一种基于水溶性芘衍生物的罗库溴铵的快速可视化检测方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于水溶性芘衍生物的罗库溴铵的快速可视化检测方法。


背景技术：

2.罗库溴铵是一种非去极化神经肌肉松弛剂，为季铵盐结构，具有刚性疏水的甾醇骨架。相比于其他肌肉松弛药物，罗库溴铵具有起效快、代谢产物少、无明显心血管不良反应、无蓄积作用等优点，现已广泛应用于临床麻醉技术。
3.但是在不同患者中，罗库溴铵的作用时间和剂量效果均不同且无法预测。这在一定程度上导致了手术中容易发生罗库溴铵的过量使用，从而使拔除气管导管后发生由罗库溴铵导致的肌松残留情况比率较高，约达45％。肌松残留会导致患者在拔出气管后呼吸控制不足，恢复不完全，造成生命危险。而数十年来，医生们一直使用神经刺激的方法粗略判断残留神经肌肉阻滞的程度，无法准确掌握罗库溴铵的具体浓度。因此，快速准确地监测罗库溴铵的含量对于控制患者状态及开展药动学研究具有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于水溶性芘衍生物的罗库溴铵的快速可视化检测方法，克服了现有检测罗库溴铵的方法中存在的检测效率低，且成本高的缺陷。
5.为了实现上述目的，本发明提供了以下的技术方案：
6.第一，本发明提供了式(i)所示的芘衍生物和舒更葡糖钠在检测罗库溴铵中的应用：
[0007][0008]
上述式(i)所示结构的芘衍生物具有良好的水溶性，并且能够实现高灵敏度且特异性地检测罗库溴铵，在检测中呈现出明显的特异性和抗干扰能力。
[0009]
本发明的式(i)所示结构的芘衍生物在舒更葡糖钠溶液中构象和聚集状态对外界刺激展现出不同的状态，进而引起其光学特性的变化，如荧光的开启或淬灭现象。
[0010]
因此上述芘衍生物和舒更葡糖钠用于罗库溴铵的检测时，能够实现荧光响应的效果，即芘衍生物的荧光发生淬灭，并且在紫外灯照射下该淬灭效果肉眼可见。
[0011]
并且，上述芘衍生物和舒更葡糖钠对罗库溴铵的检测限低至0.3μmol/l，且在溶液中的可视化效果明显。
[0012]
本发明提供的芘衍生物和舒更葡糖钠之所以具有优异的罗库溴铵检测性能，可能是基于如下原理：本发明的芘衍生物与舒更葡糖钠在溶液中可以通过多重非共价作用形成包合物，罗库溴铵可以将芘衍生物从舒更葡糖钠中置换出来，导致探针荧光信号的改变。
[0013]
本发明对于上述式(i)所示结构的芘衍生物的来源并无特殊限定，可以为一般市售或按照本领域技术人员熟知的方法制备。
[0014]
为了获得更高质量和收率的式(i)所示结构的芘衍生物，本发明提供如下所述的优选的制备方法制备式(i)所示结构的芘衍生物，具体地：
[0015]
第二，本发明提供了上述芘衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0016]
(1)在第一溶剂存在下，将式(ii)所示的化合物与三溴化磷进行第一接触反应，得到式(iii)所示的化合物；
[0017]
(2)在第二溶剂存在下，将所述式(iii)所示的化合物与三甲胺进行第二接触反应，得到式(i)所示的化合物。
[0018][0019][0020]
本发明对式(ii)所示的化合物的来源没有特别的限制，例如可以通过商购获得，也可以通过采用现有技术提供的方法合成得到。
[0021]
优选的，所述第一接触反应的条件包括：室温下搅拌2-3h。
[0022]
优选的，所述第二接触反应的条件包括：在35-45℃下搅拌反应24-28h。
[0023]
优选的，所述第一接触反应后还包括：所得反应混合物依次进行除溶剂处理和第一沉淀处理，得到式(iii)所示的化合物。
[0024]
优选的，所述第一沉淀处理具体包括：
[0025]
将除溶剂处理后所得粗产物固体通过硅胶色谱柱法进行洗脱纯化。
[0026]
所述硅胶色谱柱法的洗脱剂优选为乙醚/石油醚；
[0027]
所述乙醚/石油醚的体积比优选为10:90～5:95。
[0028]
优选的，所述第二接触反应后还包括：所得反应混合物进行除溶剂处理，得到式(i)所示的化合物。
[0029]
所述步骤(1)、步骤(2)中的第一溶剂、第二溶剂独立的优选为二氯甲烷和四氢呋喃中的任意一种或多种。
[0030]
第三，本发明提供了一种检测罗库溴铵的试剂、试纸或试剂盒，包括上述芘衍生物或上述制备方法制备的芘衍生物和舒更葡糖钠。
[0031]
第四，本发明提供了一种基于水溶性芘衍生物的快速可视化检测方法，具体的，本发明提供了一种检测罗库溴铵的方法，以上述芘衍生物或上述制备方法制备的芘衍生物和舒更葡糖钠作为探针。
[0032]
本发明优选的，所述探针的浓度为芘衍生物4-6μmol/l，舒更葡糖钠8-12μmol/l。所述芘衍生物的浓度进一步优选为5μmol/l，所述舒更葡糖钠的浓度进一步优选为10μmol/l。
[0033]
本发明具体检测方法优选如下：在10mmol/l ph＝7.4的pbs缓冲液中，上述探针浓度为芘衍生物5μmol/l，舒更葡糖钠10μmol/l进行罗库溴铵的光谱测试，检测时激发波长为350nm，激发光和发射光的狭缝宽度为1.0nm。选择发射波长为396nm处的荧光强度计算探针荧光淬灭效率，以罗库溴铵浓度为横坐标，以探针荧光淬灭效率为纵坐标，建立检测标准曲线。在10mmol/l ph＝7.4的pbs缓冲液中，上述探针浓度为芘衍生物5μmol/l，舒更葡糖钠10μmol/l进行罗库溴铵的可视化检测，在紫外灯照射下探针发生肉眼可识别的荧光淬灭。
[0034]
与现有技术相比，本发明提供了一种基于水溶性芘衍生物的快速检测方法，以式(i)所示结构的芘衍生物和舒更葡糖钠作为探针。上述芘衍生物具有良好的水溶性，并且能够实现高灵敏度且特异性地检测罗库溴铵。本发明提供的检测方法具有较高的检测效率和灵敏度，并且具有可视化的特点，应用方便。
附图说明
[0035]
图1为pbs缓冲液中(10mmol/l ph＝7.4)加入不同浓度罗库溴铵后探针(芘衍生物5μmol/l，舒更葡糖钠10μmol/l)的荧光淬灭效率(λ
ex
＝350nm，λ
em
＝396nm)，图1中插图是加入罗库溴铵前后在365nm的紫外灯照射下的照片；
[0036]
图2为pbs缓冲液中(10mmol/l ph＝7.40)探针(芘衍生物5μmol/l，舒更葡糖钠10μmol/l)与不同物质(10μmol/l)作用的荧光淬灭程度(λ
ex
＝350nm，λ
em
＝396nm)，(尿酸(uric acid，ua)、柠檬酸(citric acid，ca)、抗坏血酸(ascorbic acid，aa)、葡萄糖(glucose，glc)、mg
2+
、ca
2+
和hco
3－
)。
具体实施方式
[0037]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的基于水溶性芘衍生物的罗库溴铵的快速可视化检测方法进行详细描述。
[0038]
备用物质的制备：
[0039]
缓冲液的制备：按比例称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾固体，用蒸馏水配制成500ml浓度为10mmol/l的pbs缓冲溶液。将其放于4℃冰箱中保存备用。
[0040]
芘衍生物母液的制备：称取式(i)所示的固体，用蒸馏水配制成浓度为5mmol/l的母液，将其分装成相同体积的溶液于小瓶中备用。光谱测试时用配好的pbs缓冲溶液(10mmol/l,ph＝7.4)稀释至一定浓度用于测试。
[0041]
舒更葡糖钠母液的制备：称取舒更葡糖钠固体，用蒸馏水配制成浓度为10mmol/l的母液，将其分装成相同体积的溶液于小瓶中备用。光谱测试时用配好的pbs缓冲溶液(10mmol/l,ph＝7.4)稀释至一定浓度用于测试。
[0042]
待测物及干扰物的制备：将罗库溴铵用蒸馏水配制成浓度为1mmol/l储备液备用。
其他干扰物用蒸馏水配制成10mmol/l的储备液。将这些溶液放于4℃冰箱中保存备用。
[0043]
实际样品的制备：罗库溴铵注射液购买自默沙东公司，将罗库溴铵注射液在pbs缓冲液中稀释100倍后进行实验；胎牛血清购买自浙江天杭生物科技股份有限公司，将血清于3000mwco超滤管中以4000g转速离心15min，用所获得的超滤液进行实验。
[0044]
实施例1
[0045]
式(i)所示化合物的制备
[0046]
在0℃时，向溶于无水二氯甲烷(30ml)的1-芘丁醇(0.50g，1.80mmol)中，逐滴滴加溶于二氯甲烷(20ml)的三溴化磷(1.98mmol)，在30min内完成。随后将混合物在室温下搅拌反应2h。反应结束后，用水数次洗涤，将有机相蒸发干燥。再将所得固体通过硅胶色谱柱，用乙醚/石油醚(5:95，v/v)洗脱纯化，得到(iii)中所述化合物。将(iii)中所述化合物(0.10g，0.30mmol)添加到6ml三甲胺-乙醇溶液(33％，w/w)和6ml thf的溶液中，在40℃下搅拌24h。反应结束后，将反应混合物浓缩，再加入大量thf中干燥，得到(ⅰ)所示化合物(以下简称为芘衍生物)。
[0047]
其表征如下：1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.40(d,j＝9.5hz,1h),8.31-8.24(m,4h),8.16(m,2h),8.08(t,j＝7.8hz,1h),8.01(d,j＝8.0hz,1h),3.45-3.40(m,4h),3.09(s,9h),1.90(m,2h),1.80(m,2h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ136.6(s),131.4(s),130.9(s),129.9(s),128.5(s),127.94(s),127.92(s),127.80(s),127.08(s),126.68(s),125.51(s),125.47(s),125.34(s),124.74(s),124.61(s),123.88(s),65.79(s),52.82(s),32.57(s),28.43(s),22.34(s)。
[0048]
该探针在水中溶解良好，加水即可溶解。
[0049]
实施例2
[0050]
荧光光谱的测试：
[0051]
取1μl的芘衍生物母液、和1μl的舒更葡糖钠母液和998μl 10mmol/l的pbs缓冲液混合加入到1ml的样品池中，混合均匀后，测定探针缓冲液的荧光光谱，记波长为396nm下荧光强度为i0。随后，向样品池中逐渐加入一定浓度梯度的罗库溴铵，混合均匀后测定相应的荧光光谱，并记录396nm下荧光强度为i。
[0052]
结果如图1所示(也即，图1表示，pbs(10mmol/l,ph＝7.4)缓冲液中，前述芘衍生物在396nm处的荧光随罗库溴铵浓度的淬灭程度。qi＝[(i
0-i)/i0]
×
100％，λ
ex
＝350nm，激发光和发射光的狭缝宽度为1.0nm。)
[0053]
实验结果表明，前述芘衍生物在350nm的激发波长下被激发，发射出在396nm处的发射峰，随着罗库溴铵的加入，前述芘衍生物的荧光发射强度逐渐降低，当罗库溴铵浓度滴加至10μmol/l时，前述芘衍生物的淬灭程度达到了近50％。根据检测限的推算方法可知，探针对罗库溴铵的检测限为0.3μmol/l。
[0054]
图1中插图是加入罗库溴铵前后在365nm的紫外灯照射下的照片，可以看出，添加罗库溴铵后，相应的溶液荧光发生淬灭。
[0055]
实施例3
[0056]
选择性研究：
[0057]
选取检测罗库溴铵时常见干扰物，包括尿酸(uric acid，ua)、柠檬酸(citric acid，ca)、抗坏血酸(ascorbic acid，aa)、葡萄糖(glucose，glc)、mg
2+
、ca
2+
和hco
3－
。测试中
前述芘衍生物浓度为5μmol/l，舒更葡糖钠浓度为10μmol/l，所有干扰物浓度均为10μmol/l，在相同的测试条件下进行荧光光谱的测试。将加入干扰物前后探针在396nm处的荧光淬灭程度作为衡量前述探针对待测物的影响程度的参数。
[0058]
结果如图2所示(也即，图2表示，pbs(10mmol/l,ph＝7.4)缓冲液中，前述探针与罗库溴铵以及其他干扰物作用的荧光淬灭程度图)。
[0059]
从图中可以看出，除了罗库溴铵之外，所有其它物质的qi≈0，而罗库溴铵的qi≈50％，远高于其它化合物，此结果表明前述探针对罗库溴铵具有优异的选择性。
[0060]
实施例4
[0061]
实际样品的应用：
[0062]
为了验证该检测方法在实际样品中的可行性，选择罗库溴铵注射液用于加标回收率的测定。
[0063]
在添加2.0μmol/l、5.0μmol/l和8.0μmol/l罗库溴铵后，加标回收率分别为99.50％、101.60％和100.12％(rsd《5％)，结果表明该方法具有较好的准确度且能在罗库溴铵注射液中应用。
[0064]
实施例5
[0065]
选择胎牛血清探究生理条件下罗库溴铵的检测，检测方法及指标与前述检测步骤类似。
[0066]
在添加2.0μmol/l、5.0μmol/l和8.0μmol/l罗库溴铵后，加标回收率分别为93.03％、103.33％和107.56％(rsd《3％)，说明前述探针一定程度上可用于生理条件下罗库溴铵的定量检测。
[0067]
由上述结果可知，本发明的式(i)所示结构的芘衍生物具有良好的水溶性，并且能够实现高灵敏度且特异性地检测罗库溴铵。
[0068]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。