一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器及其制备方法

1.本发明属于医疗器械领域，涉及一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器及其制备方法。


背景技术：

2.胰蛋白酶是胰腺产生的一种重要的丝氨酸蛋白酶，它能促进胰腺酶原转化为活性形式并控制胰腺外分泌功能。胰蛋白酶的缺乏会导致诸如胎粪性肠梗阻和遗传性胰腺炎等的胰腺疾病。因此，胰蛋白酶作为一种特殊的生物标记物，在诊断一些重要的生物学疾病方面起着至关重要的作用，如胰腺炎、胰腺癌、囊性纤维化和胆汁性肝硬化等。目前已有多种方法可以检测胰蛋白酶，例如：比色法(colorimetry)、液-质联用色谱法(liquid chromatography-mass spectrometry)、拉曼光谱(colorimetry)等。但是这些方法但这些方法的操作程序复杂，耗时长且检测费用高，不方便应用于常规诊断。因此，需要建立一种快速、灵敏和简便的分析方法用于检测胰蛋白酶。


技术实现要素：

3.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器及其制备方法，能对胰蛋白酶进行即时检测，灵敏度高、特异性强且简单廉价。
4.本发明提供一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.步骤1，制备胰蛋白酶特异性切割的多肽
6.步骤1.1，将多肽(hgc-fc)溶解于水-乙腈(v:v＝4:1)中，得到胰蛋白酶特异性切割的探针溶液，其中，多肽的氨基酸序列为：hwrgwvc-(ch2)
6-cys；
7.步骤2，电化学生物传感器的组装
8.步骤2.1，在金电极表面滴加多肽链(hgc-fc)溶液中进行自组装修饰，然后用tris-hcl缓冲溶液冲洗，得到hgc-fc/ge电极；
9.步骤2.2，在步骤2.1所得电极表面滴加mch溶液封闭电极表面未被hgc-fc占据的空白位点，封闭后用tris-hcl缓冲溶液冲洗电极表面，得到mch/hgc-fc/ge电极，即为检测胰蛋白酶的电化学生物传感器。
10.优选的，步骤1包括如下步骤：
11.优选的，步骤1.1中，胰蛋白酶特异性识别的探针溶液中hgc-fc 的浓度为30-60μm。
12.优选的，步骤2.1中在金电极表面滴加多肽链溶液中之前，进行以下处理：将金电极抛光，清洗，以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，组成三电极体系，在电化学溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。
13.进一步的，扫描电位范围为-0.3v～+1.5v，扫描速率为0.1v
·
s-1
。
14.进一步的，金电极抛光具体是在抛光布上用三氧化二铝抛光。
15.进一步的，清洗是分别在乙醇和去离子水中超声清洗2-5min。
16.优选的，步骤2.1中，多肽链(hgc-fc)自组装修饰的时间为 10-15h。
17.优选的，步骤2.2中，mch溶液的浓度为0.1-10μm。
18.优选的，步骤2.2中，mch封闭时间为10-30min。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
20.胰蛋白酶是一种重要的丝氨酸蛋白酶，它可以催化c端含有赖氨酸和精氨酸残基的肽键和酯键的水解。与其他各种蛋白水解酶相比，胰蛋白酶具有高度的特异性和识别少数特定序列的能力。因此，hgc 可作为能被特异性识别并切割的探针来检测胰蛋白酶。本发明利用带有赖氨酸和精氨酸残基的肽链hgc-fc作为能够被胰蛋白酶特异性识别并切割的物质，在hgc上标记fc作为信号分子，同时标记“(ch2)
6-cys”对该肽链进行功能化修饰得到多肽链hgc-fc。以 hgc-fc作为分子识别物质，因在hgc-fc上标记的“(ch2)
6-cys”带有巯基，可通过au-s自组装将hgc-fc固定在金电极表面，用 mch封闭后即可得到检测胰蛋白酶的电化学生物传感器。在没有胰蛋白酶的情况下，fc被氧化产生差分脉冲伏安(dpv)信号；当胰蛋白酶对hgc-fc进行特异性切割后，fc从电极表面脱落，导致dpv信号减弱，基于此实现对胰蛋白酶高选择性和高灵敏度的检测。电化学生物传感器检测胰蛋白酶的原理图如图1所示。本发明的优点在于： (1)灵敏度高，本发明利用的差分脉冲伏安技术作为信号输出方式，该技术本身具有极高的灵敏度，本发明中的电化学生物传感器可定量检测0.075pg/ml胰蛋白酶；(2)选择性好，本发明以胰蛋白酶特异性识别并切割hgc-fc，使得差分脉冲伏安信号减弱的原理来检测胰蛋白酶，常见的干扰蛋白：mmp-2、bsa、thrombin、cea、溶菌酶、 muc1对检测均无干扰。(3)步骤简单，操作方便。在电化学生物传感器组装完成后，与待测胰蛋白酶溶液结合30min后就可进行检测； (4)仪器价格低廉，检测物用量少。
21.本发明得到的检测胰蛋白酶的电化学生物传感器，当传感器与胰蛋白酶相互作用后，胰蛋白酶对hgc-fc进行特异性识别并切割，使得信号分子fc从电极表面脱落，从而使得dpv信号下降，基于此实现对胰蛋白酶高选择性和高灵敏度的检测。
附图说明
22.图1为本发明检测胰蛋白酶的电化学生物传感器用于检测胰蛋白酶的原理图。
23.图2为不同浓度胰蛋白酶对应的差分脉冲伏安(dpv)图谱。
24.图3为dpv信号值与胰蛋白酶浓度的线性关系图。
25.图4为电化学生物传感器检测胰蛋白酶的选择性结果图。
具体实施方式
26.下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
27.一种检测检测胰蛋白酶的电化学生物传感器的制备方法，具体制备步骤如下：
28.(1)金电极的预处理
29.将金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm 的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗2-5min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和
kcl)组成三电极体系在0.1-0.5m h2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电位范围为-0.3v～+1.5v，扫描速率为0.1v
·
s-1
。
30.(2)配置检测胰蛋白酶的特异性识别探针
31.a.用水-乙腈(v:v＝4:1)配置30-60μm的hgc-fc，即得到胰蛋白酶特异性识别并切割的探针溶液。
32.(3)电化学生物传感器的组装
33.a.在预处理后的金电极(φ＝2.0mm)表面滴加10μl多肽 (hgc-fc)溶液修饰10-15h，然后用tris-hcl(ph 7.4)缓冲溶液冲洗以去除任何吸附物质，得到hgc-fc/ge。其中多肽(hgc-fc)的氨基酸序列为：hwrgwvc-(ch2)
6-cys。
34.b.将10-30μl 0.1-10μm mch的溶液滴加到hgc-fc/ge表面，封闭10-30min后用10mm tris-hcl(ph 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得到mch/hgc-fc/ge，即为可检测胰蛋白酶的电化学生物传感器。tris-hcl缓冲溶液的浓度可以是0.01-0.1m内的任一值，ph值可以为7-8内的任一值。
35.上述检测胰蛋白酶的电化学生物传感器的使用方法，具体包括以下步骤：
36.(1)以上述制备得到的检测胰蛋白酶的电化学生物传感器为工作电极，ag/agcl电极(饱和kcl)为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
37.(2)在工作电极表面滴加10μl用10mm tris-hcl(ph 7.4)配制的已知浓度胰蛋白酶待测液，30min后用10mm tris-hcl(ph 7.4)冲洗除去任何吸附的物质。在10mm tris-hcl-0.1m naclo4(ph 7.4)测试液中，测试dpv信号值(μa)，采用的电化学方法：差分脉冲伏安法；扫描范围为0.65-0.2v，脉冲宽度：0.06s，振幅：0.05v，采样宽度：0.02s，扫速为100mv
·
s-1
。重复该步骤得到多组不同胰蛋白酶浓度对应的dpv信号值；胰蛋白酶浓度范围为0.1pg/ml-1.0pg/ml。
38.(3)在0.1pg/ml-1.0pg/ml浓度范围内，dpv信号值随胰蛋白酶浓度的增大而减小(不同浓度的胰蛋白酶对应的dpv信号值图谱，如图2所示)。根据步骤(2)得到的多组不同胰蛋白酶浓度对应的 dpv信号值模拟得到胰蛋白酶浓度与dpv信号值之间的拟合曲线。
39.(4)在工作电极表面滴加待测溶液结合一段时间后，以结合后的电极为工作电极，在在10mm tris-hcl-0.1m naclo4(ph 7.4)中，测试dpv信号值，根据胰蛋白酶浓度与dpv信号值之间的拟合曲线，得到待测溶液中胰蛋白酶的浓度，单位为pg/ml。
40.本发明采用所述电化学生物传感器可以用于检测胰蛋白酶，测试时步骤简单，电化学生物传感器组装好以后，与待测胰蛋白酶溶液结合30min后就可以一步检测，有利于多种疾病的诊断和治疗。
41.以下结合附图实施列对本发明做进一步的详细描述。
42.具体实施例1
43.一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器的制备方法，具体制备步骤如下：
44.(1)金电极的预处理
45.a.金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm 的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗2min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和 kcl)组成三电极体系在0.5m h2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电
位范围为-0.3v～+1.5v,扫描速率为0.1 v
·
s-1
。
46.(2)配制检测胰蛋白酶的特异性识别探针
47.用水-乙腈(v:v＝4:1)配置30μm的hgc-fc，即得到胰蛋白酶特异性识别并切割的探针溶液。
48.(3)电化学生物传感器的组装
49.a.在预处理后的金电极表面滴加10μl 30μm多肽(hgc-fc)溶液修饰10h，然后用10mm tris-hcl(ph 7.4)缓冲溶液充分冲洗电极表面除去任何吸附的物质，得到hgc-fc/ge。其中多肽(hgc-fc)的氨基酸序列为：hwrgwvc-(ch2)
6-cys。
50.b.将30μl 0.1μm mch溶液滴加到hgc-fc/ge电极表面，封闭10min后得到mch/hgc-fc/ge，即为检测胰蛋白酶的电化学生物传感器。
51.具体实施例2
52.一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器的制备方法，具体制备步骤如下：
53.(1)金电极的预处理
54.a.金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm 的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗3min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和 kcl)组成三电极体系在0.5m h2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电位范围为-0.3v～+1.5v,扫描速率为0.1 v
·
s-1
。
55.(2)配制检测胰蛋白酶的特异性识别探针
56.用水-乙腈(v:v＝4:1)配置45μm的hgc-fc，即得到胰蛋白酶特异性识别并切割的探针溶液。
57.(3)电化学生物传感器的组装
58.a.在预处理后的金电极表面滴加10μl45μm多肽(hgc-fc)溶液修饰15h，然后用10mm tris-hcl(ph 7.4)缓冲溶液充分冲洗电极表面除去任何吸附的物质，得到hgc-fc/ge。其中多肽(hgc-fc)的氨基酸序列为：hwrgwvc-(ch2)
6-cys。
59.b.将20μl 10μm mch溶液滴加到hgc-fc/ge电极表面，封闭20min后得到mch/hgc-fc/ge，即为检测胰蛋白酶的电化学生物传感器。
60.具体实施例3
61.一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器的制备方法，具体制备步骤如下：
62.(1)金电极的预处理
63.a.金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm 的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗5min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极(饱和 kcl)组成三电极体系在0.5m h2so4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电位范围为-0.3v～+1.5v,扫描速率为0.1 v
·
s-1
。
64.(2)配制检测胰蛋白酶的特异性识别探针
65.用水-乙腈(v:v＝4:1)配置60μm的hgc-fc，即得到胰蛋白酶特异性识别并切割的探针溶液。
66.(3)电化学生物传感器的组装
67.a.在预处理后的金电极(φ＝2.0mm)表面滴加10μl 60μm 多肽(hgc-fc)溶液修饰12h，然后用10mm tris-hcl(ph 7.4) 缓冲溶液充分冲洗电极表面除去任何吸附的物质，得到hgc-fc/ge。其中多肽(hgc-fc)的氨基酸序列为：hwrgwvc-(ch2)
6-cys。
68.b.将10μl 1μm mch溶液滴加到hgc-fc/ge电极表面，封闭 30min后得到mch/hgc-fc/ge，即为检测胰蛋白酶的电化学生物传感器。
69.应用实例
70.实例1检测胰蛋白酶
71.一种检测胰蛋白酶的电化学生物传感器使用方法，包括如下步骤：
72.(1)以上述制备实施例3制备得到的检测胰蛋白酶的电化学生物传感器为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
73.(2)在工作电极表面分别滴加10μl用10mm tris-hcl(ph 7.4) 配制的浓度为0.1pg
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ml-1
、0.3pg
·
ml-1
、0.5pg
·
ml-1
、0.7pg
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ml-1
、 0.9pg
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ml-1
、1pg
·
ml-1
的胰蛋白酶待测液，结合30min后用10mmtris-hcl(ph 7.4)冲洗除去任何吸附的物质，在10mm tris-hcl-0.1 mnaclo4(ph 7.4)测试液中,测试dpv信号值(μa)，采用的电化学方法：差分脉冲伏安法；扫描范围为0.65-0.2v，脉冲宽度：0.06s，振幅：0.05v，采样宽度：0.02s，扫速为100mv
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s-1
。
74.(3)根据测试结果发现，dpv信号值i在胰蛋白酶浓度为0.1 pg
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ml-1-1.0pg
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ml-1
范围内呈线性关系i＝-0.0967c+0.1588(c单位： pg
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ml-1
，r2＝0.9905)，不同浓度的胰蛋白酶对应的dpv信号值如图 2所示，dpv信号值与胰蛋白酶浓度之间的线性关系图如图3所示。
75.(4)在工作电极表面滴加10μl胰蛋白酶待测溶液，结合30min 后，在10mm tris-hcl-0.1m naclo4(ph 7.4)测试液中，测试得到 dpv信号值，根据胰蛋白酶浓度与dpv信号值之间的拟合曲线，得到待测溶液中胰蛋白酶的浓度，单位为pg
·
ml-1
。
76.由该实例1可知，dpv信号值与胰蛋白酶浓度在0.1pg/ml-1.0 pg/ml浓度范围内呈线性关系，因此，根据检测限计算公式3σ/s，经计算实施例1制备得到的检测胰蛋白酶的电化学生物传感器检测胰蛋白酶的检测限可达0.075pg/ml，这说明本发明的电化学生物传感器的灵敏度很高。
77.实例2选择性测试：
78.以上述具体实施例3制备得到的检测胰蛋白酶的电化学生物传感器为工作电极，实验条件与上述具体实施例1相同,检测10pg/ml 胰蛋白酶以及1ng/ml常见干扰蛋白：mmp-2、bsa、thrombin、 cea、溶菌酶、muc1，结果如图4所示。
79.结果表明：除目标物胰蛋白酶外，其余干扰蛋白与电化学生物传感器相互作用后，dpv信号值变化均很小。这说明100倍的常见的干扰蛋白不影响检测，本发明的生物传感器具有较好的选择性。这主要是因为生物传感器与胰蛋白酶相互作用后，胰蛋白酶对hgc-fc进行特异性识别并切割，使得信号分子fc从电极表面脱落，从而使得 dpv信号下降，基于此实现对胰蛋白酶高选择性和高灵敏度的检测。
80.基于胰蛋白酶对hgc-fc进行特异性识别并切割，使得信号分子 fc从电极表面脱落，从而使得dpv信号下降，构建了一种灵敏度高、特异性强的检测胰蛋白酶的电化学生物
传感器。首先将多肽(hgc-fc) 通过au-s键自组装在金电极上，用6-巯基-1-己醇(mch)封闭电极表面上未被hgc-fc占据的空白位点后生物传感器组装完成。胰蛋白酶可以特异性识别并切割hgc-fc，因此mch/hgc-fc/ge修饰的生物传感器可以用于检测胰蛋白酶，以fc作为探针检测传感器和胰蛋白酶待测液相互作用后传感器界面上dpv信号值的变化。胰蛋白酶浓度在0.1pg/ml-1.0pg/ml范围内与dpv信号值呈现良好的线性关系，检出限为0.075pg/ml。本发明通过研究多肽(hgc-fc)与胰蛋白酶之间的相互作用，提出了一种新颖的方法用于临床诊断某些生物学疾病，以及为治疗这些疾病药物的筛选提供了新的研究平台。
81.上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但不能理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。