一种近红外荧光显微装置

1.本发明涉及显微装置技术领域，特别是涉及一种近红外荧光显微装置。


背景技术：

2.目前，荧光显微镜已经成为生物医学研究中的常用工具，它使用激发光照射标记特定组织、细胞、亚细胞结构的荧光探针，收集探针发射的荧光信号进行成像，可以对生物体内的特定目标进行示踪。然而，实验室中常用的荧光显微镜都是在可见光波段(400～700nm)进行成像，众所周知，很多生物体都是不透明的，可见光在生物组织内的穿透深度很差。因此，可见光波段的荧光显微镜对生物组织成像时的样品厚度一般不能超过100μm，这就大大限制了荧光显微镜在生物医学研究中的应用。
3.近红外荧光成像是近年来新兴的一种荧光成像技术，它在近红外波段(800～1700nm)进行成像，由于近红外光的波长长，散射低，在生物组织中的穿透深度更大，可以达到3～6mm，因此可以满足较厚组织、完整器官中荧光成像的需求，这使得近红外荧光成像成为化学、生物学、医学等领域的研究热点。现在已经有一些能够在近红外波段进行成像的荧光显微镜实现了产业化。然而，这些近红外荧光显微镜均只能对某一波段进行成像，而无法测量生物组织中荧光材料的发射光谱。由于生物组织的影响，荧光材料的发射光谱经常会与体外时不同，而荧光发射光谱的变化将给出生物组织与荧光材料相互作用的重要信息，这就使得研究人员迫切需要一种兼具显微光谱功能的近红外荧光显微装置。
4.现有技术公开了一种高尔基体靶向亚铁离子荧光探针及其制备方法和应用，属于亚铁离子探针技术领域。本发明探针分子式为：c27h42n2o4，具有如下结构式：本发明提供了一种准确性较高的能检测水环境和离体活细胞环境中高尔基体内亚铁离子的荧光分析法。探针与亚铁离子响应后，460nm处荧光强度增强。探针还可以通过共聚焦荧光显微镜检测离体活细胞中高尔基体内的亚铁离子，并进行荧光成像。该专利公开了通过探针获取460nm处的荧光成像，并未公开如何获取荧光材料的发射光谱以及如何获取更深处的荧光成像，这就使得研究人员迫切需要一种可以测量生物组织的深度大于460nm处的荧光光谱的近红外荧光显微装置。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种兼具显微光谱功能的近红外荧光显微装置。
6.为了实现上述目的，现提出的方案如下：
7.一种近红外荧光显微装置，其特征在于，包括荧光显微镜、分束系统、近红外相机和光谱仪，所述荧光显微镜用于将激光引射至样品上以激发样品生成近红外荧光束，所述近红外荧光束经过所述分束系统分为第一近红外荧光束和第二近红外荧光束，所述第一近红外荧光束入射所述近红外相机，所述第二近红外荧光束入射所述光谱仪。
8.可选的，所述荧光显微镜包括第一消色差透镜、二向色镜、反射镜和物镜，所述分束系统包括分束镜，所述荧光显微镜用于将激光引射至样品上以激发样品生成近红外荧光
束，所述近红外荧光束经过所述分束系统得到第一近红外荧光束和第二近红外荧光束，包括：
9.所述激光经过所述第一消色差透镜，被所述二向色镜反射后，再经过所述反射镜反射进入所述物镜，通过所述物镜激发所述样品，得到所述样品产生的近红外荧光束；
10.所述近红外荧光束被所述物镜收集，经所述反射镜反射，穿透所述二向色镜，被所述分束镜分为所述第一近红外荧光束和第二近红外荧光束。
11.可选的，该装置还包括第二消色差透镜和滤光片，所述第二近红外荧光束穿透所述第二消色差透镜后，经过所述滤光片入射所述近红外相机。
12.可选的，所述二向色镜的光轴与所述第一消色差透镜的光轴成45度角设置，使所述二向色镜将所述第一消色差透镜投射的激光偏转90
°
投射至所述反射镜；
13.所述分束镜的光轴与所述二向色镜的光轴成45度角设置，使所述近红外荧光束经过所述分束镜分束的所述第一近红外荧光束和所述第二近红外荧光束互为垂直光束。
14.可选的，所述反射镜的光轴与所述二向色镜的光轴成45度角放置，且所述反射镜的光轴与所述物镜的光轴位于同一直线上，使所述反射镜将所述二向色镜投射的激光偏转90
°
后垂直射入所述物镜。
15.可选的，所述第一消色差透镜和第二消色差透镜的焦距范围为30～200mm。
16.可选的，所述二向色镜为长波通，截止波长大于所述激光波长。
17.可选的，所述分束镜的分束比例为10:90～90:10，工作波长包含1000～1700nm波段。
18.可选的，所述近红外相机的感光芯片为ingaas阵列，分辨率为320
×
256或640
×
512，像元尺寸为10μm、15μm或20μm，帧速率大于或等于50hz，响应波长范围为900～1700nm，暗电流小于或等于150e-，读出噪声小于或等于50e-。
19.可选的，所述光谱仪检测范围包含900～1700nm波段，波长分辨率低于10nm。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
21.本发明通过使用分束系统将近红外荧光束分成两束近红外荧光束，两束近红外荧光束分别入射光谱仪和近红外相机，通过光谱仪测量生物组织的光谱信息，并且通过近红外相机对生物组织进行荧光成像。在使用时，准直激光经过第一消色差透镜，被二向色镜反射后经过物镜聚焦用于激发样品，样品生成的近红外荧光束被物镜收集，近红外荧光束穿透二向色镜被分束镜分为两束，一束进入光谱仪，另一束经第二消色差透镜、滤光片，在近红外相机上成像，实现了近红外显微镜兼具显微光谱功能。
附图说明
22.图1是本发明实施例提供的近红外荧光显微装置结构示意图；
23.图2是本发明实施例提供的具体应用场景的显微成像结果图；
24.图3是本发明实施例提供的具体应用场景的样品荧光发射光谱的测量图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例一
27.为了实现近红外显微镜兼具显微光谱功能，在本发明的一些实施例中，提供了一种近红外荧光显微装置，近红外荧光显微装置可以包括荧光显微镜、分束系统、近红外相机8和光谱仪9。
28.具体的，荧光显微镜可以用于将激光引射至样品上以激发样品生成近红外荧光束，近红外荧光束经过分束系统分为第一近红外荧光束和第二近红外荧光束，第一近红外荧光束入射近红外相机8，第二近红外荧光束入射光谱仪9，近红外相机8可以通过第一近红外荧光束对样品的生物组织进行荧光成像，光谱仪9可以通过第二近红外荧光束测量样品的生物组织的光谱信息。
29.在上述实施例中，由于本发明使用分束系统将近红外荧光束分成两束近红外荧光束，两束近红外荧光束分别入射光谱仪和近红外相机，通过光谱仪测量样品的生物组织的光谱信息，并且通过近红外相机对样品的生物组织进行荧光成像，实现了近红外显微镜兼具显微光谱功能。
30.进一步的，在本发明的一些实施例中，近红外相机8的感光芯片可以为ingaas阵列，分辨率为320
×
256或640
×
512，像元尺寸为10μm、15μm或20μm，帧速率大于或等于50hz，响应波长范围为900～1700nm，暗电流小于或等于150e-，读出噪声小于或等于50e-，示例如响应的波长可以为900nm、1000nm、1700nm。
31.在本发明的一些实施例中，光谱仪9检测范围可以包含900～1700nm波段，波长分辨率低于10nm，示例如可以检测900nm、1100nm、1700nm的波段。
32.实施例二
33.本实施例与实施例一的区别在于，在实施例一的基础上，本实施例对近红外荧光显微装置作进一步的说明。
34.在本发明的一些实施例中，示例如图1所示，黑色箭头可以表示激光光路，荧光显微镜可以包括第一消色差透镜1、二向色镜2、反射镜3和物镜4，分束系统可以包括分束镜5，荧光显微镜用于将激光引射至样品上以激发样品生成近红外荧光束，近红外荧光束经过分束系统得到第一近红外荧光束和第二近红外荧光束，第一近红外荧光束和第二近红外荧光束分别射入近红外相机8和光谱仪9，具体如下：
35.荧光成像：激光经过第一消色差透镜1，被二向色镜2反射后，再经过反射镜3反射进入物镜4，通过物镜4激发样品，得到样品产生的近红外荧光束。
36.具体的，激光可以是波长为785nm的准直激光，近红外荧光束波长范围可以是780～1100nm，第一消色差透镜1可以是将光线的色差进行校正的透镜组，二向色镜2可以是对一定波长的光几乎完全透过，而对另一些波长的光几乎完全反射，由荧光显微镜发射的激光可以经过第一消色差透镜1，被二向色镜2反射后，再经过反射镜3反射进入物镜4，通过物镜4激发样品，得到样品产生的近红外荧光束。
37.光谱测量：近红外荧光束被物镜4收集，经反射镜3反射，穿透二向色镜2，被分束镜5分为第一近红外荧光束和第二近红外荧光束。
38.具体的，分束镜5可以用于将入射光束分成具有一定光强比的透射与反射两束光，
示例如具有相同光强比的中性分束镜，样品产生的近红外荧光束可以被物镜4收集，经反射镜3反射，穿透二向色镜2，被分束镜5分为第一近红外荧光束和第二近红外荧光束。
39.在本发明的一些实施例中，第一消色差透镜1的焦距范围可以为30～200mm，示例如可以调节焦距为30mm、100mm、200mm。
40.在本发明的一些实施例中，二向色镜2可以为长波通，截止波长大于激光波长。
41.在本发明的一些实施例中，二向色镜2的光轴可以与第一消色差透镜1的光轴成45度角设置，使二向色镜2将第一消色差透镜1投射的激光偏转90
°
投射至反射镜3。
42.在本发明的一些实施例中，分束镜5的分束比例可以为10:90～90:10，工作波长包含1000～1700nm波段，示例如分束比例为10:90、30:70、90：10，工作波段可以是1000nm、1400nm、1700nm。
43.在本发明的一些实施例中，物镜的倍率可以为4x、5x、10x或20x，波长范围为480～1800nm，工作距离为15～40mm，数值孔径为0.13～0.40，示例如波长可以是480nm、1000nm、1800nm,工作距离可以是15mm、25mm、40mm,数据孔径可以是0.13、0.30、0.40。
44.本实施例的其他结构与实施一相同，此处不再赘述。
45.实施例三
46.本实施例与实施例二的区别在于，在实施例二的基础上，本实施例还可以包括第二消色差透镜6和滤光片7。
47.在本发明的一些实施例中，第二近红外荧光束穿透第二消色差透镜6后，经过滤光片7入射近红外相机8。
48.具体的，第二消色差透镜6的焦距范围可以为30～200mm，示例如可以调节焦距为30mm、100mm、200mm，滤光片7可以是用来选取所需辐射波段，可以通过选取不同型号的滤光片7来获取需要的近红外荧光束在射近红外相机8中进行荧光成像，第二近红外荧光束可以穿透第二消色差透镜6后，经过滤光片7入射近红外相机8。
49.需要说明的是，本发明实施例可用于离体的细胞、组织、器官或活体小动物的光学成像，包括但不限于来源于实验动物的未经处理的离体细胞、肿瘤组织、脑组织或心肌组织等，来源于小动物的离体心脏或大脑等，来源于小动物的经过组织透明化处理的离体大脑等，来源于活体小动物的肿瘤组织、心脏或大脑等。本发明实施例可以对进行荧光标记的上述样品进行荧光成像。
50.下面以两个具体应用场景说明采用本发明的近红外荧光显微镜对离体培养的细胞进行成像：
51.场景一、将水溶性吲哚七甲川菁(ir820)溶于pbs中得到水溶液，加入离体培养的大鼠海马神经元培养基内孵育15min，pbs缓冲液洗三次后，置于近红外荧光显微装置上进行显微成像。使用的准直激光波长为785nm，二向色镜截止波长为800nm，使用20x物镜，波长范围4801800nm，工作距离20mm，数值孔径0.40，分束镜分束比例50:50，滤光片为1000nm长波通，即近红外相机接收1000～1700nm波段的荧光信号。如图2所示，在100μm的标尺显示情况下，可以清楚的观察到ir820对海马神经元的染色情况。
52.场景二、将水溶性吲哚七甲川菁(ir820)溶于pbs中得到水溶液，使用785nm激光激发，测量其荧光发射光谱。另外将该溶液加入离体培养的大鼠海马神经元培养基内，同样孵育15min，pbs缓冲液洗三次后，置于近红外荧光显微装置上。使用的准直激光波长为785nm，
二向色镜截止波长为800nm，使用20x物镜，波长范围480～1800nm，工作距离20mm，数值孔径0.40，分束镜分束比例50:50，光谱仪检测范围为800～1500nm，波长分辨率为10nm，积分时间为100ms。如图3所示，横坐标表示波长，纵坐标表示归一化荧光强度，实线表示处于神经元细胞中的ir820荧光发射光谱，虚线表示处于溶液中的ir820荧光发射光谱，从图中可以看出，进入神经元的ir820的荧光发射光谱与溶液中的ir820的荧光发射光谱并不一致。
53.本实施例的其他结构与实施二相同，此处不再赘述。
54.最后，还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
55.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间可以相互组合，且相同相似部分互相参见即可。
56.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。