DNA链置换的四面体纳米探针在制备基于熵驱动检测ATP的试剂中的应用及方法和产品

本发明涉及生物检测领域，具体涉及dna链置换的四面体纳米探针在制备基于熵驱动检测atp的试剂中的应用，还涉及检测atp的及方法和试剂盒。

背景技术：

1、三磷酸腺苷(atp)是生物体中不可缺少的生物小分子，作为能量提供者，在调节细胞代谢中起着至关重要的作用。atp可用于多种酶促反应并进行细胞和组织的生命活动。atp的高低往往间接反映了人体的健康状况。例如，低血糖、帕金森病和阿尔茨海默病、肿瘤、心血管疾病等都与异常的atp水平有关。因此，atp检测对于各种生物过程都有非常重要的意义。

2、传统的atp检测方法包括荧光分析法、质谱法和高效液相色谱法(hplc)等，但是这些方法操作复杂、耗时、仪器试剂昂贵、成本较高、灵敏度较低、不能进行细胞内原位检测，应用范围受到了限制。

3、因此，亟需建立一种无酶、灵敏度高、特异性强的atp检测方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明建立一种熵驱动dna链置换动态回路为能量动力学控制的程序化核酸自组装过程，即：整个反应的驱动力来源于dna杂交时体系焓变所释放的自由能，通过精确编程设计双链复合体和燃料链，使得一条触发序列的存在即可启动双链复合体和燃料连的一系列级联链置换反应，并促使触发序列在杂交-链置换-解离-再杂交过程的循环利用。将熵驱动dna链置换动态回路与四面体有机结合，利用dna四面体的一条边作为双链复合体，一个顶点自组装适配体/触发序列复合体，atp分子可与atp适配体特异性结合，并释放触发序列，进而启动熵驱动dna链置换动态回路，以dna四面体作为穿膜载体，以熵驱动dna链置换动态回路实现细胞内atp的无酶恒温级联放大，进而可以实现细胞内atp在微-纳尺度的原位在体检测，具体原理如图1所示。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、dna链置换的四面体纳米探针在制备基于熵驱动检测atp的试剂中的应用，所述四面体纳米探针整体为四面体，所述四面体的一条双链上修饰有荧光基团和淬灭基团形成双链复合体，所述四面体上的顶点上还设置有设计自组装atp适配体/触发序列复合体和燃料链；

4、所述自组装atp适配体/触发序列复合体能够在含atp分子下特异结合atp，并释放触发序列；所述触发序列能够与修饰荧光基团和淬灭基团的双链复合体互补结合，并在燃料链作用下通过熵驱动释放荧光。

5、本发明优选的，所述双链复合体由修饰荧光基团的dna单链同时与荧光触发链的5’端和waste链的5’端互补结合，所述双链复合体上的荧光触发链5’末端修饰有淬灭基团。

6、本发明优选的，所述四面体的双链复合体链的一个顶点为游离序列，另一顶点为触发序列识别接头，所述触发序列识别接头与触发序列5’端互补，所述触发序列3’端与双链复合体的dna单链部分互补。

7、本发明优选的，所述燃料链的近顶点端与所述dna单链上与waste链和荧光触发链互补的序列互补。

8、本发明优选的，所述四面体的双链复合体由seq id no.3、seq id no.5和seq idno.6组装而成。

9、本发明优选的，所述四面体由seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq idno.7与双链复合体组成。

10、2、基于熵驱动检测atp的方法，将待测也与四面体纳米探针混匀，然后加入熵驱动工作液，在37℃下孵育2小时后，检测荧光信号值。

11、本发明优选的，所述熵驱动工作液各组分如下：10mm tris，5mm mgcl2，ph 8.0。

12、3、基于熵驱动检测atp的试剂盒，所述试剂盒含有四面体纳米探针，所述四面体纳米探针整体为四面体，所述四面体的一条双链上修饰有荧光基团和淬灭基团形成双链复合体，所述四面体上的顶点上还设置有设计自组装atp适配体/触发序列复合体和燃料链；

13、所述自组装atp适配体/触发序列复合体能够在含atp分子下特异结合atp，并释放触发序列；所述触发序列能够与修饰荧光基团和淬灭基团的双链复合体互补结合，并在燃料链作用下通过熵驱动释放荧光。

14、优选的，所述试剂盒还含有熵驱动工作液，各组分如下：10mm tris，5mm mgcl2，ph8.0。

15、本发明的有益效果在于：本发明通过精确编程设计双链复合体和燃料链，使得一条触发序列的存在即可启动双链复合体和燃料连的一系列级联链置换反应，并促使触发序列在杂交-链置换-解离-再杂交过程的循环利用。将熵驱动dna链置换动态回路与四面体有机结合，利用dna四面体的一条边作为双链复合体，一个顶点自组装适配体/触发序列复合体，atp分子可与atp适配体特异性结合，并释放触发序列，进而启动熵驱动dna链置换动态回路，以dna四面体作为穿膜载体，以熵驱动dna链置换动态回路实现细胞内atp的无酶恒温级联放大，本发明的方法可以在无酶恒温的情况下，即可完成对atp的细胞内外的高灵敏高特异检测，在操作的简单性及性价比上具有较大的优势。

技术特征：

1.dna链置换的四面体纳米探针在制备基于熵驱动检测atp的试剂中的应用，其特征在于：所述四面体纳米探针整体为四面体，所述四面体的一条双链上修饰有荧光基团和淬灭基团形成双链复合体，所述四面体上的顶点上还设置有设计自组装atp适配体/触发序列复合体和燃料链；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述双链复合体由修饰荧光基团的dna单链同时与荧光触发链的5’端和waste链的5’端互补结合，所述双链复合体上的荧光触发链5’末端修饰有淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述四面体的双链复合体链的一个顶点为游离序列，另一顶点为触发序列识别接头，所述触发序列识别接头与触发序列5’端互补，所述触发序列3’端与双链复合体的dna单链部分互补。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述燃料链的近顶点端与所述dna单链上与waste链和荧光触发链互补的序列互补。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述四面体的双链复合体由seq id no.3、seq id no.5和seq id no.6组装而成。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述四面体由seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.7与双链复合体组成。

7.基于熵驱动检测atp的方法，其特征在于：将待测也与四面体纳米探针混匀，然后加入熵驱动工作液，在37℃下孵育2小时后，检测荧光信号值；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述熵驱动工作液各组分如下：10mmtris，5mm mgcl2，ph 8.0。

9.基于熵驱动检测atp的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有四面体纳米探针，所述四面体纳米探针整体为四面体，所述四面体的一条双链上修饰有荧光基团和淬灭基团形成双链复合体，所述四面体上的顶点上还设置有设计自组装atp适配体/触发序列复合体和燃料链；

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有熵驱动工作液，各组分如下：10mm tris，5mm mgcl2，ph 8.0。

技术总结
本发明公开了DNA链置换的四面体纳米探针在制备基于熵驱动检测ATP的试剂中的应用及方法和产品，通过精确编程设计双链复合体和燃料链，使得一条触发序列的存在即可启动双链复合体和燃料连的一系列级联链置换反应，并促使触发序列在杂交‑链置换‑解离‑再杂交过程的循环利用，将熵驱动DNA链置换动态回路与四面体有机结合，实现无酶恒温的情况下，成对ATP的高灵敏高特异检测，在操作的简单性及性价比上具有较大的优势。

技术研发人员：阳莎,詹新宇,陈鸣,唱凯,罗洁,陈志国,王彬潘,赵爽,徐含青,冯柳,高雪平,汤晓琦
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11