一种牛型结核分枝杆菌抗体检测方法与流程

1.本发明属于均牛型结核分枝杆菌检测技术领域，尤其涉及一种牛型结核分枝杆菌抗体检测方法。


背景技术：

2.结核病是人类已知的最古老的疾病之一,一直严重威胁着人类和动物的健康,造成了巨大的经济损。由于卡介苗(bcg)的使用,结核病的发病率比过去有所下降,但是近年来该病的发病率又渐呈上升趋势。牛结核病被国际兽疫局(oie)列为b 类动物疫病，是一种人兽共患传染病,可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人，其传播和流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。在西方一些畜牧业发达的国家，牛群的结核病疫情一度相当严重,经过实施“检疫-扑杀”措施,疫情有所控制。随着我国人民生活水平的不断提高，人们对健康生活的要求也迅速提高，与之相一致的是乳制品需求量的急速攀升，随之带动了奶牛业在近几年的迅猛发展。在这样一种情况下，我国的牛结核病疫情正在受到日益广泛而密切的关注。
3.引起牛结核病的主要病原菌是牛型分枝杆菌(mycobacterium bovis),属于分枝杆菌属。分枝杆菌属包括结核分枝杆菌(m.tuberculosis),牛型分枝杆菌(m.bovis),禽型分枝杆菌 (m.av ium)等。副结核分枝杆菌(m.paratuberculosis,属于 m.av ium的一个亚种)是该病的主要病原菌。诊断牛结核病的检测方法,大体上可归为三类: 一是细菌学检测，如涂片镜检、细菌培养、动物实验等；第二类为免疫学检测；第三类是分子生物学诊断技术。传统的细菌学方法由于繁琐费时、检出率低、灵敏度差,已不能满足当前疫病诊断的需要。目前世界各国都在致力于研究开发牛结核病的快速诊断方法，并已经建立了一些快速、准确、可靠的新型检测技术，有些技术已经在生产实践中得到了广泛的应用。
4.由于牛体对大多数的m.bovis的感染首先产生有效的细胞免疫，并能长期将感染限制在局部区域使之不能扩散，因而体液免疫反应出现较迟且往往反应低下，加之各种分枝杆菌之间含有较多的共同抗原成分，因而导致该法的灵敏度和特异性较低。高水平的循环抗体可见于病情恶化之后，可能与细胞免疫失败，从而失去对分枝杆菌繁殖的限制有关。因此，在进行ppd皮内试验之后应用血清学检测方法复检，对“高危”病牛的鉴定有一定的作用。另外，对于那些因免疫无反应性而导致ppd皮内试验阴性的牛体，同时应用elisa等血清学检测方法是解决这一问题的有效手段，本专利涉及一种高特异性和敏感性的牛型结核分支杆菌的血清学检测方法，有效减少禽型结核的干扰。


技术实现要素：

5.为了解决以上技术问题，本发明提供一种牛型结核分枝杆菌抗体检测方法，通过牛型ppd 皮内变态反应(tst)实验，刺激感染牛快速产生牛型抗体，通过前后2次检测抗体效价，根据差值判定反应ppd刺激抗体的消涨，达到提高牛结核检测敏感性和特异性的目的。
6.本发明的目的通过下述技术方案来实现：
7.一种牛型结核分枝杆菌抗体检测方法，采用荧光层析定量检测卡进行2次牛型结核分枝杆菌抗体检测，在第一次与第二次检测之间进行牛型ppd皮试。
8.进一步，所述第二检测后的抗体效价减去第一次检测后的抗体效价，差值大于30即为牛型结核分枝杆菌感染阳性。
9.进一步，第二次检测在牛型ppd皮试后的2-8周内进行。
10.一种上述检测方法所使用的荧光层析定量检测卡，包括pvc底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在pvc底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜右端设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫和滤物垫，稀释垫搭接在滤物垫顶部，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间包被检测线和质控线。
11.进一步，所述硝酸纤维素膜上包被牛结核特异性表达蛋白为检测线，包被兔抗鸡lgy抗体为质控线。
12.进一步，所述牛结核特异性表达蛋白包括mpb70、mpb83、cfp-10、esat-6融合蛋白中的至少一种
13.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
14.通过牛型ppd皮内变态反应(tst)实验，刺激感染牛快速产生牛型抗体，通过前后2次检测抗体效价，根据差值判定反应ppd刺激抗体的消涨，达到提高牛结核检测敏感性和特异性的目的。
附图说明
15.图1为本发明中荧光层析定量检测卡的结构示意图。
具体实施方式
16.下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
17.一种牛型结核分枝杆菌抗体检测方法，采用荧光层析定量检测卡进行2次牛型结核分枝杆菌抗体检测，在第一次与第二次检测之间进行牛型ppd皮试。
18.所述第二检测后的抗体效价减去第一次检测后的抗体效价，差值大于30即为牛型结核分枝杆菌感染阳性。
19.第二次检测在牛型ppd皮试后的2-8周内进行。
20.如图1所示，一种上述检测方法所使用的荧光层析定量检测卡，包括安装在外壳内的牛结核分枝杆菌抗体检测条，该牛结核分枝杆菌抗体检测条包括pvc底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、标记物垫5、样品垫8和稀释垫4，所述硝酸纤维素膜3固定在pvc底板1上，在硝酸纤维素膜3左端搭接吸水垫2，右端搭接稀释垫4，在硝酸纤维素膜3右端设置标记物垫 5，标记物垫5上设置样品垫8和滤物垫14，稀释垫4搭接在滤物垫14顶部，在硝酸纤维素膜3上吸水垫2与标记物垫5之间包被检测线7和质控线6。
21.所述硝酸纤维素膜3上包被牛结核特异性表达蛋白为检测线，包被兔抗鸡lgy抗体为质控线。
22.所述牛结核特异性表达蛋白包括mpb70、mpb83、cfp-10、esat-6融合蛋白中的至少
一种
23.外壳上对应检测线7和质控线6开设视窗孔，对应样品垫8开设加样孔。所述滤物垫14 根据需要可选用有滤血垫,滤血垫用于分离全血中的红细胞。
24.在使用时，从加样孔加入样品液，一般样品液加入量为50-100μl，样品液经过滤物垫 14、样品垫8和标记物垫5后进入硝酸纤维素膜3，由于稀释垫4和吸水垫2均处于干燥状态，并且滤物垫14、样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和远小于两侧的吸水垫2和稀释垫4，样本液向吸水垫2方向流动，与检测线7和质控线6上包被的抗原(或抗体)进行免疫结合，并被捕获停留在检测线7和质控线6上，直至完成免疫层析。结果通过荧光层析读卡器进行检测、判读。通过计算c线荧光强度除以t线荧光强度的t/c值，对照阳性质控品梯度稀释的t/c值，得到被测样本中的抗体效价，若抗体效价大于30即为结核抗体阳性。
25.由于感染牛型结核分枝杆菌的牛体内抗体水平未必高到能被检测出来，但在前期结核杆菌的感染刺激下，在使用牛ppd做皮试实验(皮内变态反应，即tst)后，抗体会快速升高；而感染禽型结核分枝杆菌的牛体内抗体，在使用牛型ppd皮试刺激后，抗体并不会快速升高。在2至8周内再次使用牛型结核分枝杆菌抗体双孔快速检测卡进行抗体检测，用牛型ppd后的抗体效价减去ppd刺激前的抗体效价，差值大于30即为牛型结核分枝杆菌感染阳性。
26.实验实例数据如下
27.序号牛号tst前tst后前后差值1117052384352118399222643118455582131554119170168266511920915115100611922672237165711924225373348811926728395367911928520868-1401011928917597580
28.数据显示，在tst后抗体明显增高，但9号样本(牛号119285)抗体没有明显升高反而下降，前后差为-140，因此判定为牛型结核感染阴性。显然，通过本发明方法，通过tst后检测抗体可大幅提升敏感性，采用tst前后差值判定，可大幅提高特异性，减少不必要的淘汰牛。
29.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。