一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(HE)染色法的制作方法

一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色法
技术领域
1.本发明涉及一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色方法和步骤，属于病理学技术，应用在病理学、组织胚胎学和临床实验诊断等生物医学学科领域。


背景技术：

2.常规苏木素-伊红染色法(业内简称he染色法)是形态组织病理学最重要的技术之一，也是病理医生能否做出准确诊断的关键因素。石蜡切片现有的的苏木素-伊红（he）染色法大致包括1.染色前步骤：脱蜡、2.苏木素和伊红染色步骤、3.染色后步骤：脱水和透明、4.封片4大步骤。如果细分每步操作的话，总共约为25-27个具体步骤(参考中华医学会编写、人民军医出版社出版的《临床技术操作规范-病理学分册》第23-24页)。作为一种多步骤、多因素决定的染色方法，he染色均存在诸多因素影响最后的染色质量以及最终的病理诊断结果，而he染色的复杂性不单单是技术层面的，还包含一些围绕he染色的辅助工作。比如设备和染色液的配套、每天染色缸的检查、染色过程中的试剂更换、染色缸的定期清洗、切片的规整等需要大量人力的工作，不仅费时费力，还污染空气环境，危害人员健康。
3.迄今为止，病理学业内技术人员对改进苏木素-伊红(he)染色做了一些创新性的工作。有注重在改良染液配方和染色方法的专利(如申请号2015109879358，201610342055x，2017106851082，2017100097997，2018103387014，2018116127477, 201911193743, 2021101040932)，也有注重在染色过程中的某个步骤如石蜡切片脱蜡方法(如申请号2006101298085)和使用二甲苯替代试剂如松节油、蓖麻油、白油和柠檬烯等物质来实现石蜡切片脱蜡的专利(如申请号:2016107771023，2016107771023，2020107828808)；也有注重在改良染色试剂盒和规范染色步骤的的专利(如申请号: 2021111628796, 2022103489936, 2022102724835)。公知的现有石蜡切片苏木素-伊红（he）染色步骤在浸入染液染色前和出染液染色后到封片分别要经过至少12个以上额外步骤需要使用包括二甲苯和梯度浓度的酒精(注：酒精为俗称，化学名称为乙醇)。尽管上述的少有专利中有尝试使用其它有机溶剂或方法替换二甲苯的脱蜡步骤，但业内使用者反映效果不十分理想，也并未实质性地消除使用包括酒精在内的有机溶剂和减少染色步骤。现有技术冗长的染色步骤和与之相随的换液及清洗等是导致上述大量人力工作的主要因素，同时二甲苯和酒精的挥发也污染实验室环境和危害工作人员健康。因此，发明一种常规石蜡切片全程的苏木素-伊红（he）染色步骤都不使用二甲苯以及酒精或替代试剂的方法和简短的染色步骤，使其应用在管理he染色流程对于提升病理技术室工作质量与效率、减少试剂成本和消除环境污染至关重要。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的上述缺点，本发明的目的是提供一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色法，该方法操作简单，环保、安全，染色效果好。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
作为优选，所述的一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色法，石蜡切片的he染色主要包括以下步骤：(1)浸入脱蜡液ⅰ在70-95℃温度范围3-5分钟;(2)浸入脱蜡液ii在70-95℃温度范围1-5分钟;(3)浸入脱蜡液iii在70-95℃温度范围1-5分钟;(4)移入40-60℃温度范围的温水洗1-2次每次30秒-1分钟;(5)浸入苏木素染液5-15分钟;(6)水洗1-2次共1-2分钟;(7)浸入水性分化液分化10-60秒;(8)水洗1-2次每次1-2分钟;(9)浸入碳酸锂饱和水溶液蓝化1-2分钟;(10)水洗1-2次每次5-10分钟;(11)浸入伊红染液染20-60秒;(12)水洗1-2次每次1-2分钟;(13)移入50-80℃度温度范围热风烘干5-15分钟，直到切片完全干燥为止;(14)封片胶封片。
6.作为优选，所述的一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色法使用的苏木素染液和伊红染液(he) 试剂成分和配制是公知的、没有专利保护的传统现有技术方法。
7.作为优选，所述的脱蜡液为表面活性剂，表面活性剂包括十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通 x-100、曲拉通 x-200、曲拉通 x-405；脱蜡液是用水配制的按体积或重量百分比浓度为0.5%一2%的水溶液，充分搅拌混匀；表面活性剂在每种单独使用时或在2种或多种混合使用时，总浓度都为0.5-2%，(注：曲拉通英文名称triton)。
8.作为优选，所述的脱蜡液为家用洗涤液，家用洗涤液包括洗衣粉、洗衣液和洗碗剂；脱蜡液的配制方法是每种单独家用洗涤液用水按体积或重量百分比稀释成0.5%一2%浓度的水溶液，充分搅拌混匀。
9.作为优选，所述的脱蜡液i-iii的脱蜡步骤减少为二步脱蜡液i-ii同样适用，当石蜡切片浸入到该脱蜡液后在达到时间移出之前，从脱蜡液底部补液占总体积的10-30%以流走表层脱蜡液，消除表面浮层混合物，至少脱蜡液i需要放液补液。
10.作为优选，所述的水性分化液是包括稀盐酸和曲拉通 x-100表面活性剂的混合水溶液；混合后稀盐酸的浓度为0.5-2%和曲拉通 x-100的浓度为0.05-1%，添加表面活性剂防止因水的张力导致切片上组织分化不均匀，表面活性剂是上述表面活性剂其中任选的一种。(注：本发明不采用公知的盐酸酒精溶液分化)。
11.作为优选，所述的水洗液是包括曲拉通 x-100表面活性剂，浓度为0.05-1%的水溶液，以减少水洗液时水对石蜡切片载玻片的表面张力，保证切片上组织表面水化的一致性；表面活性剂是上述表面活性剂其中任选的一种。
12.作为优选，所述的切片经伊红染液和水洗后，用50-80℃温度范围热风烘干5-15分钟至烘干切片代替酒精脱水，使用含透明剂的封片胶包括用二甲苯配制的封片胶透明切片和封片，透明和封片两步合一。
13.作为优选，所述的一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色法，其特征在于,
所述的石蜡切片的he染色步骤中的没有表明温度的步骤指室温，浸入染液的时间长短、水洗的次数和时间长短依据环境条件而调整，使用时依切片干净透明为优选。
14.作为优选，所述的石蜡切片的he染色步骤的执行有两种选择，使用手工操作和染色机自动完成。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的无苯无酒精he染色方法消除二甲苯和酒精有机溶解对人体的不良影响，操作过程和染色步骤简短易行，不产生环境污染物，且费用低廉，切片染色效果和现有常规he染色法的一样好，满足显微镜下病理诊断的要求。
附图说明
16.图1为实施例一中无苯无酒精he染色步骤的显微镜下染色效果图举例(肿瘤活检标本，he染色，显微镜高倍放大)。
17.图2为实施例二表一中无苯无酒精he染色步骤的显微镜下染色效果图举例(肠镜活检标本，he染色，显微镜高倍放大) 。
18.图3为实施例二表一中公知技术的he染色步骤的显微镜下染色效果图举例(肠镜活检标本，he染色，显微镜高倍放大) 。
19.图4为实施例三无苯无酒精he染色步骤的显微镜下染色效果图举例(腹水癌细胞蜡块标本，he染色，显微镜高倍放大）。
20.图5为实施例四无苯无酒精he染色步骤的显微镜下染色效果图举例(脂肪组织标本，he染色，显微镜低倍放大)。
21.图6为实施例五无苯无酒精he染色步骤的显微镜下染色效果图举例(肿瘤瘤组织标本，he染色，显微镜高倍放大)。
具体实施方式
22.实施例中使用的苏木素和伊红染液(he)的试剂成分和配制以及现有技术he染色步骤都是公知的、没有专利保护的传统或现有技术方法(参考《临床技术操作规范-病理学分册》第23-26页)。
23.现结合实施例对本发明进一步说明：所述的一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色法，石蜡切片的染色主要包括以下步骤：(1)浸入脱蜡液ⅰ在70-95℃温度范围3-5分钟;(2)浸入脱蜡液ii在70-95℃温度范围1-5分钟;(3)浸入脱蜡液iii在70-95℃温度范围1-5分钟;(4)移入40-60℃温度范围的温水洗1-2次每次30秒-1分钟;(5)浸入苏木素染液5-15分钟;(6)水洗1-2次每次1-2分钟;(7)浸入水性分化液分化10-60秒;(8)水洗1-2次每次1-2分钟;(9)浸入碳酸锂饱和水溶液蓝化1-2分钟;(10)水洗1-2次每次5-10分钟;
(11)浸入伊红染液染20-60秒;(12)水洗1-2次每次1-2分钟;(13)移入50-80℃度温度范围热风烘干5-15分钟，直到切片完全干燥为止;(14)封片胶封片。
24.所述的脱蜡液为表面活性剂，表面活性剂包括十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通 x-100、曲拉通 x-200、曲拉通 x-405；脱蜡液是用水配制的按体积或重量百分比浓度为0.5%一2%的水溶液，1充分搅拌混匀；表面活性剂在每种单独使用时或在2种或多种混合使用时，总浓度都为0.5-2%。
25.所述的脱蜡液为家用洗涤液，家用洗涤液包括洗衣粉、洗衣液和洗碗剂；脱蜡液的配制方法是每种单独家用洗涤液用水按体积或重量百分比稀释成0.5%一2%浓度的水溶液，充分搅拌混匀。
26.所述的脱蜡液i-iii的脱蜡步骤减少为二步脱蜡液i-ii同样适用，当石蜡切片浸入到该脱蜡液后在达到时间移出之前，从脱蜡液底部补液占总体积的10-30%以流走表层脱蜡液，消除表面浮层混合物，至少脱蜡液i需要放液补液。
27.所述的水性分化液是包括稀盐酸和曲拉通 x-100表面活性剂的混合水溶液；混合后稀盐酸的浓度为0.5-2%和曲拉通 x-100的浓度为0.05-1%，表面活性剂是上述表面活性剂其中的一种；添加表面活性剂防止因水的张力导致切片上组织分化不均匀；本发明不采用公知的盐酸酒精溶液。
28.所述的水洗液是包括曲拉通 x-100表面活性剂的水溶液，浓度为0.05-1%；表面活性剂是上述表面活性剂其中的一种。
29.所述的切片经伊红染液和水洗后，用50-80℃温度范围热风烘干5-15分钟至烘干切片代替酒精脱水，使用含透明剂的封片胶包括用二甲苯配制的封片胶透明切片和封片，透明和封片两步合一。
30.所述的一种无二甲苯和酒精的苏木素-伊红(he)染色法，其特征在于,所述的石蜡切片的he染色步骤中的没有表明温度的步骤指室温，浸入染液的时间长短、水洗的次数和时间长短依据环境条件而调整，使用时依切片干净透明为优选。
31.所述的石蜡切片的he染色步骤的执行有两种选择，使用手工操作和染色机自动完成。
32.实施例一：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液、脱蜡温度和染色步骤，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
33.1、脱蜡液的配制：1升水中加入曲拉通 x-100 5毫升(百分比浓度为0.5%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
34.2、水性分化液的配制：1升水中加入5毫升盐酸(百分比浓度为0.5%)和0.5毫升曲拉通 x-100(百分比浓度0.05%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
35.3、水洗液的配制：1升水中加入0.5毫升曲拉通 x-100(百分比浓度为0.05%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
36.4、石蜡切片的he染色主要包括以下步骤：(1)脱蜡液ⅰ在95℃温度浸3分钟，切片移出前放液补液一次(10%体积);(2)脱蜡液ii在95℃温度浸3分钟，切片移出前放液补液一次(10%体积);
(3)脱蜡液iii在95℃温度浸3分钟，切片移出前放液补液一次(10%体积);(4)移入60℃的温水洗1次1分钟;(5)浸入苏木素染液5分钟;(6)水洗1次1分钟;(7)浸入水性分化液分化10秒;(8)水洗1次1分钟;(9)浸入碳酸锂饱和水溶液蓝化1分钟;(10)水洗1次5分钟;(11)浸入伊红染液染30秒;(12)水洗1次1分钟;(13)移入80oc温度的热风烤干10分钟，直到切片完全干燥;(14)封片胶封片。
37.实施例二：测试每个染色步骤使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液、脱蜡温度和染色步骤，两个染色步骤用同一染色机先后分别自动完成。
38.1、脱蜡液的配制：1升水中加入曲拉通 x-100 10毫升和曲拉通 x-405 10毫升(混合使用时，总百分比浓度为2%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
39.2、水性分化液的配制：1升水中加入10毫升盐酸(百分比浓度为1%)和5毫升曲拉通 x-100(百分比浓度为0.5%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
40.3、水洗液的配制：1升水中加入1毫升曲拉通 x-100(百分比浓度为0.1%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
41.4、表一为比较实施例二无苯无酒精he染色步骤和公知技术的he染色步骤。
42.表一中无苯无酒精he染色步骤和公知技术的he染色步骤的染色结果：根据现有临床病理技术规范要求：每张切片脱蜡干净和透明。显微镜下观察，细胞核染色为蓝色至深蓝色，核仁染色为淡紫红色，细胞浆、红细胞、胶原间质等的染色为不同程度的红色，背景清晰和对比度好。图2和图3分别为两种he染色方法效果，均判定为合格。
43.实施例三：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液、脱蜡温度和染色步骤，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
44.1、脱蜡液的配制：1升水中加入十二烷基磺酸钠20克(百分比浓度为2%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
45.2、水性分化液的配制：1升水中加入20毫升盐酸(百分比浓度为2%)和10毫升曲拉通 x-100(百分比浓度为1%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
46.3、水洗液的配制：1升水中加入10毫升曲拉通 x-100(百分比浓度为1%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
47.4、石蜡切片的he染色包括以下步骤：(1)脱蜡液ⅰ在70℃温度浸5分钟，切片移出前放液补液一次(30%体积);(2)脱蜡液ii在70℃温度浸5分钟，忽略放液补液;(3)脱蜡液iii在70℃温度浸5分钟，忽略放液补液;(4)移入60℃的温水洗2次1分钟;(5)浸入苏木素染液内15分钟;(6)水洗2次共2分钟;(7)浸入水性分化液分化1分钟;(8)水洗1次2分钟;(9)浸入碳酸锂饱和水溶液蓝化2分钟;(10)水洗1次5分钟;(11)浸入伊红染液染1分钟;(12)水洗2次2分钟;(13)移入60oc温度的热风烤干15分钟，直到切片完全干燥;(14)封片胶封片。
48.实施例四：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液、脱蜡温度和染色步骤，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
49.1、脱蜡液的配制：1升水中加入家用洗碗剂20毫升(百分比浓度为2%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
50.2、水性分化液的配制：1升水中加入5毫升盐酸(百分比浓度为0.5%)和0.5克十二烷基磺酸钠(百分比浓度为0.05%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
51.3、水洗液的配制：1升水中加入0.5克十二烷基磺酸钠(百分比浓度为0.05%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
52.4、石蜡切片的he染色包括以下步骤(仅使用脱蜡液ⅰ和ii, 忽略iii)：(1)脱蜡液ⅰ在90℃温度浸5分钟，切片移出前放液补液一次(20%体积);(2)脱蜡液ii在90℃温度浸3分钟，切片移出前放液补液一次(20%体积);(3)移入40℃的温水洗2次2分钟;(4)浸入苏木素染液内10分钟;(5)水洗2次2分钟;(6)浸入水性分化液分化40秒;(7)水洗2次2分钟;(8)浸入碳酸锂饱和水溶液蓝化2分钟;(9)水洗2次5分钟;(10)浸入伊红染液染30秒;(11)水洗2次1分钟;(12)移入80oc温度的热风烤干10分钟，直到切片完全干燥;(13)封片胶封片。
53.实施例五：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
54.1、脱蜡液的配制：1升水中加入20毫升曲拉通 x-100(百分比浓度为2%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
55.2、石蜡切片的he染色步骤及其它试剂和实施例四相同。
56.实施例六：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
57.1、脱蜡液的配制：1升水中加入家用洗衣粉粉末20克(百分比浓度为2%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
58.2、石蜡切片的he染色步骤及其它试剂和实施例四相同。
59.实施例七：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
60.1、脱蜡液的配制：1升水中加入加入十二烷基磺酸钠5克(百分比浓度为0.5%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
61.2、石蜡切片的he染色步骤及其它试剂和实施例四相同。
62.实施例八：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
63.1、脱蜡液的配制：1升水中加入家用洗衣粉粉末5克(百分比浓度为0.5%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
64.2、石蜡切片的he染色步骤及其它试剂和实施例四相同。
65.实施例九：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
66.1、脱蜡液的配制：1升水中加入家用洗衣剂20毫升(百分比浓度为2%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
67.2、石蜡切片的he染色步骤及其它试剂和实施例四相同。
68.实施例十：测试使用一整染色架（30张）石蜡切片，测试脱蜡液，无苯无酒精he染色步骤依靠手工操作完成。
69.1、脱蜡液的配制：1升水中加入十二烷基硫酸钠粉末20克(百分比浓度为2%)，充分搅拌混匀制备而成；调整ph值为7.0。
70.2、石蜡切片的he染色步骤及其它试剂和实施例四相同。
71.以上实施例的石蜡切片he染色效果评价：根据现有临床病理技术规范要求，每张切片脱蜡干净和透明。显微镜下观察，细胞核染色为蓝色至深蓝色，核仁染色为淡紫红色，细胞浆、红细胞、胶原间质等的染色为不同程度的红色，背景清晰和对比度好。以上全部实施例的所有切片he染色效果，经病理专业人员显微镜下判定均为合格，本说明书只例举6张显微镜下图片,见图1、图2、图3、图4、图5和图6。
72.表二、比较无苯无酒精he染色和现有常规he染色的优缺点。比较项目无苯无酒精he染色现有常规he染色试剂成本低(表面活性剂)高(二甲苯+酒精)染色时间短，约30分钟长，约60分钟
染色步骤简，少于15步换缸繁，约25步换缸试剂毒性无毒性物质二甲苯危害健康安全危害非易燃试剂易燃试剂，加大安全风险环境公害不污染环境，不回收污染环境，要回收染色效果好，满足病理诊断好，满足病理诊断
73.以上所述仅为本发明的优选实施方式。本技术领域的普通技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,在不脱离本发明原理的前提下,本发明还可作出若干变化和改进,这些变化和改进也应视为本发明的保护范围。