一种美白原料功效评价机理及测试方法与流程

1.本发明涉及化妆品功效评价技术领域，尤其涉及的是一种美白原料功效评价机理及测试方法。


背景技术：

2.由于皮肤问题增多，人们对于美白、祛斑产品的需求也逐渐增多，根据数据显示，全球35％的人群都在使用皮肤美白产品，皮肤美白产品已成为化妆品市场上重要的品类之一，市场前景广阔。
3.目前，美白产品功效及质量良莠不齐，许多原料商及品牌方易忽视产品的实际功效作用与作用机理之间的关系，出现了产品不能达到甚至不具备所宣称功效的现象。
4.此外，产品的美白功效检测也较为单一，没有设计机理对应功效的整体检测方案。然而消费者大多不具备专业的美白知识，对此类产品认知片面，且容易走进美白的误区，从而被一些急功近利的商家所利用。
5.因此，现有美白评价体系存在缺陷，需要针对其作用机理确定其功效。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种美白原料的作用机理研究，旨在解决现有技术中缺少完整的针对美白原料机理进行功效评价的问题。
7.本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：
8.第一方面，一种美白原料的作用机理研究，其中，包括：
9.初筛功效模块，用于对待评价美白原料的功效进行筛选；
10.细胞评价模块，用于对通过筛选的所述待评价美白原料作用于细胞时，对美白效果进行评价；
11.作用机理研究模块，用于对作用于细胞时有美白效果的所述待评价美白原料进行作用机理的研究；
12.以及人体临床评价模块，用于对细胞及动物组织起到美白效果的所述待评价美白原料作用于皮肤时，对皮肤肤色的指标进行评价；
13.所述初筛功效模块，用于对所述待评价美白原料进行自由基清除测试和酪氨酸酶抑制测试，并判断所述自由基清除和酪氨酸酶抑制测试的测试值是否大于阈值；
14.当测试值大于阈值时，进入所述细胞评价模块；
15.所述细胞评价模块，用于对所述待评价美白原料进行细胞黑素合成量及酪氨酸酶含量的测试，并判断所述细胞黑素合成量及酪氨酸酶含量是否大于阈值；
16.当测试值大于阈值时，进入所述机理研究模块；
17.所述机理研究模块，用于对所述待评价美白原料进行线粒体裂变和融合相关基因测试和erk-1/2和mitf蛋白磷酸化测试，并判断所述线粒体裂变相关基因和erk-1/2和mitf蛋白磷酸化是否大于阈值；
18.所述人体临床评价模块包括：评价单元和评价报告输出单元；
19.所述评价单元，用于评价美白原料人体安全性及使用所述待评价美白原料前、后皮肤肤色的指标结果；
20.所述评价报告输出单元，用于输出所述评价单元的评价结果。
21.所述的初筛功效模块，其中，所述自由基清除测试包括：对羟自由基清除率测定、dpph自由基清除率测定和abts
+
自由基清除率测定中的一种或多种。
22.所述的初筛功效模块，其中，所述酪氨酸酶抑制测试包括：以左旋多巴为底物，对酪氨酸双酚酶抑制率测定。
23.所述的细胞评价模块，其中，所述待评价美白原料用于细胞时，对美白效果进行评价包括：体外b16细胞黑素合成抑制测试、细胞内酪氨酸酶抑制测试。
24.所述的作用机理研究模块，其中，所述待评价美白原料用于细胞时，对美白效果进行机理研究包括：b16细胞线粒体裂变和融合相关基因测试、b16细胞erk-1/2和mitf蛋白磷酸化测试。
25.所述的人体临床评价模块，其中，对皮肤的肤色指标进行评价，评价的内容包括美白淡斑和/或提亮肤色。
26.可选地，所述的人体临床评价模块，其中，评价所述美白淡斑包括：评价使用所述待评价美白原料前后皮肤黑色素m值和/或红斑e值。
27.可选地，所述的人体临床评价模块，其中，评价所述提亮肤色包括：评价使用所述待评价美白原料前后皮肤颜色ita
°
值和/或亮度l值。
28.所述的美白原料机理研究，其中，在进行细胞的美白效果评价之前还包括：对所述待评价美白原料进行毒性测试，得到所述待评价美白原料的安全使用浓度范围；
29.所述细胞的美白评价，在所述安全使用浓度范围内进行。
30.第二方面，一种上述所述的美白原料功效评价机理及测试方法，其中，方法包括：
31.对待评价美白原料的功效进行筛选，得到所述待评价美白原料的自由基清除测试值、酪氨酸酶抑制测试值和美白测试值；
32.当所述美白测试值大于阈值时，将所述待评价美白原料用于细胞，对美白效果进行评价；
33.对待所述待评价美白原料用于细胞时，得到所述评价美白原料的b16细胞黑素合成抑制测试值、细胞内酪氨酸酶抑制测试值；
34.当所述美白测试值大于阈值时将所述待评价美白原料用于细胞对作用机制进行研究；
35.对待所述待评价美白原料用于细胞机理研究时，得到所述评价美白原料的b16细胞线粒体裂变测试值、b16细胞内erk-1/2和mitf蛋白磷酸化测试值。
36.当所述机理测试值大于阈值时，将所述待评价美白原料用于皮肤，对皮肤的肤色指标进行评价，得到评价报告。
37.有益效果：本发明首次针对美白原料构建出一个针对机理的功效评价方法，解决了目前原料单一评价方法的问题，通过美白原料机理可以快速的筛选待评价美白原料的功效，当所筛选出的功效满足预设要求时，才进行后续功效测试、评价，避免了全流程评价导致检测成本较高，浪费研发、检测、市场资源。利用该评价系统可以帮助企业完成功效宣称
备案的需求。
附图说明：
38.图1是本发明中美白原料机理研究图；
具体实施方式
39.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.本发明提供了一种美白原料的作用机理研究，研究包括：初筛功效模块，用于对待评价美白原料的功效进行筛选；细胞评价模块，用于对通过筛选的所述待评价美白原料作用于细胞时，对美白效果进行评价；作用机理研究模块，用于对作用于细胞时有美白效果的所述待评价美白原料进行作用机理的研究；以及人体临床评价模块，用于对细胞及动物组织起到美白效果的所述待评价美白原料作用于皮肤时，对皮肤肤色的指标进行评价；
41.所述初筛功效模块，用于对所述待评价美白原料进行自由基清除测试和酪氨酸酶抑制测试，并判断所述自由基清除和酪氨酸酶抑制测试的测试值是否大于阈值；所述细胞评价模块，用于对所述待评价美白原料进行细胞黑素合成量及酪氨酸酶含量的测试，并判断所述细胞黑素合成量及酪氨酸酶含量是否大于阈值；所述机理研究模块，用于对所述待评价美白原料进行线粒体裂变和融合相关基因测试和erk-1/2和mitf蛋白磷酸化测试，并判断所述线粒体裂变相关基因和erk-1/2和mitf蛋白磷酸化是否大于阈值；一方面，初筛指的是对美白原料对自由基的清除率、清除效果，对fe
3+
的还原能力测定，对酪氨酸酶抑制率进行测定、评价。另一方面，所述机理上研究还包括基因转录水平、蛋白翻译水平的研究。
42.需要说明的是，细胞层面美白机理评价要依据对酪氨酸酶抑制率效果程度及文献检索该美白原料的细胞层面美白机理。若酪氨酸酶抑制率极低，且文献也明确表示该美白原料的细胞层面美白机理不同，从检测成本出发，则省略该层面的功效评价。通常，细胞层面的功效测试前应首先测定原料的毒性，保证功效检测是在安全浓度范围内进行。
43.当该美白原料被文献证明有美白效果可证明该美白原料在细胞层面有美白机理，则可进行细胞层面的美白功效验证；文献中无该原料的美白功效，可进行初筛功效评价模块进行筛选后考虑做细胞模块。
44.在本实施例中，所述人体临床评价模块，用于在所述待评价美白原料用于皮肤时，对皮肤结果进行评价；包括评价单元和评价报告输出单元；所述判断单元，用于判断所述分子层面测试的测试值是否大于阈值；当所述分子层面测试值大于阈值时，进入所述细胞、动物组织评价模块；所述评价报告输出单元，用于输出所述评价单元的评价结果。也即是说，只有在满足了筛选、细胞测试值大于阈值时，才进行皮肤效果评价，从而可以避免，出现美白测试值小于阈值还进行皮肤测试造成研发、检测、市场资源浪费的问题发生。需要说明的是，所述阈值指的是美白原料所能达到的最低美白效果，该阈值可以根据行业规定或者实际的使用经验进行设置，通过设置该阈值作为一个衡量标准，可以方便对美白效果进行评价。所述的皮肤结果指的是，志愿者在使用了该美白原料的配方产品后皮肤所发生的变化情况，如皮肤亮度、ita
°
、黑色素值、可见斑、不可见斑、棕斑等指标。
45.在本实施例中，所述评价报告输出单元所输出的结果包括美白原料对自由基的清除效果，酪氨酸酶抑制率以及细胞检测的结果、人体安全性及皮肤指标改善情况。
46.在本实施例中，通过初筛功效模块的快速筛选和细胞模块深层次机理筛选，筛选后采用人体使用效果做进一步的评价，所述的人体使用效果评价，即是待评价的美白原料制作成护肤成品，志愿者使用后，对使用周期内的脸部皮肤进行前后对比，来评价该美白原料的美白效果。从而实现了，从美白原料的机理、细胞、人体的多维度、多层级评价，完成“机理-功效”逻辑链，使评价更加全面，帮助企业完成功效宣称备案的需求。
47.基于相同的发明构思，本发明还提供一种美白原料功效评价机理及测试方法，该方法是基于前述所述的评价体系。所述方法包括：
48.s10、对待评价美白原料的功效进行筛选，得到所述待评价美白原料的自由基清除测试值和美白测试值。
49.具体来说，对所述待评价美白原料的功效进行初步筛选，初步筛选的项目包括自由基清除测试和酪氨酸酶抑制测试；通过测试得出待评价美白原料的自由基清除测试值和酪氨酸酶抑制测试值。并将所得到的测试值同所设置的阈值进行比较。需要说明的是，此处的阈值可以根据行业中所设定的标准来进行设置，当然也可以根据具体的原材的性能来进行设置。所述的阈值是指当达到或超过该值时，说明有效果。
50.s20、当所述美白测试值大于阈值时，将所述待评价美白原料用于细胞，对美白效果进行评价。
51.具体来说，对筛选后的(满足初步筛选要求的)待评价美白原料进行细胞层面的测试，得到所述待评价美白原料的体外b16细胞黑素合成抑制值、细胞内酪氨酸酶抑制测试值。
52.s30、当所述美白测试值大于阈值时，将所述待评价美白原料用于细胞，对作用机理进行研究。
53.具体来说，对筛选后的待评价美白原料进行细胞层面的测试，得到所述待评价美白原料的b16细胞线粒体裂变测试值、细胞内erk-1/2和mitf蛋白磷酸化测试值。
54.s40、当所述机理测试值大于阈值时，将所述待评价美白原料用于皮肤，对皮肤的肤色指标进行评价，得到评价报告。
55.在本实施例中，所述提供的评价方法，简单、全面，能够为企业完成功效宣称备案的需求。
56.下面通过具体的实施例来对本发明所提供的评价体系做进一步的解释说明。待检测美白原料为二裂酵母。
57.a-1.对于自由基清除的测试方法具体如下所示：
58.(1)二裂酵母对
·
oh自由基清除率测定。
59.邻二氮菲-fe
2+
是一种氧化还原指示剂，其呈色变化可反应出溶液中氧化还原状态的改变。h2o2/fe
2+
体系，通过fenton反应所产生的羟自由基(
·
oh)，邻二氮菲-fe
2+
水溶液可被羟自由基氧化为邻二氮菲-fe
3+
，从而使邻二氮菲-fe
2+
在510nm处的最大吸收峰消失，根据吸光度的变化，可推算出羟自由基的产量。
60.实验结果如下表所示：
61.表1二裂酵母对
·
oh自由基的清除作用
62.样品名称浓度
·
oh清除率(％)维生素c(阳性对照)0.25mg/ml95.5
±
0.5二裂酵母25％42.5
±
0.5
63.通过表1可知，在二裂酵母浓度为25％时，对
·
oh自由基的清除率达42.5
±
0.5％。
64.(2)二裂酵母对dpph自由基清除率测定。
65.1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(简称dpph)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使dpph乙醇溶液光吸收减弱。dpph乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可评价试验样品清除自由基的能力，即自由基清除活性的大小。
66.表2.二裂酵母对dpph自由基的清除作用
[0067][0068]
通过表2可知，随着二裂酵母浓度的增加，对dpph自由基的清除率也逐渐增加，在体积分数为50％时，对dpph自由基的清除率可达95.5
±
0.5％。
[0069]
(3)二裂酵母对abts
+
自由基清除率测定。
[0070]
在氧化剂存在时，abts将氧化变为abts
+
自由基，溶液将呈现绿色，在紫外734nm波长处有强吸收。当体系中加入自由基清除剂时，abts
+
的生成量将减少，溶液颜色将变浅，由墨绿色逐渐变为浅绿色，在734nm处的吸光度将变小，以此来测定该物质的abts
+
自由基清除率。
[0071]
表3二裂酵母对abts
+
自由基的清除作用
[0072][0073]
通过表3可知，随着二裂酵母浓度的增加，对abts
+
自由基的清除率也逐渐增加，在体积分数为20％时，对abts
+
自由基的清除率可达97.5
±
0.5％。
[0074]
通过多种分子化学实验方法高通量快速检测原料二裂酵母，从而实现多维度、全方面展现二裂酵母的自由基清除功效。结合上述数据，二裂酵母对
·
oh自由基、dpph及abts
+
均具有显著的清除效果，说明该原料具有良好的自由基清除效果。
[0075]
a-2.对于酪氨酸酶抑制的测试方法具体如下所示：
[0076]
酪氨酸酶作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在ph6.8的磷酸溶液中，可催化多巴转化成多巴醌，在分光光度计450nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的原料可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据吸光值的变化，评估原料对酪氨酸酶活性的抑制作用。
[0077]
表4抗二裂酵母对酪氨酸酶抑制率测定
[0078][0079][0080]
通过表4可知，随着二裂酵母浓度的增加，对酪氨酸酶抑制率也逐渐增强，在体积分数为25％时，对酪氨酸酶抑制率可达90.5
±
0.5％。
[0081]
酪氨酸酶抑制法一般用于测定美白剂对酪氨酸酶活性的抑制率，测定时间短、操作简便、所需费用低，适用于对美白剂进行大通量筛查。
[0082]
a主要涉及通过化学及生化酶法评价原料的功效，可实现低成本、高通量、更高效
筛选出具有显著功效的原料。通过a评价模块的评价，可快速确定原料二裂酵母的自由基清除及美白功效。在此基础上，进一步研究在细胞层面的功效。
[0083]
b涉及细胞方面的功效检测。
[0084]
在通过毒性实验确定该原料的安全使用浓度范围后，再进行该层面的美白功效检测。
[0085]
b16小鼠黑素瘤细胞是常用的研究黑素生成的细胞模型，通过测定美白原料作用于黑素细胞后黑素合成量及酪氨酸酶含量的变化，评价原料的美白活性。本试验分为三部分，第一部分基于b16细胞开展毒性检测，确定样品基于b16细胞的半抑制浓度(ic50)以及安全浓度,以cck8模型进行检测；第二部分基于b16细胞开展胞内酪氨酸酶抑制试验，检测样品的美白功效；第三部分基于b16细胞开展体外黑素合成抑制实验，比较不同样品的美白功效。
[0086]
第一部分：样品对b16细胞毒性检测，其结果如表11所示：
[0087]
表5.二裂酵母对b16细胞作用结果
[0088]
浓度(％)00.0780.1560.3130.6251.252.5510相对存活率(％)100.0102.3101.8103.0102.3101.5102.499.994.7
[0089]
由表5可知，二裂酵母的浓度为5％时，细胞存活率为99.98％，根据cck8模型检测结果，二裂酵母在5％范围内未表现出细胞毒性。
[0090]
第二部分：胞内酪氨酸酶抑制实验检测，其结果如表6所示：
[0091]
表6.二裂酵母对b16细胞胞内酪氨酸酶抑制作用结果
[0092]
浓度(％)02.552mg/mlα-熊果苷(阳性对照)相对抑制率(％)0.06.810.415.3
[0093]
由表6可知，二裂酵母的浓度为2.5％、5％时，胞内酪氨酸酶抑制率分别为6.8％、10.4％。
[0094]
第三部分：样品对b16细胞体外黑素合成抑制作用检测，其结果如表7所示：
[0095]
表7.二裂酵母对b16细胞体外黑素合成抑制作用结果
[0096]
浓度(％)02.552mg/mlα-熊果苷(阳性对照)相对抑制率(％)012.632.239.8
[0097]
由表7可知，二裂酵母的浓度为2.5％、5％时，黑素合成抑制率分别为12.6％、32.2％。
[0098]
b评价主要涉及细胞方面的功效检测，首先探究了二裂酵母对细胞的毒性研究，在安全毒性范围内对其美白功效进行研究。
[0099]
c评价涉及细胞层面的机理研究。
[0100]
在通过对其美白功效进行研究，确认其有效后，再进行该层面的机理研究。机理测试可通过基因转录水平和蛋白翻译水平测试作用机理，测试方法如下所示。
[0101]
c-1.机理研究(基因转录水平)方法具体如下所示：
[0102]
drp1、fis1和mtp18是线粒体裂变蛋白，而opa1、mfn1和mfn2是线粒体融合蛋白，通过qpcr法检测其mrna水平的变化。其结果如表8所示：
[0103]
表8.二裂酵母对b16细胞线粒体裂变和融合相关基因转录的作用结果
[0104]
浓度(％)02.55阳性对照drp1相对表达量(％)100.0135.2162.5165.7fis1相对表达量(％)100.0146.7157.9164.3mtp18相对表达量(％)100.0124.6145.2153.7opa1相对表达量(％)100.082.653.446.2mfn1相对表达量(％)100.073.165.258.7mfn2相对表达量(％)100.055.433.229.6
[0105]
由表8可知，二裂酵母的浓度为2.5％、5％时，drp1相对表达量分别为135.2％、162.5％；fis1相对表达量分别为146.7％、157.9；mtp18相对表达量分别为124.6％、145.2％；opa1相对表达量分别为82.6％、53.4％；mfn1相对表达量(％)分别为73.1％、65.2％；mfn2相对表达量(％)分别为55.4％、33.2％。
[0106]
c-2.机理研究(蛋白水平)方法具体如下所示：
[0107]
线粒体裂变导致活性氧(ros)的产生增加，从而激活ros-erk信号通路，进一步诱导小眼相关转录因子(mitf)的磷酸化。mitf的磷酸化导致其泛素化和蛋白酶体降解，随后下调黑色素生成，因此通过western blot的方法检测erk 1/2和mitf的磷酸化。其结果如表8所示：
[0108]
表9.二裂酵母对b16细胞erk 1/2和mitf蛋白磷酸化的作用结果
[0109]
浓度(％)02.55阳性对照p-erk1/2相对表达量(％)100.0124.7136.9138.3p-mitf相对表达量(％)100.0133.2154.5155.2
[0110]
由表9可知，二裂酵母的浓度为2.5％、5％时，p-erk1/2相对表达量分别为124.7％、136.9％；p-mitf相对表达量分别为133.2％、154.5％。
[0111]
d评价涉及在人体层面评价二裂酵母的美白功效，美白效果测试可使用皮肤颜色测试仪及visia-cr面部扫描仪相关参数确定样品的提亮肤色及美白功效。其中，需测定的参数如下所示：
[0112]
(1)皮肤颜色ita
°
；
[0113]
(2)皮肤亮度l；
[0114]
(3)皮肤黑色素m值；
[0115]
(4)皮肤红斑e值；
[0116]
(5)棕斑数量；
[0117]
(6)可见斑数量；
[0118]
(7)红色特征数量；
[0119]
d-1.皮肤颜色测试结果如表10所示：
[0120]
表10.受试者脸部皮肤颜色ita
°
测量结果
[0121][0122]
由表10结果可知：使用2％二裂酵母和4％二裂酵母的受试者各个时间点的ita
°
均变大，且使用4％二裂酵母的受试者ita
°
值增长率均比使用2％二裂酵母的受试者要高。
[0123]
d-2.皮肤亮度测试结果如表11所示：
[0124]
表11.受试者脸部皮肤亮度l测量结果
[0125][0126]
由表11可知，使用2％二裂酵母和4％二裂酵母的受试者各个时间点的l值均变大，且使用4％二裂酵母的受试者l值增长率均比使用2％二裂酵母的受试者要高。
[0127]
d-3.皮肤黑色素m值测试结果如表12所示：
[0128]
表12受试者脸部皮肤黑色素m值测量结果
[0129]
[0130]
由表12可知，使用2％二裂酵母和4％二裂酵母产品的受试者各个时间点的m值均降低，且使用4％二裂酵母产品的受试者m值降低率均比使用2％二裂酵母产品的受试者要高。
[0131]
d-4.皮肤红斑e值测试结果如表13所示：
[0132]
表13.受试者脸部皮肤红斑e值测量结果
[0133][0134][0135]
由表13可知，使用0％二裂酵母、2％二裂酵母和4％二裂酵母的受试者各个时间点的e值变化比率一致，说明二裂酵母没有减少红斑的功效。
[0136]
针对二裂酵母原料，本发明从分子水平功效分析出发，高通量筛选该原料的功效作用。并结合细胞进一步确定其功效及其作用机理，在此数据基础上，设计二裂酵母基础配方并用于人体功效检测。
[0137]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。