盐酸米诺环素胶囊中杂质的检测方法和产品与流程

1.本发明属于药物技术领域，具体涉及一种盐酸米诺环素胶囊中杂质的检测方法和产品。


背景技术：

2.米诺环素为第二代半合成四环素类广谱抗菌素，抗菌谱同四环素，用于葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、淋病奈瑟菌、痢疾杆菌、大肠埃希菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、梅毒螺旋体及衣原体等对本品敏感的病原体引起的感染性疾病治疗。临床疗效较好，也用于痤疮的中重度的炎症治疗。米诺环素的新适应症正在研发中，可能对多发性硬化症有效，其中肌萎缩侧索硬化症在国外正在进行3期临床试验。多数四环素类抗生素因常见致病菌多已耐药，而米诺环素抗菌作用比四环素强，对多数革兰氏阳性敏感菌和耐四环素的金葡菌仍有效。
3.目前，中国药典中列举出的盐酸米诺环素胶囊的有关物质检测方法采用等度洗脱，其分离度较差，专属性不强，分离出的杂质数量较少，且仅规定了差向米诺环素、其他单个杂质及其他总杂质限度，未规定特异性杂质检测方法及限度。本发明增加了特异性杂质a、b、c、e、f、g、h的检验。
4.目前的现有技术中，多为缓释制剂制备方法相关，无杂质检测方法相关专利。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了提供一种盐酸米诺环素胶囊中杂质的检测方法和产品，更能准确地对盐酸米诺环素胶囊中的杂质进行检测。
6.在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
7.术语“c18色谱柱”是指：十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱。
8.术语“edta-2na”是指：乙二胺四乙酸二钠。
9.术语“ep系统适用性化学对照品”是指：欧洲药典规定的系统适用性化学对照品。
10.为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种盐酸米诺环素胶囊中杂质的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以氯化铵-氨水缓冲液和乙腈的混合溶液作为流动相对盐酸米诺环素胶囊中的杂质进行检测；
11.其中，所述氯化铵-氨水缓冲液由氯化铵和乙二胺四乙酸二钠混合溶解后用稀氨水调节ph配制而成，且所述流动相的ph值为7.5～8.0，最优选为8.0。
12.根据本发明第一方面的方法，其中，所述氯化铵-氨水缓冲液中：
13.所述氯化铵的浓度为0.2mol/l～0.4mol/l；和/或
14.乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度为0.01mol/l～0.02mol/l。
15.根据本发明第一方面的方法，其中，所述氯化铵-氨水缓冲液中：
16.所述氯化铵的浓度为0.2mol/l；和/或
17.乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度为0.01mol/l。
18.根据本发明第一方面的方法，其中，所述流动相中，所述氯化铵-氨水缓冲液与乙腈的体积比为80～90：20～10；
19.优选地，所述氯化铵-氨水缓冲液与乙腈的体积比为80～85：20～15。
20.根据本发明第一方面的方法，其中，所述流动相的流速为1.0ml/min～1.5ml/min，最优选为1.0ml/min。
21.根据本发明第一方面的方法，其中，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃，最优选为35℃。
22.根据本发明第一方面的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
23.(1)分别配制米诺环素系统适用性溶液和供试品溶液；
24.(2)量取系统适用性溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪进行检测，记录色谱图，分离盐酸米诺环素胶囊中的杂质。
25.根据本发明第一方面的方法，其中，步骤(1)中，所述系统适用性溶液中米诺环素的浓度为1mg/ml～2mg/ml，最优选为1mg/ml；和/或
26.所述供试品溶液中盐酸米诺环素的浓度为0.1mg/ml～0.6mg/ml，最优选为0.5mg/ml。
27.根据本发明第一方面的方法，其中，步骤(2)中，进样量为10ul～20ul，最优选为10ul。
28.本发明的第二方面提供了一种盐酸米诺环素胶囊，所述盐酸米诺环素胶囊采用第一方面所述的方法进行盐酸米诺环素胶囊中的杂质检测后制得。
29.具体地说，在本发明的实施方案中，本发明提供了一种高效液相色谱检测盐酸米诺环素胶囊中杂质的方法，选用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以氯化铵-氨水缓冲液和乙腈按比例配成的溶液作为流动相。以紫外检测器为检测器。
30.在本发明的实施方案中，所述氯化铵-氨水缓冲液由氯化铵、乙二胺四乙酸二钠溶液和氨水配制而成，其中氯化铵的浓度为0.2mol/l～0.4mol/l，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.01mol/l～0.02mol/l，优选为氯化铵的浓度为0.2mol/l，乙二胺四乙酸的浓度为0.01mol/l。
31.所述流动相中，氯化铵氨水缓冲液与乙腈的体积比为80～90：20～10。优选地80～85：20～15。
32.在本发明的优选实施方案中，提供的一种高效液相色谱检测盐酸米诺环素胶囊中杂质的方法，其中，所述流动相，其流速为1.0ml/min～1.5ml/min，优选地为1.0ml/min。
33.在本发明的优选实施方案中，提供的一种高效液相色谱检测盐酸米诺环素胶囊中杂质的方法，其中，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃，优选地为35℃。
34.在本发明的实施方案中，提供的一种高效液相色谱检测盐酸米诺环素胶囊中杂质的方法，进一步地包括下列操作：
35.⑴
系统适用性溶液：称取米诺环素ep系统适用性化学对照品1mg，置液相进样瓶中，加水1ml溶解，摇匀，即得。
36.供试品溶液：取盐酸米诺环素胶囊内容物适量(约相当于盐酸米诺环素100mg)，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
37.⑵
量取系统适用性溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
38.所述氯化铵-氨水缓冲液为氯化铵、乙二胺四乙酸二钠溶液和氨水配制而成；所述流动相为氯化铵-氨水缓冲液和乙腈按比例配成的溶液。
39.本发明的方法可以具有但不限于以下有益效果：
40.(1)分离的杂质峰数量多，各杂质及米诺环素均能达到基线分离，相邻杂质峰的分离度均大于1.5。ep中规定的特异性杂质如差向米诺环素(杂质a)、杂质b、杂质c、杂质e、杂质f、杂质g及杂质h均可被准确定位并检出。该方法能有效地控制盐酸米诺环素胶囊中的有关物质，确保产品的安全性和有效性。
41.(2)本发明的方法操作简便快捷，该方法的流动相中不含n,n-二甲基甲酰胺及四氢呋喃等毒性较大的物质，安全性较高，分析时间短，成本低。
附图说明
42.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
43.图1示出了实施例1的hplc系统适用性溶液色谱图。
44.图2示出了实施例1的hplc供试品溶液色谱图。
45.图3示出了实施例2的hplc系统适用性溶液色谱图。
46.图4示出了实施例2的hplc供试品溶液色谱图。
47.图5示出了实施例3的hplc系统适用性溶液色谱图。
48.图6示出了实施例3的hplc供试品溶液色谱图。
49.图7示出了实施例4的hplc系统适用性溶液色谱图。
50.图8示出了实施例4的hplc供试品溶液色谱图。
51.图9示出了实施例5的hplc系统适用性溶液色谱图。
52.图10示出了实施例5的hplc供试品溶液色谱图。
53.图11示出了实施例6的hplc系统适用性溶液色谱图。
54.图12示出了实施例6的hplc供试品溶液色谱图。
55.图13示出了对比例1的中国药典方法hplc系统适用性溶液色谱图。
56.图14示出了对比例1的中国药典方法hplc供试品溶液色谱图。
具体实施方式
57.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
58.本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
59.以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
60.试剂：
61.米诺环素ep系统适用性化学对照品，购自深圳菲斯生物科技有限公司。
62.氯化铵，购自广州番禹力强化工厂有限公司。
63.乙二胺四乙酸二钠，购自广东光华科技股份有限公司。
64.氨水，购自广州化学试剂厂。
65.乙腈，购自默克股份两合公司。
66.仪器：
67.分析天平，购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司、型号cpa225d。
68.pb-10酸度计，购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司、型号pb-10。
69.agilent高效液相色谱仪，购自安捷伦公司、型号1260。
70.agilent工作站，购自安捷伦公司。
71.实施例1
72.本实施例用于说明本发明的方法。
73.流动相：(含0.4mol/l氯化铵及0.02mol/l edta-2na的溶液，用稀氨水调节ph为8.0):乙腈＝80:20。
74.流速：1.0ml/min
75.柱温：35℃
76.波长：280nm
77.色谱柱：agilent c18，5μm，4.6mm
×
250mm
78.测定步骤：
79.(1)制备系统适用性溶液和供试品溶液：
80.制备系统适用性溶液：称取米诺环素ep系统适用性化学对照品1mg，置液相进样瓶中，加水1ml溶解，摇匀，即得系统适用性溶液。
81.制备供试品溶液：取盐酸米诺环素胶囊内容物适量(约相当于盐酸米诺环素100mg)，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
82.(2)精密量取系统适用性溶液10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性溶液色谱图如图1所示、供试品溶液色谱图如图2所示。图1示出了实施例1的hplc系统适用性溶液色谱图，图2示出了实施例1的hplc供试品溶液色谱图。
83.(3)计算方式：面积归一法。通过以下公式(a)计算出杂质含量，由图1和2可知，本发明的盐酸米诺环素胶囊中杂质的检测方法能使各杂质很好地达到基线分离，杂质c与杂质h分离度为1.8，杂质a与杂质g分离度为1.8，杂质f与米诺环素分离度为2.2，均大于1.5。
84.说明该方法能够准确地检测出盐酸米诺环素胶囊中各杂质的量，方法简单、准确度高，且流动相中不含n,n-二甲基甲酰胺及四氢呋喃等毒性较大的物质，安全性较高。
[0085][0086]
实施例2
[0087]
本实施例用于说明本发明的方法。
[0088]
流动相：(含0.2mol/l氯化铵及0.01mol/l edta-2na的溶液，用稀氨水调节ph为8.0):乙腈＝90:10。其他色谱条件同实施例1。
[0089]
测定步骤：
[0090]
(1)制备系统适用性溶液和供试品溶液：
[0091]
制备系统适用性溶液：称取米诺环素ep系统适用性化学对照品1mg，置液相进样瓶中，加水1ml溶解，摇匀，即得系统适用性溶液。
[0092]
制备供试品溶液：取盐酸米诺环素胶囊内容物适量(约相当于盐酸米诺环素100mg)，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0093]
(2)检测方法同实施例1。
[0094]
系统适用性溶液色谱图如图3所示、供试品溶液色谱图如图4所示。图3示出了实施例2的hplc系统适用性溶液色谱图，图4示出了实施例2的hplc供试品溶液色谱图。
[0095]
(3)计算方式：面积归一法。通过实施例1的公式(a)计算出杂质含量，由图3和4可知，杂质c与杂质h分离度为2.0，杂质a与杂质g分离度为1.9，杂质f与米诺环素分离度为2.2，均大于1.5。同实施例1，说明该方法能够准确地检测出盐酸米诺环素胶囊中各杂质的量，准确度高，操作简单且安全性高。
[0096]
实施例3
[0097]
本实施例用于说明本发明的方法。
[0098]
流动相：(含0.2mol/l氯化铵及0.01mol/l edta-2na的溶液，用稀氨水调节ph至7.5):乙腈＝80:20。其他色谱条件同实施例1。
[0099]
测定步骤：
[0100]
(1)制备系统适用性溶液和供试品溶液：
[0101]
制备系统适用性溶液：称取米诺环素ep系统适用性化学对照品1mg，置液相进样瓶中，加水1ml溶解，摇匀，即得系统适用性溶液。
[0102]
制备供试品溶液：取盐酸米诺环素胶囊内容物适量(约相当于盐酸米诺环素100mg)，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0103]
(2)检测方法同实施例1。
[0104]
系统适用性溶液色谱图如图5所示、供试品溶液色谱图如图6所示。图5示出了实施例3的hplc系统适用性溶液色谱图，图6示出了实施例3的hplc供试品溶液色谱图。
[0105]
(3)计算方式：面积归一法。通过实施例1的公式(a)计算出杂质含量，由图5和6可知，杂质c与杂质h分离度为1.9，杂质a与杂质g分离度为1.8，杂质f与米诺环素分离度为2.1，均大于1.5。同实施例1，说明该方法能够准确地检测出盐酸米诺环素胶囊中各杂质的量，准确度高，操作简单且安全性高。
[0106]
实施例4
[0107]
本实施例用于说明本发明的方法。
[0108]
流动相：(含0.2mol/l氯化铵及0.01mol/l edta-2na的溶液，用稀氨水调节ph至8.0):乙腈＝80:20；流速：1.5mg/ml。其他色谱条件同实施例1。
[0109]
(1)制备系统适用性溶液和供试品溶液：
[0110]
制备系统适用性溶液：称取米诺环素ep系统适用性标准品1mg，置液相进样瓶中，加水1ml溶解，摇匀，即得系统适用性溶液。
[0111]
制备供试品溶液：取盐酸米诺环素胶囊内容物适量(约相当于盐酸米诺环素100mg)，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含米诺环素
0.5mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0112]
(2)检测方法同实施例1。
[0113]
系统适用性溶液色谱图如图7所示、供试品溶液色谱图如图8所示。图7示出了实施例4的hplc系统适用性溶液色谱图，图8示出了实施例4的hplc供试品溶液色谱图。
[0114]
(3)计算方式：面积归一法。通过实施例1的公式(a)计算出杂质含量，由图7和8可知，杂质c与杂质h分离度为1.9，杂质a与杂质g分离度为1.9，杂质f与米诺环素分离度为2.3，均大于1.5。同实施例1，说明该方法能够准确地检测出盐酸米诺环素胶囊中各杂质的量，准确度高，操作简单且安全性高。
[0115]
实施例5
[0116]
本实施例用于说明本发明的方法。
[0117]
流动相：(含0.2mol/l氯化铵及0.01mol/l edta-2na的溶液，用稀氨水调节ph至8.0):乙腈＝80:20；柱温：25℃。其他色谱条件同实施例1。
[0118]
(1)制备系统适用性溶液和供试品溶液：
[0119]
制备系统适用性溶液：称取米诺环素ep系统适用性化学对照品1mg，置液相进样瓶中，加水1ml溶解，摇匀，即得系统适用性溶液。
[0120]
制备供试品溶液：取盐酸米诺环素胶囊内容物适量(约相当于盐酸米诺环素100mg)，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0121]
(2)检测方法同实施例1。
[0122]
系统适用性溶液色谱图如图9所示、供试品溶液色谱图如图10所示。图9示出了实施例5的hplc系统适用性溶液色谱图，图10示出了实施例5的hplc供试品溶液色谱图。
[0123]
(3)计算方式：面积归一法。通过实施例1的公式(a)计算出杂质含量，由图9和10可知，杂质c与杂质h分离度为2.3，杂质a与杂质g分离度为2.1，杂质f与米诺环素分离度为2.3，均大于1.5。同实施例1，说明该方法能够准确地检测出盐酸米诺环素胶囊中各杂质的量，准确度高，操作简单且安全性高。
[0124]
实施例6
[0125]
本实施例用于说明本发明的方法。
[0126]
流动相：(含0.2mol/l氯化铵及0.01mol/l edta-2na的溶液，用稀氨水调节ph为8.0):乙腈＝80:20。
[0127]
流速：1.0ml/min
[0128]
柱温：35℃
[0129]
波长：280nm
[0130]
色谱柱：agilent c18，5μm，4.6mm
×
250mm
[0131]
测定步骤：
[0132]
(1)制备系统适用性溶液、供试品溶液：
[0133]
系统适用性溶液：称取米诺环素ep系统适用性化学对照品1mg，置液相进样瓶中，加水1ml溶解，摇匀，即得。
[0134]
供试品溶液：取盐酸米诺环素胶囊内容物适量(约相当于盐酸米诺环素100mg)，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶
液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0135]
(2)精密量取系统适用性溶液、供试品溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性溶液色谱图如图11所示、供试品溶液色谱图如图12所示。图11示出了实施例6的hplc系统适用性溶液色谱图。图12示出了实施例6的hplc供试品溶液色谱图。
[0136]
(3)计算方式：面积归一法。通过实施例1的公式(a)计算出杂质含量，由图11和12可知，杂质c与杂质h分离度为2.7，杂质a与杂质g分离度为2.5，杂质f与米诺环素分离度为2.4，均大于1.5。该实施例条件下，各杂质分离度均大于其他实例，各杂质能够更好地达到基线分离，能够更加准确地检测出盐酸米诺环素胶囊中各杂质的量，操作简单且安全性高。
[0137]
对比例1
[0138]
本对比例用于说明本发明的方法的效果。
[0139]
(1)中国药典方法hplc：
[0140]
流动相：乙酸铵缓冲液-二甲基甲酰胺-四氢呋喃(600:398:2，内含0.01mol/l乙二胺四乙酸二钠)为流动相；
[0141]
流速：1.0ml/min
[0142]
柱温：30℃
[0143]
波长：280nm
[0144]
色谱柱：agilent c8，5μm，4.6mm
×
250mm
[0145]
测定步骤：
[0146]
系统适用性溶液及供试品溶液配制同实施例6。
[0147]
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。计算方式为面积归一法，通过实施例1的公式(a)计算出杂质含量。
[0148]
系统适用性溶液色谱图如图13所示、供试品溶液色谱图如图14所示。图13示出了对比例1的中国药典方法hplc系统适用性溶液色谱图。图14示出了对比例1的中国药典方法hplc供试品溶液色谱图。
[0149]
由图1-12及表1-2可知，实施例1-6洗脱条件下各杂质及米诺环素均能达到基线分离，各条件下检出杂质个数多且杂质分离度好，ep中规定的特异性杂质如差向米诺环素(杂质a)、杂质b、杂质c、杂质e、杂质f、杂质g及杂质h均可被准确定位并检出。其中实施例6为最优条件，该条件下各杂质分离效果最好，能更准确地检测出各杂质。
[0150]
采用中国药典方法，由图13-14及表2可知，该条件下有基线抬高的现象，且杂质f峰形不好，导致杂质a及杂质f检测结果不够精准，影响检测结果的准确性。相较于中国药典方法的方法，采用本发明所述盐酸米诺环素杂质测定方法能更加准确地对产品质量进行控制。此外，相对于中国药典的方法，本发明所述方法的流动相中不含n,n-二甲基甲酰胺及四氢呋喃等毒性较大的物质，对操作人员的安全性更高。
[0151]
表1实施例1-6系统适用性溶液杂质分离度结果对比
[0152][0153]
表2实施例1-6及对比例1的供试品检测结果对比
[0154]
——差向米诺环素(ep杂质a)总杂质实施例10.65％1.65％实施例20.66％1.64％实施例30.67％1.62％实施例40.72％1.73％实施例50.72％1.68％实施例60.70％1.66％对比例11.7％2.4％
[0155]
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。