基于广泛靶向代谢组学技术鉴别江华苦茶野生茶的方法与流程

1.本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及基于广泛靶向代谢组学技术鉴别江华苦茶野生茶的方法。


背景技术：

2.江华苦茶产于湖南省南岭山脉的特异性古老茶树种质资源，为湖南四大茶树原生种群之一，经过长期的自然选择和人工选育，形成了野生茶类型和栽培品种类型，野生茶因资源相对稀少、生态有机和某些功能成分含量超常量，深受消费市场追棒。但由于江华苦茶野生茶类型和栽培品种类型鲜叶形态相似度高，导致江华苦茶野生茶市场混乱现象常有发生，为最大程度地保护消费者利益，政府相关监管部门对鲜叶抽样检查就必须找到一个有效的鉴别工具。
3.目前，形态特征观察仍然是江华苦茶类型鉴定的主要方法，实践表明该方法受各种因素影响较大，主观性强、可靠性差，因此迫切需要更有效的鉴定手段。广泛靶向代谢组检测技术可以实现高通量、高灵敏、广覆盖检测目标物体上千种内源性小分子代谢物成分，目前基于代谢组学法方法来鉴别野生茶与栽培品种类型的研究未见报道。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的在于设计提供基于广泛靶向代谢组学技术鉴别江华苦茶野生茶的方法，建立了一种广泛靶向代谢组学分析方法对江华苦茶野生茶进行特征鉴别，准确找出江华苦茶野生茶差异显著性代谢物，根据差异显著性代谢物相对含量进行数据可视化，可以进行江华苦茶野生茶真假的鉴定的方法。
5.本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
6.基于广泛靶向代谢组学技术鉴别江华苦茶野生茶的方法，所述方法是利用广泛靶向代谢组学技术，通过差异性分析现有的江华苦茶野生茶以及所有江华苦茶栽培品种的代谢物信息，筛选出vip》1，p《0.05的变量作为组间差异代谢物，然后再对待鉴定样品进行分析，判断所述待鉴定样品是否为江华苦茶野生茶，所述组间差异代谢物包括5种生物碱、11种黄烷醇、9种二聚黄烷醇、15种黄酮醇糖苷、4种氨基酸、4种酚酸、3种香气前体、6种脂类和4种其它化合物。
7.进一步，所述组间差异代谢物具体包括：苦茶碱、可可碱、1,3,7-三甲基尿酸、5'-甲硫腺苷、磷酸胆碱、表没食子酸儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、3"-o-甲基表没食子儿茶素没食子酸酯、3"-o-甲基表儿茶素没食子酸酯、表阿福豆素-3-没食子酸酯、表阿夫儿茶精、原花青素b1、原花青素b2、原花青素b3、聚酯型儿茶素b、表儿茶素-(4beta-》8)-表没食子酸儿茶素、表儿茶素-(4alpha-》8)-表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素-(4beta-》8)-表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子酸儿茶素-(4beta-》8)-表儿茶素没食子酸酯、没食子酸儿茶素-(4beta-》8)-表儿茶素、山奈酚3-葡萄糖芸香糖苷、山奈酚3-半乳糖芸香糖苷、山奈酚-3-葡
萄糖苷、山奈酚3-双香豆葡萄糖苷、山奈酚-3-香豆葡萄糖苷、山奈酚3-双香豆半乳糖糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素双葡萄糖苷、槲皮素三葡萄糖苷、槲皮素3-(2g-葡萄糖芸香糖苷)、杨梅素3-葡萄糖苷、杨梅素3-半乳糖苷、杨梅素3'-葡萄糖苷、柚皮素、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、脯氨酸、茶没食子素、绿原酸、5-甲氧基水杨酸、6-o-没食子酰甲基-β-d-吡喃葡萄糖苷、苯乙醇樱草糖苷、苯甲醇樱草糖苷、(s)-3-辛醇葡萄糖苷、溶血磷脂酰胆碱(18:2)、溶血磷脂酰胆碱(18:3(9z,12z,15z)/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:3(6z,9z,12z)/0:0)、单酰甘油酯(18:3)、鞘氨醇、1,4-壬二醇二乙酸酯、羟基茉莉酸葡萄糖苷、血卟啉ix、苄基异喹啉、去氢番木瓜碱i。
8.进一步，所述江华苦茶野生茶样品中苦茶碱、1,3,7-三甲基尿酸，儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯，3"-o-甲基表没食子儿茶素没食子酸酯、3"-o-甲基表儿茶素没食子酸酯的含量显著高，而黄酮醇糖苷含量显著低。
9.进一步，所述方法具体包括以下步骤：
10.s1：收集具有代表性的苦茶野生茶以及所有苦茶栽培品种的鲜叶，冷冻干燥得到样品；
11.s2：将收集得到的样品分别进行前处理进行有效成分提取，得到提取液进行uplc-q-tof/ms检测；
12.s3：检测获得的原始数据，经agilent muss hunter profinder b08.00软件进行提取分析处理，并手动检查，将处理后的数据导入simca-p 14.1软件进行多元统计分析，即先采用pca分析各样本整体之间的总体分布和离散程度，然后用pls-da对组间数据进行分析，结合t-test检验，筛选出vip》1，p《0.05的变量作为组间差异代谢物；
13.s4：选取待鉴定野生茶与已知野生茶，按照上述步骤s1-s2，获得代谢组学数据，然后进行多元统计法进行分析，得到pca图和pls-da图，通过聚类分析初步判定该待鉴定野生茶与已知野生茶的组间差异度，再运用步骤s3将筛选的共有差异显著代谢物生成差异代谢物heatmap图，然后结合pca和pls-da聚类分析判别待鉴定野生茶是否与已知野生茶聚类一起或heatmap图丰度是否相吻合，如达到聚类一起和heatmap图丰度相吻合条件，则认为待鉴定野生茶是真实野生茶。
14.进一步，所述s2步骤的前处理具体为：将冷冻干燥的样品研磨成茶粉，称取茶粉于离心管中，加入经过预热的甲醇溶液，于70℃的水浴条件下浸提0.5h，然后置于高速离心机离心10min，取2ml上清液过0.22μm滤膜得到提取液粗品，每个样品重复提取3次，然后将每次得到提取液取等量混合得到提取液。
15.进一步，所述茶粉和甲醇溶液的质量体积比为1:100g/ml。
16.进一步，所述甲醇溶液的体积比为70％，预热温度为50-60℃。
17.进一步，所述离心机的转速为8000r/min。
18.进一步，所述uplc-q-tof/ms检测分析条件为：使用c18色谱柱，柱温为40℃，流速为0.4ml/min，流动相的a相为0.1％甲酸水溶液，b相为甲醇；所述uplc洗脱条件为：0min，90％a；4min，85％a；7min，75％a；9min，68％a；16min，60％a；22min，45％a；28min，5％a；30min，5％a。
19.进一步，所述质谱条件：esi电源，扫描方式为正离子模式，毛细管电压为3500v，温度300℃，雾化气压强为35psi，鞘气温度和流速分别为300℃和11l/min，质谱扫描范围为
100-10000m/z。
20.本发明的有益效果：
21.本发明的基于广泛靶向代谢组学技术鉴别江华苦茶野生茶的方法，利用广泛靶向代谢组学分析技术，先利用高效液相色谱四级杆飞行时间质谱(uplc-q-tof/ms)获得江华苦茶野生茶以及栽培苦茶品种的内源性小分子代谢物，然后通过多元统计分析，得到组间差异代谢物，差异代谢物相对含量在江华苦茶野生茶和栽培苦茶品种间有显著性差异，对本领域的技术人员来说能够直观的进行鉴别和判断，鉴别结果准确可靠。
附图说明
22.图1是江华苦茶野生茶(jhkc-w)与江华苦茶栽培品种(jhkc21-1、jhkc21-3、jhkc37-2)间的pca得分图；
23.图2是江华苦茶野生茶(jhkc-w)与江华苦茶栽培品种(jhkc21-1、jhkc21-3、jhkc37-2)间的pls-da得分图；
24.图3是江华苦茶野生茶(jhkc-w)与江华苦茶栽培品种(jhkc21-1、jhkc21-3、jhkc37-2)的heatmap图。
具体实施方式
25.以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
26.基于广泛靶向代谢组学技术鉴别江华苦茶野生茶的方法，是利用广泛靶向代谢组学技术，通过差异性分析现有的江华苦茶野生茶以及所有江华苦茶栽培品种的代谢物信息，筛选出vip》1，p《0.05的变量作为组间差异代谢物，然后根据差异代谢物相对含量高低再对待鉴定样品进行分析，判断所述待鉴定样品是否为江华苦茶野生茶，具体如下：
27.实施例
28.s1：收集具有代表性的江华苦茶野生茶(jhkc-w)以及所有江华苦茶栽培品种(jhkc21-1、jhkc21-3、jhkc37-2)的鲜叶，摘取的鲜叶均为一芽二叶的芽尖，低温冷冻干燥得到样品；
29.s2：采用粉碎机将冷冻干燥的样品研磨成茶粉，准确称取0.1g茶粉于离心管中，加入10ml预热至50-60℃的70％(v/v)甲醇溶液，于70℃的水浴条件下浸提0.5h，然后置于高速离心机，在转速为8000r/min条件下，离心10min，取2ml上清液过0.22μm滤膜得到提取液粗品，每个样品重复提取3次，然后将每次得到提取液粗品均取50μl混合得到提取液，用于进行uplc-q-tof/ms检测。
30.uplc-q-tof/ms检测分析条件为：使用c18色谱柱，柱温为40℃，流速为0.4ml/min，流动相的a相为体积分数为0.1％甲酸水溶液，b相为甲醇；所述uplc洗脱条件为：0min，90％a；4min，85％a；7min，75％a；9min，68％a；16min，60％a；22min，45％a；28min，5％a；30min，5％a。
31.质谱条件：esi电源，扫描方式为正离子模式，毛细管电压为3500v，温度300℃，雾化气压强为35psi，鞘气温度和流速分别为300℃和11l/min，质谱扫描范围为100-10000m/z。
32.利用上述色谱、质谱条件对江华苦茶野生茶以及江华苦茶野生茶的所有栽培品种
样品进行检测。
33.s3：对色谱和质谱检测获得的原始数据，经agilent muss hunter profinder b08.00软件进行提取分析处理，包括峰识别、峰对齐、峰提取、降噪、归一化等，并手动检查，将处理后的数据导入simca-p 14.1软件进行多元统计数据分析，先采用无监督的主成分分析(pca分析)，得到pca得分图，分析各样本整体之间的总体分布和离散程度，如图1所示，然后用偏最小二乘判别分析法(pls-da)对组间数据进行分析，得到pls-da得分图，如图2所示，通过图1和图2可以看出，江华苦茶野生茶和江华苦茶栽培品种在图中处于不同的空间聚落，区分效果明显，说明野生茶与栽培品种在代谢产物上存在明显的差异，结合student t检验(t-test检验)，筛选出vip》1，p《0.05的变量作为组间差异代谢物，差异代谢物包括5种生物碱、11种黄烷醇、9种二聚黄烷醇、15种黄酮醇糖苷、4种氨基酸、4种酚酸、3种香气前体、6种脂类和4种其它化合物，，这些差异代谢物在江华苦茶野生茶以及所有江华苦茶栽培品种间相对含量有显著差异；具体如表1所示：
34.表1组间差异代谢物
35.[0036][0037][0038]
根据上述确定的组间差异代谢物，生成江华苦茶野生茶(jhkc-w)与江华苦茶栽培
品种(jhkc21-1、jhkc21-3、jhkc37-2)间的显著差异代谢物的heatmap图(如图3所示)，使数据可视化，可以直观的看出江华苦茶野生茶和江华苦茶栽培品种中共有差异显著代谢物的变化，供待鉴定野生茶进行查询和比对。可以明确的看出，江华苦茶野生茶组(jhkc-w)的苦茶碱(theacrine)、1,3,7-三甲基尿酸(1,3,7-trimethyluric acid)，儿茶素(c)、没食子儿茶素(gc)、儿茶素没食子酸酯(cg)和没食子儿茶素没食子酸酯(gcg)，3"-o-甲基表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg3
″
me)和3"-o-甲基表儿茶素没食子酸酯(ecg3
″
me)含量显著高，而黄酮醇糖苷含量显著低(图3和表2)。
[0039]
表2.茶叶样品中的生物碱、儿茶素和甲基化儿茶素的uplc-pda-tqs定量分析(x
±
sd,n＝3,mg/g)
[0040][0041]
备注:tb,可可碱；caf,咖啡碱；tc,苦茶碱；nd,未检测到。*p《0.05,**p《0.01。
[0042]
s4：选取待鉴定野生茶与已知野生茶，按照上述s1-s2步骤，获得代谢组学数据，然后进行多元统计法进行分析，得到pca图和pls-da图，通过聚类分析初步判定该待鉴定野生茶与已知野生茶的组间差异度，再运用步骤s3将筛选的共有差异显著代谢物生成一个差异代谢物聚类热图(heatmap图)，然后结合pca和pls-da聚类分析判别待鉴定野生茶是否与已知野生茶聚类一起或heatmap图丰度是否相吻合，如达到聚类一起和heatmap图丰度相吻合条件，则认为待鉴定野生茶是真实野生茶。
[0043]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。