槐角制品的物质评价方法、药物组合物和应用与流程

本发明涉及一种槐角制品的物质评价方法、药物组合物和应用。

背景技术：

1、槐角为豆科植物槐sophora japonica l.的干燥成熟果实，性寒、味苦，归肝、大肠经。具有清热泻火、凉血止血的功效，用于肠热便血、痣肿出血，肝热头痛、眩晕目赤等症。槐角主要成分有黄酮、异黄酮、生物碱、三萜皂苷、氨基酸及硬脂酸类等，其中以异黄酮及其苷类含量最高。槐角具有防癌抗癌及雌性激素样作用，对癌症、心血管疾病、骨质疏松和女性更年期综合征有很好的防治作用。槐角生品清热凉血力较强，用于凉血止血。槐角炭寒性大减，长于收敛止血。槐角经炮制其外型、功效都发生了变化，推测可能与炒炭过程中活性物质的改变相关。槐角炭在经典名方凉血地黄汤中为君药使用，而在验方选集、杨氏家藏方等中都有关于槐角炭的应用记载。目前对于槐角炭的炮制研究还不够系统深入，槐角炭存性标准尚未统一，仅凭主观经验判别，各地的炮制品质量相差很大，致使临床作用也相差很大。目前对槐角炒炭前后的成分鉴别研究较少，尚无对槐角炭止血物质基础的分析。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对目前缺乏的有效高效的评价槐角制品止血作用的方法，提供了一种槐角制品的物质评价方法、药物组合物和应用，本发明基于谱效关系的槐角制品止血作用物质评价方法可以快速、准确地评价槐角制品止血成分，进行活性成分筛选，为槐角制品的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。

2、本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明提供了一种槐角制品的物质评价方法，其包括以下步骤：

4、s1、采用液相色谱法，建立不同炮制时间的槐角制品的指纹图谱；并提取共有特征峰；

5、s2、测定不同炮制时间的槐角制品的止血效果；

6、s3、根据不同炮制时间的槐角制品的特征峰数据与其止血效果数据，经化学计量学方法进行统计分析，评价槐角制品中止血作用的药效物质基础；

7、步骤s1中，所述液相色谱法中，色谱条件如下：

8、色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

9、流动相包括流动相a与流动相b，所述流动相a为甲酸溶液，所述流动相b为甲醇；

10、采用梯度洗脱的方式，以所述流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序按下表的顺序从上到下依次进行：

11、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相b 8-12 90％→80％ 10％→20％ 15-20 80％→60％ 20％→40％ 2-5 保持60％ 保持40％ 8-12 60％→40％ 40％→60％ 2-5 保持40％ 保持60％ 5-8 40％→20％ 60％→80％ 1-4 保持20％ 保持80％ 12-18 保持90％ 保持10％

12、其中，所述洗脱时长为该洗脱阶段的洗脱终点时间与洗脱起点时间的差值。

13、步骤s1中，所述液相色谱可为高效液相色谱(hplc)或超高效液相色谱(uplc)。

14、步骤s1中，所述不同炮制时间的槐角制品可包括：炮制时间分别为0、5、9、12、15、20、30和50min的槐角制品中的两种以上。

15、步骤s1中，所述槐角制品可通过本领域常规的方法制备，例如通过以下方法制备：将槐角生品进行炒制。较佳地，所述炒制的温度为200-300℃，例如200℃。较佳地，所述炒制的时间为5-50min；例如5、9、12、15、20、30或50min。

16、步骤s1中，所述色谱柱可为waters acquity csh c18色谱柱(规格可为150mm×2.1mm,1.7μm)、1-acquity csh c18色谱柱(规格可为150mm*2.1mm,1.7μm)或2-hypersi1gold(规格可为100*2.1mm,1.9μm)色谱柱；优选为waters acquity csh c18色谱柱(规格可为150mm×2.1mm,1.7μm)。

17、步骤s1中，所述梯度洗脱的程序可如下表所示：

18、 时间/分钟 流动相a/体积百分比 流动相b/体积百分比 0-9 90％→80％ 10％→20％ 9-27 80％→60％ 20％→40％ 27-30 60％ 40％ 30-39 60％→40％ 40％→60％ 39-42 40％ 60％ 42-48 40％→20％ 60％→80％ 48-50 20％ 80％ 50-50.1 20％→90％ 80％→10％ 50.1-65 90％ 10％

19、。

20、步骤s1中，所述流动相a中甲酸的浓度可为本领域常规，例如为0.05-0.5％甲酸溶液，又例如0.05％甲酸溶液。

21、步骤s1中，所述色谱条件中，可使用本领域常规的检测器，例如检测器为uv-dad检测器。

22、步骤s1中，所述色谱条件中，可使用本领域常规的检测波长，例如检测波长为210-300nm，又例如检测波长为230、254或280nm，优选波长为280nm。

23、步骤s1中，所述色谱条件中，流速可为0.12-0.18ml/min；例如0.12ml/min、0.15ml/min和0.18ml/min；优选为0.12-0.15ml/min。

24、步骤s1中，所述色谱条件中，柱温可为30-40℃；例如30℃、35℃或40℃；优选为35℃。

25、步骤s1中，所述色谱条件中，进样量可为本领域常规，例如进样量为1-5μl，又例如进样量为1μl。

26、步骤s1中，所述色谱条件中，进样浓度可为本领域常规，例如为0.004-0.1g/ml，又例如0.025g/ml。

27、步骤s1中，在进样前可对槐角制品进行预处理，以符合进样标准。所述的预处理可为本领域常规的预处理，较佳地，所述预处理包括下述步骤：将所述槐角制品溶解于溶剂中。进一步地，所述溶剂为甲醇。

28、进一步地，步骤s1中，所述预处理步骤中，还可包括以下步骤：将槐角制品加水(200ml)浸泡(30min)、煎煮(煮沸后煎煮30min加入160ml水继续煎煮20min)、过滤、滤液浓缩后冷冻干燥，得槐角制品的冻干粉末，以冻干粉末的形式溶解于所述溶剂中，现用现配。

29、步骤s1中，可通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a版”软件，对共有特征峰进行提取。

30、步骤s1中，所述共有特征峰可包括以下保留时间的特征峰：5.60±0.05min、6.56±0.01min、19.83±0.01min、28.24±0.06min、33.60±0.04min、34.99±0.05min、36.28±0.05min、37.45±0.05min、41.63±0.07min、43.58±0.03min和44.34±0.04min。进一步地，所述共有特征峰还可包括保留时间如下一个或多个的特征峰：5.31±0.01min，9.14±0.03min，11.31±0.02min，16.89±0.01min，22.97±0.04min，25.92±0.01min，27.44±0.02min，27.91±0.02min，30.14±0.05min，30.53±0.03min，32.78±0.02min，33.15±0.03min，34.06±0.03min，34.70±0.03min，35.96±0.06min，38.27±0.05min，39.89±0.06min，40.90±0.04min，42.09±0.05min，43.35±0.02min，44.60±0.03min，45.31±0.03min，46.28±0.02min，46.74±0.04min和49.21±0.04min。

31、步骤s2中，所述止血效果可包括鼠尾出血时间，凝血时间和凝血四项中的一个或多个。

32、步骤s3中，可采用pearson双变量相关分析法，将所述共有特征峰的峰面积与止血效果数据之间进行相关性分析，并通过多元线性回归建立谱效方程，从而判断槐角制品止血作用的物质基础。较佳地，保留时间为5.60±0.05min、6.56±0.01min、19.83±0.01min、28.24±0.06min、33.60±0.04min、34.99±0.05min、36.28±0.05min、37.45±0.05min、41.63±0.07min、43.58±0.03min和44.34±0.04min的特征峰与止血效果呈现较好的相关性。

33、其中，较佳地，保留时间为5.60±0.05min的特征峰为没食子酸，保留时间为6.58min的特征峰为对羟基苯甲醇、保留时间为19.83±0.01min的特征峰为没食子酸甲酯、保留时间为28.24±0.06min的特征峰为二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷、保留时间为33.60±0.04min的特征峰为山柰酚-3-o-(2”-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷、保留时间为34.99±0.05min的特征峰为山柰酚-3-o-槐糖、保留时间为36.28±0.05min的特征峰为二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷、保留时间为37.43min的特征峰为芦丁、保留时间为41.63±0.07min的特征峰为山柰酚-3-o-芸香糖苷、保留时间为43.58±0.03min的特征峰为柃木花甙。

34、步骤s3中，将保留时间为5.60±0.05min的特征峰、保留时间为6.56±0.01min的特征峰、保留时间为40.90±0.04min的特征峰、保留时间为42.09±0.05min的特征峰、保留时间为44.34±0.04min的特征峰和保留时间为45.31±0.03min的特征峰分别引入谱效数学模型中：

35、y出血时间bt＝3.609-3.077*x2；

36、y凝血时间ct＝3.128+0.688*x31-3.11*x26；

37、y凝血酶原时间pt＝0.505-0.017*x3-0.012*x33；

38、y纤维蛋白原fib＝3.644-0.666*x28；

39、其中，x2代表保留时间为5.60±0.05min色谱峰峰面积，x3代表保留时间为6.56±0.01min色谱峰峰面积，x26代表保留时间为40.90±0.04min色谱峰峰面积，x28代表保留时间为42.09±0.05min色谱峰峰面积，x31代表保留时间为44.34±0.04min色谱峰峰面积；x33代表保留时间为45.31±0.03min色谱峰峰面积，y出血时间bt、y凝血时间ct、y凝血酶原时间pt、y纤维蛋白原fib代表槐角炭的止血作用；

40、较佳地，y出血时间bt的数学模型中，p＝0.034<0.05，r2＝0.556；y凝血时间ct的数学模型中，p＝0.026<0.05，r2＝0.905；y凝血酶原时间pt的数学模型中，p＝0.049<0.05，r2＝0.858；y纤维蛋白原fib的数学模型中，p＝0.007<0.05，r2＝0.733。

41、步骤s3中，评价槐角制品中止血作用的物质基础的方法可包括：特征峰峰面积与止血效果数据之间相关性具有显著差异p<0.05的特征峰以及被引入谱效方程的特征峰是槐角制品中止血作用的物质基础。

42、较佳地，槐角制品中止血作用的物质基础包括保留时间如下一个或多个的特征峰所对应的物质：5.60±0.05min、6.56±0.01min、19.83±0.01min、28.24±0.06min、33.60±0.04min、34.99±0.05min、36.28±0.05min、37.45±0.05min、40.90±0.04min、41.63±0.07min、42.09±0.05min、43.58±0.03min、44.34±0.04min和45.31±0.03min。

43、步骤s3中，较佳地，槐角制品中发挥止血作用的物质基础包括没食子酸、对羟基苯甲醇、没食子酸甲酯、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(2″-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-槐糖、二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芦丁、芹菜素-7-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷，柃木花甙和染料木素-4′-o-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷中的一种或多种。

44、步骤s3中，还可包括对槐角制品相关峰进行主成分分析，筛选对不同炮制时间的槐角制品之间的差异由较大影响的相关峰组分。较佳地；所述主成分分析方法中：

45、保留主成分个数累计贡献率>90％；

46、保留的主成分的特征值>1；

47、再经过kmo检验和bartlett检验。

48、步骤s3中，还可包括进一步利用聚类分析对主成分分析进行验证。

49、本发明还提供了一种药物组合物，其活性成分包括以下组分：没食子酸或其药学上可接受的盐、对羟基苯甲醇或其药学上可接受的盐、没食子酸甲酯或其药学上可接受的盐、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷或其药学上可接受的盐、山柰酚-3-o-(2″-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、山柰酚-3-o-槐糖或其药学上可接受的盐、二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷或其药学上可接受的盐、芦丁或其药学上可接受的盐、芹菜素-7-o-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、山柰酚-3-o-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、柃木花甙或其药学上可接受的盐和“染料木素-4′-o-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷或其药学上可接受的盐”。

50、较佳地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

51、较佳地，所述药物组合物中，所述活性成分由以下组分组成：没食子酸或其药学上可接受的盐、对羟基苯甲醇或其药学上可接受的盐、没食子酸甲酯或其药学上可接受的盐、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷或其药学上可接受的盐、山柰酚-3-o-(2″-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、山柰酚-3-o-槐糖或其药学上可接受的盐、二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷或其药学上可接受的盐、芦丁或其药学上可接受的盐、芹菜素-7-o-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、山柰酚-3-o-芸香糖苷或其药学上可接受的盐、柃木花甙或其药学上可接受的盐和“染料木素-4′-o-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷或其药学上可接受的盐”。

52、本发明还提供了物质x或其药学上可接受的盐或如本发明任一项所述的药物组合物在制备止血药物中的应用，所述物质x为没食子酸、对羟基苯甲醇、没食子酸甲酯、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(2″-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-槐糖、二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芦丁、芹菜素-7-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷，柃木花甙和染料木素-4′-o-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷中的一种或多种。

53、本发明还提供了物质x或其药学上可接受的盐或如本发明任一项所述的药物组合物在槐角制品质量控制中的应用，所述物质x为没食子酸、对羟基苯甲醇、没食子酸甲酯、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(2″-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-槐糖、二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芦丁、芹菜素-7-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷，柃木花甙和染料木素-4′-o-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷中的一种或多种。

54、在所述槐角制品质量控制中的应用中，所述物质x可作为槐角制品活性成分的对照品。

55、在所述槐角制品质量控制中的应用中，通过检测槐角制品中的物质x或其药学上可接受的盐来实现质量控制。较佳地，采用液相色谱法检测槐角制品中的物质x或其药学上可接受的盐，所述液相色谱法的色谱条件同本发明任一项所述，例如，同步骤s1中任一项所述。

56、在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

57、本发明所用试剂和原料均市售可得。

58、本发明的积极进步效果在于：

59、(1)本发明利用化学模式识别方法将槐角制品在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的变化建立了相关性，并明确槐角制品止血作用的药效物质基础是以黄酮类化合物为主，酚酸类小分子化合物为辅。

60、(2)本发明建立了基于止血作用的谱效关系的槐角制品化学成分评价方法，明确了槐角制品中与止血药效活性较为密切的化学成分，为槐角制品止血药效物质基础研究提供依据，同时采用指纹图谱和数学模型结合的方式避免第三方因素的干扰，避免了动物个体偏差，能够快速、准确地评价槐角制品中具有止血作用的化学成分及活性成分筛选，为槐角制品的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。

61、(3)本发明以凉血止血药槐角为代表对炭药止血作用进行研究，有利于揭示凉血止血药炒炭成分变化规律和止血相关性，为科学的解释炭药止血提供借鉴。