纳米粒子fe3o4@sio2；
[0084]
stp15、将上述得到的fe3o4@sio2分散到100ml含5ml aptes的无水乙醇中，机械搅拌混合物的同时85℃回流12h；最后磁铁收集，并用水和乙醇洗涤数次，真空干燥后得到氨基修饰的磁性材料，产品记为amnps；
[0085]
stp02、硼酸修饰fe3o4@sio2的制备：
[0086]
将100mg的amnps溶50ml甲醇中，加入200mg fpba和250mg nabh3cn，超声分散后，室温搅拌24h，产物用水和甲醇交叉洗涤数次，60℃真空干燥过夜，得到的产物称为fpba-amnps；
[0087]
stp03、将凝集素(cona)溶解在浓度为0.1m、ph为7.4的pbs中配制成浓度为5mg/100ml的储备溶液；将100mg的fpba-amnps加入储备溶液中，室温机械搅拌15min,然后储存在4℃的环境中即可。
[0088]
三种sers探针的制备均包括金纳米粒子的制备：
[0089]
首先取100ml 0.01％haucl4·
4h2o(aq)于三颈烧瓶中，置于回流装置，磁力搅拌加热至沸腾；然后迅速加入1ml 3％的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌30min，此时溶液为酒红色；最后，将所得金纳米粒子(aunps)自然冷却至室温，装于干净的器皿中，使用前4℃保存。
[0090]
au-4 mpba@ag-p1 sers探针的制备还包括将1ml1mm的4-mpba添加到10ml所制备的aunps中；磁力搅拌反应15min后离心弃上清，用去离子水重新溶解，得到au-4 mpba；然后依次加入1ml20 mm的agno3和1ml0.02g/ml的抗坏血酸；磁力搅拌反应10min后，通过离心去除未反应的过量材料并重新溶解在去离子水中以获得au-4 mpba@agnps，与适配体p1共同震荡孵育10min,得到适配体功能化的au-4 mpba@ag-p1npssers探针。
[0091]
au@dtnb@ag-p2 sers探针的制备还包括将1ml10mm的dtnb添加到10ml所制备的aunps中；磁力搅拌反应15min后离心弃上清，用去离子水重新溶解，得到au-dtnb；然后依次加入1ml20mm的agno3和1ml0.02g/ml的抗坏血酸；磁力搅拌反应10min后，通过离心去除未反应的过量材料并重新溶解在去离子水中以获得au-dtnb@agnps，与适配体p2共同震荡孵育10min,得到适配体功能化的au-4 dtnb@ag-p2npssers探针。
[0092]
au@ag@pb@ag-p3 sers探针的制备还包括将1ml0.1 g/ml的抗坏血酸添加到10ml所制备的aunps中；磁力搅拌反应15min后，加入1ml20mm的agno3继续磁力搅拌15min，得到au@ag纳米粒子；然后依次加入1ml1mm的fecl3
·
6h2o和1ml1mm的k4[fe(cn)6]
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3h2o，磁力搅拌反应10min后，离心去除上清液在加入200μl10mm的agno3磁力搅拌10min，离心除去未反应的过量材料并重新溶解在去离子水中以获得au@ag@pb@agnps,与适配体p3共同震荡孵育10min,得到适配体功能化的au@ag@pb@ag-p3npssers探针。
[0093]
au@ag@pb@ag-p3 sers探针在生物静默区有拉曼信号，该sers探针在2081cm-1
处显示出一个强烈而尖锐的单一振动峰，该峰与主要内源性生物分子产生的复杂多条带拉曼信号完全分离；
[0094]
因此，au-4mpba@ag-p1 sers探针、au@dtnb@ag-p2 sers探针和au@ag@pb@ag-p3 sers探针三者之间的特征峰，无相互干扰，当采用适配体功能化上述纳米粒子得到可以特异性识别致病菌的sers探针，就可以用于标记且定量检测三种不同类型的致病菌。金核银壳双金属纳米粒子兼具au的均匀性、稳定性以及ag的较强sers活性，拉曼报告分子被包裹在双金属之间，则核壳的间隙中会产生具有更好信号增强的“热点”结构，因此所选用的三
种不同的sers探针具有拉曼信号强，稳定性高和重复性好的特点。
[0095]
通过图1可知，图1表明用于检测致病菌的sers传感器的构建是基于cona修饰的磁性纳米粒子作为通用细菌捕获探针和对致病菌有特异性识别的适配体修饰的三种不同金属纳米粒子作为识别探针组合成“三明治”夹心结构。sers检测致病菌依赖于cona功能化磁性纳米作为捕获探针和适配体修饰金属纳米粒子作为特异性的识别探针，凝集素的功能类似与捕获抗体，但是凝集素较抗体而言更便宜和对细菌具有广谱的捕获能力，首先样品中的致病菌被cona修饰的磁性纳米粒子在外加磁场的作用下被捕获，分离。然后，分别添加适配体修饰的au-mpba@ag-p1，au-dtnb@ag-p2，au@ag-pb@ag-p3三种sers探针并孵育形成“三明治”夹心结构。最后，再通过磁分离，收集夹心结构，用便携式拉曼光谱仪检测三种不同类型的致病菌，这不仅可以大大提高捕获效率，同时兼顾了特异性和检测的灵敏度。
[0096]
本发明提供的au@ag@pb@agnps，其在在“生物静默区”有着非常强的拉曼信号，且使用了三种相互无干扰的sers探针，实现了在复杂样品中同时检测三种不同类型致病菌的目的，其最低检出限可以达到1cfu/ml。
[0097]
如图2，具有较高sers活性的agnps的颗粒大小不均匀，导致sers增强不稳定，而分布均匀的aunps的sers活性较低。具有两种金属的au@ag核壳纳米粒子具有高而稳定的sers活性，而且由于拉曼报告分子夹杂在核壳的缝隙中，在双金属的协同作用下，形成了一个具有更强局部等离子体共振效应的“热点”结构。因此我们制备了au-mpba@ag-p1，au-dtnb@ag-p2，au@ag-pb@ag-p3三种sers探针。
[0098]
如图3，au-mpba@ag和au-dtnb@ag sers探针的设计和制造主要是将拉曼报告剂mpba/dtnb附着在aunps的表面，然后在其表面覆盖一层银壳。首先，通过投射电子显微镜(tem)对纳米粒子进行了表征。图3a显示，aunps分布良好，尺寸约为19纳米(图3d)。图3b是sers探针的tem，它具有明显的核壳结构，尺寸相对均匀，平均尺寸约为33纳米(图3e)。不同纳米颗粒的u-vis光谱，如图3c所示，显示了au-mpba(525纳米)与aunps(520纳米)的红移；这一变化是由引入的mpba的共轭效应导致的，表明au-mpba的合成是成功的。当agnps被还原成银壳时，aunps的吸收峰消失了，银的特征吸收峰出现在400nm处，表明金纳米的表面被银覆盖。并且我们对不同纳米粒子连接4-mpba进行了sers信号的比较(图3f)，说明将拉曼报告分子嵌入金核银壳之间会产生更强的拉曼信号，为后续的致病菌检测提供优良的sers探针。
[0099]
如图4，首先我们制备了au@ag作为该sers探针的内核，然后在外层包裹了fecl3·
6h2o和k4[fe(cn)6]
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3h2o合成的pb拉曼报告分子，最后为了使au@ag-pb更容易与适配体通过ag-s进行相连，在pb的外层又包裹了ag外壳。图4a的tem图像显示aunps分布良好，尺寸约为32nm(图4d)。图4b是au@agnps的tem图像，具有明显的核壳结构，尺寸相对均匀，平均尺寸约为48nm(图4e)。图4c是au@ag-pb nps的tem图像，可以明显的在au@ag的外壳看到包裹了一层轻薄的pb外壳，约为2nm的厚度，au@ag-pb nps的平均尺寸约为52nm(图4f)，图4g是au@ag-pb@ag nps的tem图像，该纳米粒子的尺寸为69nm(图4i)，较au@ag-pb nps增加了17nm,说明在au@ag-pbnps外层的ag外壳包裹成功。
[0100]
磁性纳米粒子的设计与制备，主要包括fe3o4@sio2的合成，进行氨基的连接，硼酸的修饰以及cona功能化。对于形态的测量，通过tem和扫描电子显微镜(sem)对fe3o4，fe3o4@sio2，fpba-amnps进行了表征。如图5a(a)所示，溶剂热法制备的fe3o4磁性纳米颗粒呈现规
则的球形，颗粒大小较为均匀，分散性良好，平均粒径为268nm。图5a(b)显示fe3o4纳米颗粒的表面包覆了一层厚度均一的sio2层，壳层厚度约为28nm，sio2的包覆，不仅增大了磁性纳米粒子的粒径，也增加了亲水性、分散性和稳定性，从图5(c)的sem可以看出fe3o4表面凹凸不平，包覆上sio2后表面光滑图5(d)。傅里叶变换红外光谱(ft-ir)用于研究fe3o4、fe3o4@sio2、amnps和fpba-amnps的氨基化和硼酸接枝的形成。
[0101]
图5b显示了fe3o4的特征峰在581cm-1
处，这是fe-o的伸缩振动峰；包覆上sio2后，在942cm-1
和1089cm-1
出现两组特征峰，分别归属于si-o-si和si-o-h的拉伸振动；氨基修饰后，在1548cm-1
处的谱带归属于氨基的n-h伸缩振动，表明氨基成功修饰在sio2的表面。此外，1368cm-1
和1520cm-1
处的两个新峰分别是b-o的拉伸峰和苯环上c＝c的伸缩振动峰，表明fpba已经接枝到氨基上。通过x射线衍射(xrd)分析鉴定了fe3o4、fe3o4@sio2和fpba-amnps的晶相。如图5c所示，所制备材料的xrd均显示出fe3o4的特征衍射峰，在2θ＝30.1
°
、35.4
°
、43.2
°
、53.4
°
、57.1
°
和62.5
°
处的6个特征衍射峰可指示为(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)，分别为(jcpds卡：19-0629)。表明在材料的制备过程中磁铁矿的晶体结构基本保持不变。此外，与fe3o4相比，尽管fe3o4@sio2和fpba-amnps的衍射峰位没有发生变化，也没有新的衍射峰，但峰强度逐渐下降，证明其表面包覆有非晶型材料。为了进一步确定fpba对fe3o4@sio
2-nh2表面的改性，使用x射线光电子能谱(xps)对fe3o4、fpba-amnps进行了元素分析。从图5d中可以看出，fe3o4的xps图中在712、545ev处出现了fe2p、o1s的峰，从fpba-amnps的xps图中则在151和100ev分别出现si2s和si2p的峰，说明fe3o4的表面包裹了一层sio2,399.1ev处的n1s峰表明aptes已被固定在fe3o4@sio2的表面，由于b元素丰度较低，在190.4ev处出现了较弱的b1s峰(从插图可以看出)，表明fpba已固定在fe3o4@sio2表面。
[0102]
为了进一步表征我们所合成的fpba-amnp的富集、分离能力，使用磁滞回线测试(vsm)测量fe3o4、fe3o4@sio2和fpba-amnp的磁化曲线，如图6a所示；均表现出良好的磁性，其中fe3o4的磁饱和(ms)值为67.89emu/g；包裹sio2后，ms值有明显降低(43.70emu/g)，这是由于表面包覆了一层sio2薄层。氨基修饰以及硼酸接枝后并没有明显降低ms值(43.39emu/g)，说明化学键或化学基团对磁响应的影响不大。
[0103]
为了确定fpba-amnps对cona的结合亲和力，我们评估了cona与fpba-amnps的结合等温线；如图6b所示，fpba-amnps对cona的最大吸附量为29.8mg/g，表明制备的fpba-amnps具有较好的吸附能力。利用scatchard图分析了吸附等温线和结合亲和力的定量分析。首先，测定了fpba-amnps在不同浓度cona溶液中的吸附量qe和吸附平衡时的cona浓度，然后以qe/[cona]为纵坐标，qe为横坐标作图，线性拟合后的方程为平衡实验的scatchard方程，根据斜率的倒数计算解离常数kd。图6c显示scatchard图分析提供了ph＝7.4时的离解常数(kd)为(2.34
±
0.09)
×
10-7
m。表明所制备的fpba-amnps与cona具有很强的结合强度，因此，为致病菌的富集分离提供了稳定的吸附材料。为了达到成本效益。磁性材料的重复使用性也是我们所关注的，硼酸亲和连接蛋白可以通过调节ph值来达到吸附和解吸的效果。因此，我们通过吸附-解吸实验研究了fpba-amnps的可再生能力，从图6d中可以看出，经过5次再生循环后，fpba-amnps吸附cona的sers信号略微下降，约6.76％，说明经过多次吸附-解吸循环后，mnps的稳定性仍然良好，说明在提高或降低ph条件下，粒子的再生也没有破坏固定结构。因此，mnps具有良好的可重复使用性，使得sers传感器的成本较低。
[0104]
为了证明三种不同sers探针的特征拉曼峰之间互无干扰，如图7(a)所示au-dtnb@
ag、au-mpba@ag和au@ag-pb@ag分别在1334cm-1
、1078cm-1
、2081cm-1
处有强而尖锐的拉曼特征峰，因pb只在“生物静默区”有着背景干净、峰值强度高的sers信号，与au-dtnb@ag和au-mpba@ag两种拉曼报告分子完全无干扰，是实现致病菌同时三联检的基础。当这三种拉曼报告分子的混合sers探针中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的不同浓度的混合菌进行了sers检测如图7(b)表明，当金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的浓度从1
×
101～1
×
107cfu/ml,混合sers的拉曼信号强度逐渐增加，并呈现良好的线性关系。图7(d、e、f)金黄色葡萄球菌的线性回归方程为y＝872.44+2129.30x，检测极限(lod)为1cfu/ml；大肠杆菌的线性回归方程为y＝909.85+2070.66x，检测极限(lod)为1cfu/ml；铜绿假单胞菌的线性回归方程为y＝1214.75+2634.14x，检测极限(lod)为1cfu/ml。此外，我们的实验结果如图7c所示，通过混合sers探针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌进行了准确的识别，并具有非常高的拉曼强度，证实了混合的sers探针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌具极佳的特异性，与其他病原体没有交叉反应。基于我们所证明的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生物分析，许多类似的生物分析目标可以通过使用混合的sers探针而被发现。因此，合成的混合sers探针在识别复杂生物样本中多种生物体的广泛成分方面具有巨大的潜力，具有巨大的复用能力、非凡的灵敏度和特殊的选择性
[0105]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0106]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。