硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法及其应用与流程

1.本发明涉及硫代寡聚核苷酸聚合物纯化技术领域，尤其是涉及硫代寡聚核苷酸聚合物的液相色谱分离方法及其应用。


背景技术：

2.寡聚核苷酸片段样品(如cpg-odn)是含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cpg)的寡脱氧核苷酸(odn)。采用化学合成方法获得的cpg-odn是经硫代修饰的单链脱氧寡核苷酸高分子聚合物，该聚合物随产物本身链长的增加，疏水性差异会逐渐减小，这使得采用常规的高效液相色谱对其进行分离分析变得极为困难，在现有技术中，已见报道的cpg-odn的纯度的检测方法包括，(1)采用比色法检测cpg-odn的纯度，如王学菊，刘璟等提出的“mtt比色法建立b型cpg-odn活性检测标准，《细胞与分子免疫学杂质》2008年01期，69～71页”。(2)采用elisa法检测cpg-odn的纯度，如专利cn100526876c提供了一种检测人未甲基化寡聚脱氧核苷酸elisa检测试剂盒，对cpg-odn进行修饰和水解，而后结合反相-高效液相色谱对水解样品进行检测，从而确定cpg-odn纯度。(3)毛细管电泳法检测cpg-odn的纯度。
3.上述方法均存在稳定性差和重复性低的缺点，同时毛细管电泳法使用的主要检测设备之一毛细管电泳仪价格昂贵，普及率低，难以推广应用到实际生产中。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法并将该方法应用于硫代寡聚核苷酸的纯化中，以缓解了现有技术中存在的稳定性差和重复度低的技术问题，适宜推广应用。
6.为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，所述液相色谱为阴离子交换高效液相色谱，包括以下色谱条件：
8.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，流动相a和流动相b的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱温度：48～52℃，检测波长：260nm；
9.流动相梯度设置包括以下(a)～(c)中任一种：
10.(a)流动相b初始比例为0％，且流动相b比例由0％升至100％的洗脱阶段至少为两个；
11.(b)流动相b初始比例为20％，流动相b比例由20％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相b比例由20％升至100％的时间为20～30min；
12.(c)流动相b初始比例为50％，流动相b比例由50％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相b比例由50％升至100％的时间为29～31min。
13.在可选的实施方式中，所述流动相a和流动相b中tris溶液的浓度为19～21mm，所
述流动相b中nacl的浓度为3.9～4.1m。
14.在可选的实施方式中，所述流动相a和流动相b中tris溶液的浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m。
15.在可选的实施方式中，流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度：50℃。
16.在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
17.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，所述tris溶液浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
18.所述流动相b初始比例为0％，流动相b比例由0％升至100％的洗脱阶段为两个，且其中至少一次流动相b的比例升至100％后，保持稳定的100％比例10～12min，优选为10min。
19.在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
20.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，所述tris溶液浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
21.所述流动相b初始比例为20％，流动相b比例由20％升至100％的洗脱阶段为一个，且流动相b比例由20％升至100％的时间为25～26min，优选为26min。
22.在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
23.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，所述tris溶液浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
24.所述流动相b初始比例为50％，流动相b比例由50％升至100％的洗脱阶段为一个，且流动相b比例由50％升至100％的时间为25～26min，优选为25.8min。
25.第二方面，本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，所述液相色谱为阴离子交换高效液相色谱，包括以下色谱条件：
26.以含乙腈的tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，流动相a和流动相b的流速为0.8～1.2/min，色谱柱温度：48～52℃，检测波长：260nm；
27.所述tris溶液的浓度为20mm，所述流动相a中乙腈的体积分数为4％～6％，优选为5％，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相b初始比例为25％，流动相b比例由25％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相b比例由25％升至100％的时间为25～26min，优选为25.8min。
28.第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法在硫代寡聚核苷酸纯化中的应用。
29.在可选的实施方式中，所述硫代寡聚核苷酸包括含有22～24个核苷酸的硫代寡聚核苷酸，例如22、23或24个核苷酸。
30.本发明提供的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法操作简便且成本低廉，经过验证，其检测结果中目标峰保留时间误差＜1min，峰面积re＜10％，纯度re＜3％满足寡聚核苷酸纯化需求，且稳定性好，重复性高，适宜实际生产推广应用。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为本发明实施例1色谱检测结果；
33.图2为本发明实施例2色谱检测结果；
34.图3为本发明实施例3色谱检测结果；
35.图4为本发明实施例4色谱检测结果；
36.图5为本发明实施例5色谱检测结果；
37.图6为本发明实施例5连续进样6针色谱检测结果；
38.图7为本发明效果例线性评价中得到的标准曲线。
具体实施方式
39.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
40.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
42.第一方面，本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，所述液相色谱为阴离子交换高效液相色谱，包括以下色谱条件：
43.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，流动相a和流动相b的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱温度：48～52℃，检测波长：260nm；
44.流动相梯度设置包括以下(a)～(c)中任一种：
45.(a)流动相b初始比例为0％，且流动相b比例由0％升至100％的洗脱阶段至少为两个；
46.(b)流动相b初始比例为20％，流动相b比例由20％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相b比例由20％升至100％的时间为20～30min；
47.(c)流动相b初始比例为50％，流动相b比例由50％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相b比例由50％升至100％的时间为29～31min。
48.在可选的实施方式中，所述流动相a和流动相b中tris溶液的浓度为19～21mm，所述流动相b中nacl的浓度为3.9～4.1m。
49.在可选的实施方式中，所述流动相a和流动相b中tris溶液的浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m。
50.在可选的实施方式中，流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度：50℃。
51.在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
52.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，所述tris溶液浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
53.所述流动相b初始比例为0％，流动相b比例由0％升至100％的洗脱阶段为两个，且其中至少一次流动相b的比例升至100％后，保持稳定的100％比例10～12min，优选为10min。
54.在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
55.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，所述tris溶液浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
56.所述流动相b初始比例为20％，流动相b比例由20％升至100％的洗脱阶段为一个，且流动相b比例由20％升至100％的时间为25～26min，优选为26min。
57.在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
58.以tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，所述tris溶液浓度为20mm，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相a和流动相b的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
59.所述流动相b初始比例为50％，流动相b比例由50％升至100％的洗脱阶段为一个，且流动相b比例由50％升至100％的时间为25～26min，优选为25.8min。
60.第二方面，本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，所述液相色谱为阴离子交换高效液相色谱，包括以下色谱条件：
61.以含乙腈的tris溶液为流动相a，以含nacl的tris溶液为流动相b，流动相a和流动相b的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱温度：48～52℃，检测波长：260nm；
62.所述tris溶液的浓度为20mm，所述流动相a中乙腈的体积分数为4％～6％，优选为5％，所述流动相b中nacl的浓度为4m，所述流动相b初始比例为25％，流动相b比例由25％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相b比例由25％升至100％的时间为25～26min，优选为25.8min。
63.第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的硫代cpg-odn的液相色谱分离方法在硫代寡聚核苷酸纯化中的应用。
64.在可选的实施方式中，所述硫代寡聚核苷酸包括含有22～24个核苷酸的硫代寡聚核苷酸，例如22、23或24个核苷酸。包括但不限于含有24个核苷酸的硫代寡聚核苷酸，例如核苷酸序列为5
’‑
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’(seq id no.1)的记为样品1，或含有22个核苷酸的硫代寡聚核苷酸，例如核苷酸序列为5
’‑
tgactgtgaacgttcgagatga-3’(seq id no.2)的记为样品2。
65.需要说明的是，不同种类硫代寡聚核苷酸的具体组成带来的液相色谱分离效果差异并不大，本发明提供的液相色谱分离方法能够适用硫代寡聚核苷酸的离子色谱分离和纯化，而上述样品1或样品2仅作为示例记载于本发明的实施例中，不应当理解为对本发明适用硫代寡聚核苷酸种类的限缩。
66.下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
67.下列实施例涉及到的材料和试剂，实验条件和方法如下：
68.一、试剂耗材
69.氯化钠、tris、盐酸和乙腈。
70.色谱柱：强阴离子交换柱
71.二、检测方法步骤
72.流动相a：称取2.42g
±
0.02g tris，加入约900ml超纯水溶解，用稀盐酸调节ph至8.0
±
0.02，用超纯水稀释至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤。
73.流动相b：称取2.42g
±
0.02g tris和233g
±
0.2g nacl，加入约900ml超纯水溶解，用稀盐酸调节ph至8.00
±
0.02，加超纯水稀释至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤。
74.稀盐酸：量取盐酸234ml，加超纯水稀释至1000ml，即得。
75.0.9％氯化钠溶液：称取9.0g
±
0.05g nacl，加超纯水溶解并稀释至1000ml。
76.实施例1
77.本实施例提供了一种硫代cpg-odn的液相色谱分离方法，色谱条件如下：
[0078][0079]
流动相梯度表：
[0080]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.010004.2100021.0010025.2100033.6100040.0010050.0010054.0100063.01000
[0081]
采用上述色谱条件重复处理样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸，上述样品1)五次，结果如图1所示，由图1可以看出，连续进样5针样品的主峰后都出现了未知峰，且重复性较好，主峰前面不存在未知峰，说明盐溶液的洗脱力度或者洗脱时间能够将主成分洗脱下来，能够用于该类核酸样品的分离，不过由图1可以看出，主成分洗脱并不完全。
[0082]
实施例2
[0083]
本实施例提供了一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，色谱条件如下：
[0084][0085]
流动相梯度表：
[0086]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.080204.2802021.0010033.0802045.08020
[0087]
采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸，上述样品1)，结果如图2所示，本实施例与实施例1相比提高了盐溶液的初始比例，可以看出，通过提高盐溶液的初始比例，未知峰前移，说明是因盐溶液洗脱力度不够造成实主成分不能完全洗脱。
[0088]
实施例3
[0089]
本实施例提供了一种硫代的液相色谱分离方法，色谱条件如下：
[0090]
流动相梯度表：
[0091]
[0092][0093]
采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸，上述样品1)，结果如图3所示，本实施例相对于实施例2，在提高盐溶液初始比例的同时又延长其洗脱时间，即放缓盐溶液由20％到100％的速度，由图3可以看出，结果未知峰变小，主峰峰面积变大。
[0094]
对比实施例2和实施例3的结果如下：
[0095][0096]
由上述对比可以看出，盐溶液的洗脱时间越长，主峰峰面积越大，未知峰峰面积越小，但总的峰面积变化不明显，也从侧面说明两个色谱峰是同一物质。
[0097]
实施例4
[0098]
本实施例提供了一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，色谱条件如下：
[0099][0100]
流动相梯度表：
[0101]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.050504.25050
30.0010038.0505048.05050
[0102]
采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸，上述样品1)，结果如图4所示，由图4可以看出，盐溶液初始比例由20％提高到50％后，主成分被完全洗脱下来，峰面积明显变大，与之前主峰和未知峰的总峰面积比较无明显变化，但是峰形不好。
[0103]
实施例5
[0104]
本实施例提供了一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，色谱条件如下：
[0105][0106]
流动相梯度表：
[0107]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.075254.2752530.0010038.0752548.07525
[0108]
采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸，上述样品1)，结果如图5所示，连续进样6针后得到检测结果图6，由图5和图6可以看出，主成分被完全洗脱下来且没有残留，重复性较好，但有拖尾现象，根据文献报道，基于阴离子交换的寡聚核苷酸层析和分析中拖尾是一个较普遍现象，其原因在于全硫代修饰会增加核酸分子的粘度，增加分离难度，同时基于阴离子交换的核酸分析条件需要较高的柱温(50℃)和较高的ph(8.0),容易造成拖尾等现象，但对样品的分析不会产生影响，且该方法已经过精密度、线性、准确度和耐用性等项目的分析方法验证，均已通过验证要求。
[0109]
效果例
[0110]
使用样品硫代寡聚核苷酸对上述实施例5提供的检测方法的检测效果进行验证，检测步骤如下：
[0111]
流动相a：称取2.42g
±
0.02g tris，加入约900ml超纯水溶解，用稀盐酸调节ph至8.0
±
0.02，加入乙腈50ml，用超纯水稀释至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤。
[0112]
流动相b：称取2.42g
±
0.02g tris和233g
±
0.2g nacl，加入约900ml超纯水溶解，用稀盐酸调节ph至8.00
±
0.02，加超纯水稀释至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤。
[0113]
稀盐酸：量取盐酸234ml，加超纯水稀释至1000ml，即得。
[0114]
0.9％氯化钠溶液：称取9.0g
±
0.05g nacl，加超纯水溶解并稀释至1000ml。
[0115]
zj001样品溶液：称取zj001冻干粉适量，用0.9％氯化钠溶液溶解后测定其含量应在0.5mg/ml～2.5mg/ml范围内，样品经10000rpm离心10min，取上清装入样品瓶。
[0116]
用流动相初始比例平衡色谱柱60min以上，至压力和基线稳定后运行样品序列。
[0117]
序列运行结束后，用20mmtris ph8.0冲洗色谱柱60min以上，拆下色谱柱，然后用超纯水清洗系统管路至少4小时。
[0118]
按照面积归一化法获得主峰的峰面积％即为zj001样品的纯度。
[0119]
下面对检测效果进行评价：
[0120]
(1)专属性：空白缓冲液中无目标峰，供试品溶液中有目标峰；供试品加杂中，目标峰与杂质峰达到基线分离，结果符合专属性要求。
[0121]
(2)精密度(重复性)：由一名实验者按照上述操作对该样品平行制备6份，考察6针峰面积rsd％和纯度rsd％，结果如下，均符合重复性要求。
[0122][0123][0124]
(3)精密度(中间精密度)：两名分析者在不同日期按照上述制备方法分别平行制备3份，察6针峰面积rsd％和纯度rsd％，结果均符合中间精密度要求。
[0125][0126]
(4)线性：在500～2500μg/ml范围内，符合线性验证要求。
[0127][0128]
(5)准确度
[0129]
[0130][0131]
(6)耐用性
[0132]
供试品溶液稳定性：供试品溶液在2～8℃分别放置0h、12h、24h、48h、72h。
[0133]
[0134][0135]
色谱条件微调：(此项目为了验证该方法的耐用性)
[0136][0137]
结论：各验证内容均符合其可接受标准，说明采用本方法适合特选样品硫代寡聚核苷酸的iex hplc纯度和稳定性的分析检测。
[0138]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。