基于CIRSPR-Cas体系检测铅离子的方法与流程

本发明涉及比色分析检测技术，具体地，涉及一种基于cirspr-cas体系检测铅离子的方法。

背景技术：

1、近年来，随着我国工业化进程的不断推进，生态环境不断遭到破坏，食品安全问题频频发生，食品安全已经成为当今社会的热门话题。然而，即使人们不断发展新的技术，仍然存在着许多难以解决的影响因素，致使人类食品遭受到极大的损害，对消费者的身体健康造成威胁，特别是食品中的重金属污染。

2、重金属污染是指重金属及其化合物所引起的污染，主要由废气排放、污水灌溉和使用重金属制品等因素导致，其中，铅、汞、铬、砷、镉是对人体毒害最大的五种。在农业系统中，农作物从空气或者土壤中吸收的重金属会通过食物链进入到人体，并且在人体中长期积累，重金属污染已经成为威胁食品安全的重要因素。铅作为比较常见的有毒重金属，在冶金、化工、机械、印刷等方面应用非常广泛，其一旦被人体摄入则会长期存在并积累于人体各个组织和器官之中。铅含量过高，会导致人体神经系统、免疫系统、造血系统、骨骼系统、免疫系统以及消化系统的损害，尤其是心智仍不成熟的婴儿，铅的伤害会更大，比如发育迟缓、智力低下，对孩子的身体和精神造成不可挽回的影响。

3、比色法作为食品领域操作较简单的重金属检测方法，该方法主要是利用重金属离子会与相应的显色剂发生反应，从而产生不同的有色分子团，根据试纸变化来判断或者光度计进行检测，相比于其他的检测方法，实验操作难度大幅降低，会节约大量的检测成本。但是比色法一直受到检测灵敏度低的限制，难以实现对食品中铅离子的准确检测。

4、近年来，簇状规则间隔短回文重复序列(crispr)以及其相关酶(cas)系统受到了广泛的关注，该系统是由细菌长期的进化而逐渐形成的，也被称为适应性免疫系统。该系统主要包括crispr rna(crrna)、cas蛋白、脱氧核糖核苷酸抑制剂、靶dna、缓冲液以及超纯水，crrna是根据靶dna设计得到，靶dna可以是单链dna(ssdna)或者双链dna(dsdna)。当靶dna与crrna配对后，相关酶(cas)会产生非特异性反式切割活性，随意的切割附近的单链dna，该系统经常运用于核酸检测之中。但是，crispr系统鲜有应用于重金属检测中，而如何实现食品中重金属快速、灵敏地检出，是食品发展中亟待解决的问题之一。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的重金属比色检测灵敏度低的问题，提供一种基于cirspr-cas体系检测铅离子的方法，该方法对重金属的检测灵敏度高，且能够有效缩短检测时间，实用性强。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种基于cirspr-cas体系检测铅离子的方法，包括以下步骤：

3、(1)将含有靶dna的特异酶与可能含有铅离子的待测样品混合形成待测混合物i，将所述待测混合物i与crispr-cas12a体系溶液进行混合反应i后得到待测混合物ii；

4、(2)将所述待测混合物ii与含有单链dna的生物传感器进行混合反应ii得到待测反应液，将所述待测反应液经固液分离得到的沉淀与显色剂混合进行显色反应得到显色反应液，对所述显色反应液进行比色分析或者吸光值检测分析，判断所述待测样品中是否含有铅离子；

5、其中，所述靶dna能够激活所述crispr-cas12a体系中的cas12a蛋白。

6、优选地，步骤(1)中所述特异酶为gr-5dna酶，所述gr-5dna酶的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述靶dna的核苷酸序列如seq id no.2所示。

7、优选地，所述特异酶与待测样品混合的过程包括：将含有所述特异酶的溶液经水浴加热、退火后，与所述待测样品进行混合振摇。

8、优选地，所述水浴加热的条件包括：温度为80-95℃，时间为3-8min；所述混合振摇的条件包括：温度为30-45℃，时间为60-90min。

9、优选地，所述含有特异酶的溶液采用的溶剂为tris-hcl缓冲液。

10、优选地，所述含有特异酶的溶液中特异酶的浓度为3-8μm，所述待测样品中铅离子的浓度为0.8-2500nm。

11、优选地，所述特异酶与所述待测样品中铅离子的摩尔比为2-6250:1。

12、优选地，步骤(1)中所述待测混合物ii中还含有掩蔽剂。

13、优选地，所述掩蔽剂选自乙二胺四乙酸、二巯基丙酮和巯基乙酸中的至少一种；更优选为乙二胺四乙酸。

14、优选地，所述待测样品为食品。

15、优选地，步骤(1)中所述crispr-cas12a体系溶液含有crrna、cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂和缓冲剂；其中，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.4所示。

16、优选地，所述混合反应i的条件包括：温度为30-45℃，时间为20-35min。

17、优选地，步骤(2)中所述生物传感器包括表面修饰有链霉亲和素的磁珠、修饰有生物素的单链dna和氨基化的二氧化锰纳米棒，所述单链dna通过所述生物素与所述磁珠上的链霉亲和素连接，所述单链dna远离所述磁珠的一端与所述氨基化的二氧化锰纳米棒连接。

18、优选地，所述单链dna的核苷酸序列如seq id no.3所示。

19、优选地，相对于1mg的所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠，所述修饰有生物素的单链dna的用量为1×10-4-3×10-4μmol，所述氨基化的二氧化锰纳米棒的用量为0.05-0.15mg。

20、优选地，所述生物传感器的制备方法包括以下步骤：

21、(1-1)在反应溶剂i中，将修饰有生物素和羧基的单链dna与表面修饰有链霉亲和素的磁珠混合进行反应i，使得所述单链dna通过所述生物素与所述磁珠上的链霉亲和素连接，然后经磁分离i得到磁珠-dna；

22、(1-2)在反应溶剂ii中，将所述磁珠-dna与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合进行孵育，然后经磁分离ii得到羧基活化的磁珠-dna；

23、(1-3)在反应溶剂iii中，将所述羧基活化的磁珠-dna与氨基化的二氧化锰纳米棒混合进行反应ii，使得所述单链dna远离所述磁珠的一端与所述氨基化的二氧化锰纳米棒连接，然后经磁分离iii得到所述生物传感器。

24、优选地，所述反应溶剂i、所述反应溶剂ii和反应溶剂iii分别独立地为水和/或tris-hcl缓冲液。

25、优选地，相对于1mg的所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠，所述反应溶剂i的用量为15-25μl，所述反应溶剂ii的用量为15-25μl，所述反应溶剂iii的用量为8-12μl，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为3-5μmol，所述n-羟基琥珀酰亚胺的用量为0.5-1.5μmol。

26、优选地，步骤(1-1)中所述反应i的条件包括：温度为30-45℃，时间为6-8h。

27、优选地，步骤(1-1)还包括：将所述磁分离i得到的物质进行清洗得到所述磁珠-dna。

28、优选地，步骤(1-2)中所述孵育的条件包括：温度为30-45℃，时间为10-15h。

29、优选地，步骤(1-3)中所述反应ii的条件包括：温度为30-45℃，时间为5-12h。

30、优选地，步骤(1-3)还包括：将所述磁分离iii得到的物质进行清洗得到所述生物传感器。

31、优选地，步骤(2)中所述crispr-cas12a体系溶液含有crrna、cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂和缓冲剂；其中，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.4所示。

32、优选地，步骤(2)中所述混合反应ii的条件包括：温度为30-45℃，转速为750-1250rpm，时间为2-4h。

33、优选地，步骤(2)中所述显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

34、优选地，所述吸光值的波长为620-680nm。

35、优选地，步骤(2)中所述判断待测样品中是否含有铅离子的过程包括：将与所述待测反应液中初始等量的生物传感器与显色剂混合进行显色反应并检测吸光值作为对照吸光值，检测所述显色反应液的吸光值作为样品吸光值，将所述样品吸光值与所述对照吸光值进行比较或定量计算。

36、通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

37、本发明提供的基于cirspr-cas体系检测铅离子的方法，将含有单链dna的生物传感器作为信号探针，利用特异酶在铅离子作用下切割形成能够激活cas12a蛋白的靶dna，不仅将铅离子的信号转换为靶dna的核酸信号，而且能够与crispr-cas12a体系相结合，利用激活的cas12a蛋白对生物传感器中的非特异性单链dna进行反式切割，进而降低信号探针对显色剂的显色效果，实现对铅离子的检测。该过程能够明显提高对铅离子的检测灵敏度，且特异性高、有效缩短检测时间，实用性高，为建立快速、特异性的铅离子可视化检测平台提供基础，在食品领域具有极大的应用潜力。