一种中药组合物的特征图谱检测方法及质量控制方法与流程

本发明涉及中药制剂，具体涉及一种中药组合物的特征图谱检测方 法及质量控制方法。

背景技术：

1、金连消风颗粒为治疗荨麻疹的方剂，处方由荆芥、防风、金银花、连翘、地 黄、丹参、赤芍、川芎、苦参、蒲公英组成，具有清热凉血，散风止痒之功效。 临床用于慢性荨麻疹血燥风热证，症见面部、躯干或四肢皮肤瘙痒及风团和斑块， 色红或苍白。

2、金连消风颗粒主要活性成分包括挥发油类、色原酮类、有机酸类、苯乙醇苷 类、苷类、酚酸类物质。现代研究表明荆芥具有祛风止痒功效，对多种细菌及病 毒有一定的抑制作用，所以被广泛用于治疗各种炎症；防风是治疗感冒、头痛、 风湿关节痛和破伤风的最常用的传统中药之一，主要具有解热、镇痛、镇静、抗 炎、抗菌、抗肿瘤、提高机体免疫功能、抗过敏、抗凝血等药理作用；防风水煎 液能够降低毛细血管通透性而起到抗炎作用；升麻素苷和5-o-甲基维斯阿米醇 苷均能明显抑制二甲苯引起的皮肤肿胀，降低炎症反应。；都为金连消风颗粒主 要药效成分。

3、为了控制中药制剂的质量水平，保证临床用药安全及疗效，需要对中药制剂 进行质量控制。由于中药及其复方制剂均为多组分复杂体系，但现行的显微鉴别、 含量测定等方法都不足以解决这一问题。

4、目前尚未有针对金连消风颗粒中药味进行特征图谱指认或薄层鉴别的方法， 更没有有效的质量控制方法。因此需要建立能提供丰富鉴别信息的可以评价其质 量的检测方法。进而实现有效的质量控制，保证临床用药安全及疗效。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中药组合物的特征图谱检 测方法及质量控制方法，尤其在于提供一种治疗慢性荨麻疹的中药组合物的特征 图谱检测方法及质量控制方法，特别在于提供一种金连消风颗粒及其中间体的特 征图谱检测方法及质量控制方法，该特征图谱检测方法可以建立重现性高的特征 图谱，从而可实现有效的金连消风颗粒的质量标准控制。

2、为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

3、第一方面，本发明提供一种中药组合物的特征图谱检测方法，采用超高效液 相色谱法(uplc)，所述超高效液相色谱的流动相包括流动相a和流动相b； 所述中药组合物含有金银花、赤芍、防风和连翘；所述流动相a为乙腈，流动 相b为酸溶液；

4、所述超高液相色谱的洗脱梯度包括：

5、

6、上述洗脱梯度中，“→”代表由一个比例向另一个比例变化，例如在0～15 分钟时间段，流动相a的体积比由2％渐变至9.5％，流动相b的体积比由98％ 渐变至90.5％。

7、本发明利用超高液相色谱-可见紫外检测法，并通过选择特定的洗脱梯度， 建立金连消风颗粒或其中间体的特征图谱，该图谱基线平稳、信息量较大，色谱 峰分布均匀且分离效果较好，且具有快速、简便、很好的重现性和稳定性。通过 本发明方法得到的特征图谱确定了8个特征峰，指认出金连消风颗粒中的金银花、 赤芍、防风和连翘四味关键药味，同时指认芍药苷、升麻素苷、5-o-甲基维斯阿 米醇苷和连翘苷四种化学成分。

8、利用该高效液相色谱构建特征图谱，可以进一步提高金连消风颗粒或其中 间体的质量控制水平，有效控制中药的质量，保证临床用药安全及疗效。

9、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中药 组合物包括含有金银花、赤芍、防风和连翘四味药的复方制剂或其中间体，例如 金连消风颗粒或其中间体。中间体指的是处方药味经提取、浓缩、干燥处理得到 的中间产物，即干膏粉。

10、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中药 组合物是由下列中药原料药制备而成：荆芥、防风、金银花、连翘、地黄、丹参、 赤芍、川芎、苦参、蒲公英。即为金连消风颗粒或其中间体。

11、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中药 组合物是由如下重量份的原料制备而成：荆芥2-10份、防风2-10份、金银花2-10 份、连翘2-10份、地黄2-10份、赤芍1-8份、丹参2-10份、川芎1-8份、苦参 1-8份、蒲公英1-8份。

12、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中药 组合物是由如下重量份的原料制备而成：荆芥4-8份、防风4-8份、金银花4-8 份、连翘4-8份、地黄4-8份、赤芍2-6份、丹参4-8份、川芎2-6份、苦参2-6 份、蒲公英2-6份。

13、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中药 组合物是由如下重量份的原料制备而成：荆芥6份、防风6份、金银花6份、连 翘6份、地黄6份、赤芍4份、丹参6份、川芎4份、苦参4份、蒲公英4份。

14、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述复方 制剂的剂型包括颗粒剂、片剂或散剂。例如金连消风颗粒。

15、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

16、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述色谱 柱的长为100mm，直径为2.1mm，粒径为1.5～2.1μm。

17、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述十八 烷基硅烷键合硅胶的粒径为1.7μm-1.8μm。

18、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述流动 相b酸溶液为甲酸溶液、乙酸溶液或磷酸溶液，优选所述酸溶液的浓度为 0.05％-0.15％，例如0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、 0.13％、0.14％或0.15％等，优选0.1％。前述百分比为体积分数。

19、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述流动 相a为乙腈，所述流动相b为浓度为0.1％的磷酸溶液。

20、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱的检测波长为190～350nm，例如230nm、231nm、232nm、233nm、 234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm或250nm等，优 选240nm。

21、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱检测中流动相的流速为0.29-0.31ml/min，例如0.29ml/min、0.30 ml/min、0.31ml/min等，优选0.3ml/min。

22、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱的柱温为33～37℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等，优选 35℃。

23、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱的进样量为2-4μl，优选2μl。

24、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱的色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相a为 乙腈，流动相b为浓度为0.1％的磷酸溶液，检测波长为240nm，流速为0.3ml/min， 柱温为35℃，进样量为2μl，洗脱梯度如下：

25、

26、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱中供试品溶液的制备方法包括：使用甲醇或乙醇作为溶剂进行提取， 得到供试品溶液，优选使用甲醇提取。

27、本发明优选使用甲醇作为溶剂溶解待测样品金连消风颗粒或其中间体，相较 于其他溶剂，能够获得分离度更好的特征图谱。

28、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述提取 有效成分的方法包括萃取、超声或柱层析，优选柱层析，进一步优选采用中性氧 化铝柱进行柱层析。

29、本发明优选使用中性氧化铝柱进行提取分离，相较于超声等方式，最终获得 的特征图谱分离度更好。

30、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中性 氧化铝柱中填料的粒径为100～200目。

31、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中性 氧化铝柱中填料的质量为6g。

32、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中性 氧化铝柱的内径为1.5cm。

33、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述中性 氧化铝柱采用干法装柱。

34、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱中供试品溶液的制备方法包括：

35、取中药组合物，置具塞锥形瓶中，加入甲醇，称定重量，超声处理，冷却后 用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液，蒸干，残渣加80％甲醇使溶 解，置中性氧化铝柱上，用80％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲 醇溶解，转移至量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶 液。

36、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超声 的功率为250w，频率为40khz。

37、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超声 的时间为45分钟。

38、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述超高 效液相色谱中供试品溶液的制备方法包括：

39、取中药组合物适量，可选地进行研细，取2-4g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟， 取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸 干，残渣加80％甲醇5ml使溶解，置中性氧化铝柱(100～200目，6g，内径为 1.5cm，干法装柱)上，用80％甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％ 甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

40、示例性地，上述供试品溶液制备中，若中药组合物为中间体，取样量为2g， 若为颗粒剂，取样量为4g。

41、如上所述的中药组合物的特征图谱检测方法，作为一种优选方式，所述特征 图谱检测方法得到的特征图谱可指认出芍药苷、升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇 苷和连翘苷四种物质，且所述特征图谱呈现与对照特征图谱相对应的8个特征峰， 其相对保留时间在规定值的±10％之内。

42、第二方面，本发明还提供一种中药组合物的质量控制方法，所述质量控制方 法包括第一方面所述的特征图谱检测方法。

43、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述质量控制方法还包括薄 层鉴别。

44、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述质量控制方法包括对金 连消风颗粒或其中间体中赤芍、连翘进行薄层鉴别，所述赤芍、连翘的薄层鉴别 方法中所使用的展开剂为三氯甲烷-甲醇的混合溶剂，优选三氯甲烷-甲醇的体积 比为5:1。

45、本发明通过采用特定的薄层鉴别方法，特别是选择体积比为5:1的三氯甲烷 -甲醇混合溶液作为展开剂，能够同时对赤芍、连翘进行薄层鉴别，节约了时间 和成本，且分离度好，呈现清晰。

46、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述赤芍、连翘的薄层鉴别 方法中，供试品溶液的制备方法包括：取金连消风颗粒或其中间体，加入溶剂， 超声处理，滤过，取滤液，通过大孔吸附树脂柱，依次用水、15％～25％乙醇、 35％～45％乙醇洗脱，收集35％～45％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即 得供试品溶液。

47、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述赤芍、连翘的薄层鉴别 方法中，供试品溶液的制备方法包括：取金连消风颗粒，加入溶剂，超声处理， 滤过，取滤液，通过大孔吸附树脂柱，依次用水、20％乙醇、40％乙醇洗脱，收 集40％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得供试品溶液。

48、本发明进一步优选依次采用水、20％乙醇、40％乙醇洗脱进行洗脱，薄层鉴 别的分离度更佳。

49、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述大孔吸附树脂柱为d101 型大孔吸附树脂柱，优选地，所述d101型大孔吸附树脂柱的内径为1cm，柱高 为5cm。

50、本发明进一步优选采用大孔吸附树脂进行洗脱，进一步纯化供试品，能够提 高薄层鉴别的分离度。

51、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述赤芍、连翘的薄层鉴别 方法中，供试品溶液的制备方法包括：取金连消风颗粒或其中间体，加入75％ 乙醇，超声处理30分钟，滤过，取滤液2ml，通过d101型大孔吸附树脂柱，依 次用水、20％乙醇、40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使 溶解，即得供试品溶液。

52、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述赤芍、连翘的薄层鉴别 方法具体包括如下步骤：

53、(1)制备供试品溶液：

54、取金连消风颗粒或其中间体1.5-3g，可选地进行研细，置锥形瓶中，加75％ 乙醇10ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液2ml，通过d101型大孔吸附树脂 柱(内径为1cm，柱高为5cm)，以水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml 洗脱，弃去洗脱液，再用40％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干。残渣加甲醇 1ml使溶解，作为供试品溶液。

55、示例性地，上述供试品溶液制备中，若中药组合物为中间体，取样量为1.5g， 若为颗粒剂，取样量为3g。

56、(2)制备对照药材溶液：

57、取赤芍对照药材约0.5g，连翘对照药材约1g，分别加水30ml，置瓶中，煎 煮20分钟，滤过，滤液蒸干，加75％乙醇10ml，超声处理30分钟，滤过，取 滤液2ml，通过d101型大孔吸附树脂柱(内径为1cm，柱高为5cm)，用水25ml 洗脱，弃去洗脱液，再用20％乙醇25ml洗脱，弃去洗脱液，再用40％乙醇30ml 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为赤芍对照药材溶液和连 翘对照药材溶液。

58、(3)制备对照品溶液：

59、取连翘苷对照品、芍药苷对照品，分别加甲醇各制成每1ml含1mg的溶液， 得到连翘苷对照品溶液和芍药苷对照品溶液。

60、(4)薄层鉴别：

61、吸取对照品溶液2μl，供试品和对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶g 薄层板上，以体积比为5:1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。 供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑 点。

62、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述赤芍、连翘的薄层鉴别 方法中还包括赤芍阴性对照溶液和连翘阴性对照溶液的制备，制备方法与所述供 试品溶液制备方法相同。

63、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述质量控制方法包括对金 连消风颗粒或其中间体中丹参进行薄层鉴别，方法包括：

64、取金连消风颗粒或其中间体1.5-2.5g，可选地进行研细，加75％甲醇30ml， 超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣用水30ml溶解，用10％盐酸调节ph 值至1～2，用乙醚振摇提取2次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇 2ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材约1g，加水30ml，煎煮20分 钟，滤过，滤液蒸干。残渣加75％甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸 干，残渣用水30ml使溶解，用10％盐酸调节ph值至1～2，用乙醚振摇提取2 次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇4ml使溶解，作为对照药材溶 液。再取丹酚酸b对照品、丹参素钠对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg、 0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通 则0502)试验。吸取丹酚酸b对照品溶液4μl，丹参素钠对照品溶液1μl，丹参 对照药材溶液、供试品溶液各2μl，分别点于同一硅胶h或硅胶g薄层板上，以 三氯甲烷-丙酮-甲酸(7:4:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫 酸溶液，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和丹参素钠对照品色 谱相应的位置上显相同颜色斑点，在105℃加热至斑点显色清晰，再置日光下检 视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色 的斑点。

65、示例性地，上述供试品溶液制备中，若中药组合物为中间体，取样量为1.5g， 若为颗粒剂，取样量为2.5g。

66、如上所述的质量控制方法，作为一种优选方式，所述质量控制方法包括对金 连消风颗粒或其中间体中苦参进行薄层鉴别，方法包括：

67、取金连消风颗粒或其中间体约3-4.5g，可选地进行研细，加浓氨试液0.3ml， 三氯甲烷25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解， 作为供试品溶液。取缺苦参阴性样品4.5g，同法制备缺苦参阴性样品溶液。再取 苦参碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色 谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述对照品溶液5μl， 供试品溶液和阴性样品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙 酯-丙酮-甲苯-浓氨试液(4:3:2:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾试液，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置，上显相同 颜色的斑点。

68、示例性地，上述供试品溶液制备中，若中药组合物为中间体，取样量为3g， 若为颗粒剂，取样量为4.5g。

69、相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：

70、(1)本发明利用超高液相色谱-可见紫外检测法，并通过选择特定的洗脱梯 度，建立金连消风颗粒中间体及其复方制剂的特征图谱，该图谱基线平稳、信息 量较大，色谱峰分布均匀且分离效果较好，且具有快速、简便、很好的重现性和 稳定性。通过本发明方法得到的特征图谱确定了8个特征峰，指认出金连消风颗 粒中的金银花、赤芍、防风和连翘四味药，同时指认芍药苷、升麻素苷、5-o- 甲基维斯阿米醇苷和连翘苷四种化学成分。

71、(2)在本发明的优选技术方案中，本发明通过优选择超高效液相色谱的特 定检测条件，包括特定的色谱柱、流动性、流速、柱温，与上述洗脱程序搭配， 使得到的特征图谱最优化。

72、(3)在本发明的另一个优选技术方案中，采用特定的供试品制备方法，使 用甲醇作为溶剂，采用中性氧化铝柱进行洗脱，可以使得到的特征图谱分离度更 佳。

73、(4)本发明采用上述特征图谱检测进行金连消风颗粒中间体及其复方制剂 的质量控制，对主要化学成分进行检测，建立了薄层鉴别、控制中间体和复方制 剂关键质量属性，可进一步提高制剂质量控制的有效性、准确性，可保证临床用 药的安全、有效和稳定。

74、(5)本发明的质量控制方法优选技方案中，对样品中赤芍、连翘采用同一 方法进行鉴别，为本品中的特征成分溯源到药材提供了依据，同时节约成本。