一种胍基乙酸含量的测定方法与流程

1.本技术涉及饲料添加剂质量控制领域，更具体地说，它涉及一种胍基乙酸含量的测定方法。


背景技术：

2.胍基乙酸又称胍乙酸、n-咪基甘氨酸，是动物体内合成肌酸的主要内源性前体物质，而肌酸是动物机体能量代谢中的重要物质，是能量的贮存场所。已有研究表明，在日粮中补充胍基乙酸能够提高畜禽生长性能和胴体品质，从而提高生产效益；同时，外源性补充胍基乙酸可增加人和动物血液及肌肉组织内肌酸水平，且更加优越于直接补充肌酸。
3.胍基乙酸属于氨基酸及其衍生物，其在瘤胃中大部分会被降解，最终到达小肠被吸收的量较小。hannahfaespeer等人(2019)以荷斯坦牛为对象，研究发现，胍基乙酸的瘤胃降解率为47-49％。因此，如果未处理的胍基乙酸用作反刍动物的饲料添加剂，则需提供2倍的需要量才能达到生长使用要求。为了提高胍基乙酸在反刍动物中的吸收利用率，实施生产中，多采用纤维素包被、聚合物胶囊包被、酵母富集等方法对胍基乙酸进行过瘤胃保护，获得包被胍基乙酸，以提高过瘤胃率；进而降低其在反刍动物饲料中的使用量，节约饲料成本，且包被胍基乙酸不会影响反刍动物正常的瘤胃发酵功能。胍基乙酸作为新型饲料添加剂，其推荐用量为600mg/kg，最高限量为1200mg/kg。为确保胍基乙酸的合理使用和饲料安全，有必要对饲料中胍基乙酸的含量进行监测和控制。
4.目前，检测胍基乙酸的方法主要有高效液相色谱(hplc)法、液相色谱-质谱联用(lc-ms)法、气相色谱-质谱联用仪(gc/ms)法、电喷雾-质谱联用(es-ms)和酶标法等。由于包被胍基乙酸成分复杂，仪器测试前需要对产品进行分离提纯。相关技术中，胍基乙酸的检测方法是用水对产品进行提取，提取后再进行仪器测试。水提取产品存在提取时间长，且提取不完全的缺陷，进而易造成包被胍基乙酸的检测不及时和检测结果偏低。基于上述陈述，本技术提供了一种胍基乙酸含量的测定方法。


技术实现要素：

5.为了解决包被胍基乙酸因提取时间长、提取不完全，最终造成检测不及时、检测结果偏低的缺陷，本技术提供了一种胍基乙酸含量的测定方法。
6.本技术提供了一种胍基乙酸含量的测定方法，采用如下的技术方案：一种胍基乙酸含量的测定方法，包括以下步骤：包括胍基乙酸的提取工序和待测样品的分析检测工序；所述胍基乙酸的提取工序：利用溶剂对包被胍基乙酸样品进行初溶解后，加水超声溶解，继续加超纯水摇匀取上清液离心、过滤，得待测样品；所述溶剂为甲醇。
7.通过采用上述技术方案，胍基乙酸的提取是将包被胍基乙酸中的胍基乙酸提取出来，本技术中用甲醇代替水作为提取液，甲醇可以促进包被胍基乙酸包膜的溶解，加快胍基
乙酸的溶出，不仅可以加快胍基乙酸的提取速度，还可以提高胍基乙酸的溶出程度，从而提高对包被胍基乙酸中胍基乙酸含量检测的准确性。
8.优选的，所述包被胍基乙酸样品与溶剂的比例为：1g包被胍基乙酸样品需要8-10ml溶剂。
9.优选的，所述溶剂包括甲醇与柠檬酸，甲醇与柠檬酸溶液的体积比为(4-6)：1。
10.通过采用上述技术方案，对包被胍基乙酸与溶剂的配比进行限定，在本技术限定的范围内，胍基乙酸的提取时间以及提取完全度均可以达到一个较优的水平；若溶剂用量低于本技术限定范围，则可能会导致胍基乙酸溶出不完全，影响检测结果；若溶剂用量高于本技术限定范围，胍基乙酸的提取时间以及提取完全度不会有进一步的优化，还会提高检测样品中杂质含量，影响检测结果。
11.优选的，所述包被胍基乙酸样品与溶剂的比例为：1g包被胍基乙酸样品需要6-8ml溶剂。
12.通过采用上述技术方案，柠檬酸又称枸橼酸，化学名称2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸，20℃下水溶性1630g/l。本技术中提取胍基乙酸时，先用溶剂进行溶解，然后加水超声提取。柠檬酸具有优良的水溶性，且胍基乙酸和柠檬酸分子结构中均含有-cooh基团。结构较为相近，根据“相似相溶”原理，柠檬酸应对胍基乙酸的水溶性有良好的增强作用。在溶剂中加入柠檬酸，可以有效提高胍基乙酸在水中的溶解性，进一步提高胍基乙酸提取的完全性，提高检测结果的准确性。并且可以进一步降低溶剂的用量，进而降低检测样品中杂质的含量，有利于提高检测结果的准确性。
13.优选的，所述溶剂包括甲醇、柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液，甲醇、柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液的体积比为(4-6)：1：(2-3)。
14.优选的，所述包被胍基乙酸样品与溶剂的比例为：1g包被胍基乙酸样品需要4-5ml溶剂。
15.通过采用上述技术方案，溶剂中甲醇作为有机组分，溶解包被胍基乙酸的包膜，柠檬酸溶液与磷酸氢二钠溶液协同作用，促进胍基乙酸的溶解，加快胍基乙酸的溶液速度以及溶解完全度；并且可以进一步降低溶剂的用量，进而降低检测样品中杂质的含量，有利于提高检测结果的准确性。
16.优选的，所述柠檬酸溶液的ph值为2.5-3.1，磷酸氢二钠溶液的ph值为3-3.5。
17.通过采用上述技术方案，使得溶剂整体偏酸性，有利于加快包被胍基乙酸包膜的溶解，提高胍基乙酸的提取效率，缩短提取时间。
18.优选的，所述待测样品的分析检测工序：通过高效液相色谱法对待测样品进行分析检测，其中色谱柱为kromasil nh2色谱柱，流动相为磷酸氢二钠水溶液与乙腈，流速为1m l/min，检测波长为200nm，柱温为35℃，进样量为20μl。
19.优选的，所述流动相中磷酸氢二钠水溶液与乙腈的配比为40:60，其中磷酸氢二钠水溶液的ph值为8。
20.胍基乙酸在色谱柱是液相色谱检测胍基乙酸的核心，通过采用上述技术方案，选择合适的色谱柱，并对流动相的种类与流速进行限定，更大程度的延长胍基乙酸在色谱柱上的停留时间；而发现柱温的过高会使胍基乙酸的保留时间变短、峰形更尖锐，本技术选择合适的柱温，保证胍基乙酸的保留时间，有利于提高检测结果的准确性。
21.综上所述，本技术具有以下有益效果：1.本技术在用液相色谱法检测胍基乙酸含量时，用甲醇作为溶剂提取包被胍基乙酸中的胍基乙酸制备检测样品，提取时间为60min，加标回收率可以达到99.0-99.7％，提取时间短，提取效果好。
22.2.本技术在用液相色谱法检测胍基乙酸含量时，进一步采用甲醇与柠檬酸溶液复配作为溶剂提取包被胍基乙酸中的胍基乙酸制备检测样品提取时间为50min，加标回收率可以达到100.7-101.7％，进一步缩短提取时间，提高提取完全度。
23.3.本技术在用液相色谱法检测胍基乙酸含量时，进一步采用甲醇、柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液复配作为溶剂提取包被胍基乙酸中的胍基乙酸制备检测样品提取时间为40min，加标回收率可以达到102.8-104.1％，进一步缩短提取时间，提高提取完全度。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
25.原料包被胍基乙酸为固安君德同创生物工程有限公司生产的包被胍基乙酸，型号为jy005；甲醇，色谱级；柠檬酸，分析纯；磷酸氢二钠溶液，分析纯；乙腈，色谱纯。实施例
26.实施例1一种胍基乙酸含量的测定方法，具体包括以下步骤：s1.胍基乙酸的提取工序1)称取1g包被胍基乙酸样品于100ml烧杯中，向烧杯中加入10.00ml甲醇溶剂，并将烧杯放在60℃的恒温水浴锅中加热，进行初溶解，初溶解时间记为t1，t1为20min；2)将烧杯取出，然后加入60ml水，再超声溶解，超声溶解时间记为t2，t2为40min；3)超声溶解后，冷却至室温，将烧杯中溶液定量地转移至250ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度并摇匀，取上清液离心10min后经0.22μm滤膜过滤，得待测样品；s2.待测样品的分析检测工序通过高效液相色谱法对待测样品进行分析检测，其中色谱柱为kromasil nh2色谱柱，流动相为配比为40:60的磷酸氢二钠水溶液与乙腈，磷酸氢二钠水溶液ph值为8，流速为1ml/min，检测波长为200nm，柱温为35℃，进样量为20μl。实施例2与实施例1不同的是，实施例2中步骤s1中甲醇溶剂的用量为8ml。
27.实施例3与实施例1不同的是，实施例3中步骤s1中甲醇溶剂的用量为12ml。
28.实施例4一种胍基乙酸含量的测定方法，具体包括以下步骤：
s1.胍基乙酸的提取工序1)称取1g包被胍基乙酸样品于100ml烧杯中，向烧杯中加入6ml溶剂，溶剂为体积比为4:1的甲醇与柠檬酸溶液的混合液，并将烧杯放在60℃的恒温水浴锅中加热，进行初溶解，初溶解时间记为t1，t1为20min；柠檬酸溶液的ph值为2.5。
29.2)将烧杯取出，然后加入60ml水，再超声溶解，超声溶解时间记为t2，t2为30min；3)超声溶解后，冷却至室温，将烧杯中溶液定量地转移至250ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度并摇匀，取上清液离心10min后经0.22μm滤膜过滤，得待测样品；s2.待测样品的分析检测工序通过高效液相色谱法对待测样品进行分析检测，其中色谱柱为kromasil nh2色谱柱，流动相为配比为40:60的磷酸氢二钠水溶液与乙腈，磷酸氢二钠水溶液ph值为8，流速为1ml/min，检测波长为200nm，柱温为35℃，进样量为20μl。实施例5与实施例4不同的是，实施例5中步骤s1中溶剂为体积比为6:1的甲醇与柠檬酸溶液的混合液。
30.实施例6与实施例4不同的是，实施例5中步骤s1中溶剂为体积比为3:1的甲醇与柠檬酸溶液的混合液。
31.实施例7与实施例4不同的是，实施例7中步骤s1中溶剂的用量为8ml。
32.实施例8与实施例4不同的是，实施例8中步骤s1中溶剂的用量为10ml。
33.实施例9一种胍基乙酸含量的测定方法，具体包括以下步骤：s1.胍基乙酸的提取工序1)称取1g包被胍基乙酸样品于100ml烧杯中，向烧杯中加入4ml溶剂，溶剂为体积比为4:1:3的甲醇、柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液的混合液，并将烧杯放在60℃的恒温水浴锅中加热，进行初溶解，初溶解时间记为t1，t1为15min；柠檬酸溶液的ph值为3.1，磷酸氢二钠溶液的ph值为3.5；2)将烧杯取出，然后加入60ml水，再超声溶解，超声溶解时间记为t2，t2为25min；3)超声溶解后，冷却至室温，将烧杯中溶液定量地转移至250ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度并摇匀，取上清液离心10min后经0.22μm滤膜过滤，得待测样品；s2.待测样品的分析检测工序通过高效液相色谱法对待测样品进行分析检测，其中色谱柱为kromasil nh2色谱柱，流动相为配比为40:60的磷酸氢二钠水溶液与乙腈，磷酸氢二钠水溶液ph值为8，流速为1ml/min，检测波长为200nm，柱温为35℃，进样量为20μl。实施例10与实施例9不同的是，实施例10中步骤s1中溶剂为体积比为6:1:2的甲醇、柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液的混合液。
34.实施例11
与实施例9不同的是，实施例11中步骤s1中溶剂为体积比为3:1:2的甲醇、柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液的混合液。
35.实施例12与实施例9不同的是，实施例12中步骤s1中的溶剂的用量为5ml。
36.实施例13与实施例9不同的是，实施例12中步骤s1中的溶剂的用量为3ml。
37.实施例14与实施例9不同的是，实施例14中步骤s1中的溶剂的用量为6ml。
38.对比例对比例1与实施例1不同的是，对比例1中的溶剂为水。
39.对比例2与对比例1不同的是，对比例2中t1为40min，t2为80min。
40.对比例3与实施例1不同的是，对比例3中的溶剂为体积比为1:2的柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液的混合液。
41.对比例4与实施例1不同的是，对比例4中的溶剂为体积为1:6的磷酸氢二钠溶液与乙腈的混合液。
42.性能检测试验对实施例1-14与对比例1-4中的加标回收率进行检测计算，检测结果见表1。
43.表1性能检测结果
结合实施例1-14与对比例1-4，并结合表1可以看出，实施例1-14中的加标回收率均高于对比例1-4，这说明本技术的提取方法提取的胍基乙酸更完全。
44.结合实施例1与对比例1-2，并结合表1可以看出，对比例1中用传统的水作为溶剂提取包被胍基乙酸中的胍基乙酸，在与实施例1相同的提取时间下，对比例1中的加标回收率明显低于实施例1，这说明用甲醇作为溶剂提取胍基乙酸，在相同的时间内提取的更加完全；对比例2中用传统的水作为溶剂提取包被胍基乙酸中的胍基乙酸，提取时间为实施例1中的2倍，对比例2的加标回收率接近实施例1，但还是略低于实施例1，这说明用甲醇提取胍基乙酸不仅提取时间快，提取还更加完全，有利于提高检测结果的准确性。
45.结合实施例1-3，并结合表1可以看出，实施例3中的加标回收率有所降低，这说明在本技术限定的溶剂与样品的配比范围内，效果更好。
46.结合实施例1与实施例4-8，并结合表2可以看出，实施例4-8中的提取时间低于实施例1，加标回收率却高于实施例1，这说明甲醇与柠檬酸复配作为溶剂能进一步提高胍基乙酸的提取完全度，并缩短提取时间；这可能是因为柠檬酸应对胍基乙酸的水溶性有良好的增强作用。在溶剂中加入柠檬酸，可以有效提高胍基乙酸在水中的溶解性，进一步提高胍基乙酸提取的完全性。
47.结合实施例4与实施例9-14，并结合表2可以看出，实施例9-14中的提取时间低于实施例4，加标回收率却高于实施例4，这说明甲醇、柠檬酸溶液、磷酸氢二钠溶液复配作为溶剂能进一步提高胍基乙酸的提取完全度，并缩短提取时间。
48.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。