一种槐角的处理方法、指纹图谱及其应用与流程

本发明涉及一种槐角的处理方法、指纹图谱及其应用。

背景技术：

1、槐角为豆科植物槐sophora japonica l.的干燥成熟果实，性寒、味苦，归肝、大肠经。具有清热泻火、凉血止血的功效，用于肠热便血、痣肿出血，肝热头痛、眩晕目赤等症。槐角主要成分有黄酮、异黄酮、生物碱、三萜皂苷、氨基酸及硬脂酸类等，其中以异黄酮及其苷类含量最高。槐角具有防癌抗癌及雌性激素样作用，对癌症、心血管疾病、骨质疏松和女性更年期综合征有很好的防治作用。槐角生品清热凉血力较强，用于凉血止血。槐角炭寒性大减，长于收敛止血。槐角经炮制其外型、功效都发生了变化，推测可能与炒炭过程中活性物质的改变相关。槐角炭在经典名方凉血地黄汤中为君药使用，而在验方选集、杨氏家藏方等中都有关于槐角炭的应用记载。目前对于槐角炭的炮制研究还不够系统深入，槐角炭存性标准尚未统一，仅凭主观经验判别，各地的炮制品质量相差很大，致使临床作用也相差很大。目前对槐角炒炭前后的成分鉴别研究较少，尚无对槐角炭止血物质基础的分析。

2、2021年中草药第52卷第21期出版了李晶峰等人的不同产地槐角hplc指纹图谱建立及化学模式识别研究，方法是采用agilent zorbax sb c18色谱柱在agilent 1260高效液相色谱仪上，检测波长为260nm，体积流量为0.6ml/min，甲醇-乙腈-0.07％磷酸水(12∶20∶68)为流动相进行等度洗脱，共得到9个共有峰，仅指认了芦丁、染料木苷、槐角苷3个色谱峰，所给出的化学信息稍显单薄。现有技术所提供的方法对于槐角药材成分信息不够全面，难以客观、准确、全面的评价槐角药材和槐角炭的质量。因此建立槐角药材和槐角炭指纹图谱方法对它们的质量控制具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中针对槐角生品或槐角炭的检测方法较少，且能够检测到的组分较少，以及缺少有效高效的评价槐角生品或槐角炭质量的方法的缺陷，提供了一种槐角的处理方法、指纹图谱及其应用，本发明所提供的指纹图谱对槐角生品或槐角炭的多个有效成分进行分离和定性鉴别可以快速、准确地评价槐角生品或槐角炭的质量，能够较为全面表征槐角和槐角炭中的化学信息，用于指导工业生产，更好的保证产品质量，为槐角生品或槐角炭的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。

2、本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明提供了一种处理方法，其包括以下步骤：

4、采用液相色谱法，将槐角待测物进行梯度洗脱，即可；

5、所述液相色谱法中，色谱条件如下：

6、色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

7、流动相为流动相a-流动相b或流动相a-流动相b，所述流动相a为甲酸溶液，所述流动相b为甲醇，所述流动相c为乙腈；

8、当流动相为流动相a-流动相b时，以所述流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序按下表的顺序从上到下依次进行：

9、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相b 3-12 x1→x2 (100％-x1)→(100％-x2) 10-20 x2→x3 (100％-x2)→(100％-x3) 0-6 保持x3 保持(100％-x3) 8-10 x3→x4 (100％-x3)→(100％-x4) 0-5 保持x4 保持(100％-x4) 4-7 x4→x5 (100％-x4)→(100％-x5) 0-3 保持x5 保持(100％-x5) 0-6 x5→x6 (100％-x5)→(100％-x6) 0-16 保持x6 保持(100％-x6)

10、其中，x1为83％-92％(85％、90％)，x2为68％-82％(70％、80％)，x3为48％-67％(50％、60％、65％)，x4为38％-48％(40％、55％)，x5为18％-45％(20％、40％)，x6为83-92％(85％、90％)，x1>x2>x3>x4>x5；

11、当流动相为流动相a-流动相c时，以所述流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱的程序按下表的顺序从上到下依次进行：

12、

13、

14、其中，y1为90％-95％(93％)，y2为88％-92％(90％)，y3为83％-87％(85％)，y4为78％-82％(80％)，y5为73％-77％(75％)，y6为68％-72％(70％)，y7为53％-58％(55％)，y8为38％-43％(40％)，y9为90％-95％(93％)；

15、所述洗脱时长为该洗脱阶段的洗脱终点时间与洗脱起点时间的差值。

16、其中，所述洗脱时长为该洗脱阶段的洗脱终点时间与洗脱起点时间的差值。

17、所述色谱柱可为waters acquity csh c18色谱柱(规格可为150mm×2.1mm,1.7μm)、1-acquity csh c18色谱柱(规格可为150mm×2.1mm,1.7μm)或2-hypersi1 gold(规格可为100×2.1mm,1.9μm)色谱柱；优选为waters acquity csh c18色谱柱(规格可为150mm×2.1mm,1.7μm)。

18、所述色谱条件中，x1可为85％或90％。

19、所述色谱条件中，x2可为70％或80％。

20、所述色谱条件中，x3可为50％、60％或65％。

21、所述色谱条件中，x4可为40％或55％。

22、所述色谱条件中，x5可为20％或40％。

23、所述色谱条件中，x6可为85％或90％。

24、所述色谱条件中，y1可为93％。

25、所述色谱条件中，y2可为90％。

26、所述色谱条件中，y3可为85％。

27、所述色谱条件中，y4可为80％。

28、所述色谱条件中，y5可为75％。

29、所述色谱条件中，y6可为70％。

30、所述色谱条件中，y7可为55％。

31、所述色谱条件中，y8可为40％。

32、所述色谱条件中，y9可为93％。

33、所述色谱条件中，所述梯度洗脱的程序可为如下任一条件：

34、条件a：

35、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相b 9 90％→80％ 10％→20％ 18 80％→60％ 20％→40％ 3 保持60％ 保持40％ 9 60％→40％ 40％→60％ 3 保持40％ 保持60％ 6 40％→20％ 60％→80％ 2 保持20％ 保持80％ 15 保持90％ 保持10％

36、条件b：

37、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相b 4 85％→80％ 15％→20％ 11 80％→65％ 20％→35％ 10 65％→55％ 35％→45％ 5 60％→40％ 40％→60％ 3 保持40％ 保持60％ 5 40％→85％ 60％→15％ 4 保持85％ 保持85％

38、条件c：

39、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相b 10 90％→70％ 10％→30％ 20 70％→60％ 30％→40％ 10 60％→40％ 40％→60％ 5 40％→20％ 60％→80％ 5 20％→90％ 80％→10％

40、条件d：

41、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相b 10 90％→80％ 10％→20％ 15 80％→60％ 20％→40％ 5 保持60％ 保持40％ 10 60％→40％ 40％→60％ 5 40％→20％ 60％→80％ 5 保持90％ 保持10％

42、条件e：

43、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相b 10 90％→80％ 10％→20％ 15 80％→50％ 20％→50％ 5 保持50％ 保持50％ 10 50％→40％ 50％→60％ 5 40％→20％ 60％→80％ 5 保持90％ 保持10％

44、条件f：

45、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相c 10 93％→85％ 7％→15％ 15 85％→70％ 15％→30％ 5 保持70％ 保持30％ 10 70％→55％ 30％→45％ 5 55％→40％ 45％→60％ 5 保持93％ 保持7％

46、条件g：

47、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相c 10 93％→85％ 7％→15％ 15 85％→75％ 15％→25％ 5 75％→70％ 25％→30％ 10 70％→55％ 30％→45％ 5 55％→40％ 45％→60％ 5 保持93％ 保持7％

48、条件h：

49、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相c 10 93％→90％ 7％→10％ 15 90％→80％ 10％→20％ 5 80％→70％ 20％→30％ 10 70％→55％ 30％→45％ 5 55％→40％ 45％→60％ 5 40％→93％ 60％→7％

50、条件i：

51、 洗脱时长/分钟 流动相a 流动相c 10 93％→90％ 7％→10％ 15 90％→85％ 10％→15％ 10 85％→80％ 15％→20％ 10 80％→75％ 20％→25％ 5 75％→55％ 25％→45％ 5 55％→40％ 45％→60％ 5 40％→93％ 60％→7％

52、。

53、优选的，所述色谱柱为waters acquity csh c18色谱柱，所述流动相为流动相a-流动相b，所述梯度洗脱的程序如下表所示：

54、 时间/分钟 流动相a 流动相b 0～9 90％→80％ 10％→20％ 9～27 80％→60％ 20％→40％ 27～30 60％ 40％ 30～39 60％→40％ 40％→60％ 39～42 40％ 60％ 42～48 40％→20％ 60％→80％ 48～50 20％ 80％ 50～50.1 20％→90％ 80％→10％ 50.1～65 90％ 10％

55、。

56、所述液相色谱法可为高效液相色谱法(hplc)或超高效液相色谱法(uplc)。

57、所述色谱条件中，所述流动相a中甲酸的浓度可为本领域常规，例如为0.05-0.5％甲酸溶液，又例如0.05％甲酸溶液。

58、所述色谱条件中，可使用本领域常规的检测器，例如检测器为uv-dad检测器。

59、所述色谱条件中，可使用本领域常规的检测波长，例如检测波长为210-300nm，又例如检测波长为230、254或280nm，优选波长为278或280nm。

60、所述色谱条件中，流速可为0.12-0.18ml/min；例如0.12ml/min、0.15ml/min和0.18ml/min；优选为0.12-0.15ml/min。

61、所述色谱条件中，柱温可为30-40℃；例如30℃、35℃或40℃；优选为35℃。

62、所述色谱条件中，进样量可为本领域常规，例如进样量为1-5μl，又例如进样量为1μl。

63、所述色谱条件中，所述槐角待测物的进样浓度可为本领域常规，例如为0.004-0.1g/ml，又例如0.025g/ml。

64、所述槐角待测物在洗脱前可进行预处理，以符合进样标准。所述的预处理可为本领域常规的预处理，较佳地，所述预处理包括下述步骤：将所述槐角待测物溶解于溶剂中；较佳地，所述溶剂为甲醇。

65、所述预处理步骤中，还可包括以下步骤：将槐角加水(200ml)浸泡(30min)、煎煮(煮沸后煎煮30min加入160ml水继续煎煮20min)、过滤、滤液浓缩后冷冻干燥，得槐角待测物的冻干粉末，以冻干粉末的形式溶解于所述溶剂中。

66、所述槐角待测物可为各类槐角制品或其他含槐角成分的组合物，例如槐角的生品和/或槐角的炮制品；所述槐角的炮制品优选为槐角炭。

67、所述槐角炭可采用本领域常规方法制备，例如，所述槐角炭通过以下方法制备：将槐角生品进行炒制。较佳地，所述炒制的温度为200-300℃，例如200℃。较佳地，所述炒制的时间为5-50min；例如5、9、12、15、20、30、50min；更佳地；所述炒制的时间为15-20min。

68、所述处理方法用于检测或分离所述槐角待测物中的槐角成分。

69、较佳地，所述槐角成分包括以下组分：没食子酸甲酯、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(2″-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-槐糖、二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-芸香糖苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷和柃木花甙中的一种或多种。更佳地，所述槐角成分还进一步包括以下组分：没食子酸、对羟基苯甲醇和染料木素-4′-o-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷中的一种或多种。进一步地，所述槐角成分还进一步包括以下组分：(3,4,5-三羟基-3-呋喃基)-4-甲氧基苯甲酸、对双没食子酸、染料木素-7,4′-di-o-β-d-葡萄糖苷、染料木素-7-o-葡萄糖-4′-o-新橙皮糖苷、山柰酚-3-o-(3′,4′-二-o-葡萄糖基)-鼠李糖-7-o-鼠李糖苷、山柰酚-3-o-槐糖7-o-鼠李糖苷、染料木素-7-o-丙二酰葡萄糖-4′-o-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-(3′-o-葡萄糖基)-芸香糖苷、染料木苷、芹菜素-7-o-(3″-乙酰基)-芸香糖苷、山柰酚-7-甲氧基-4′-o-葡萄糖基-3-o-(2-o-apio-呋喃酰基)葡萄糖、异鼠李素-3-o-槐糖、柚皮苷、芦丁、槐角苷、槐属双苷、染料木素-4′-o-(6″-丙二酰基)葡萄糖苷、山茶黄酮苷a、染料木素和山柰酚中的一种或多种。

70、较佳地，所述槐角成分包括没食子酸甲酯、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(2″-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷、山柰酚-3-o-槐糖、二氢芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-芸香糖苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷、柃木花甙、没食子酸、对羟基苯甲醇、染料木素-4′-o-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷、(3,4,5-三羟基-3-呋喃基)-4-甲氧基苯甲酸、对双没食子酸、染料木素-7,4′-di-o-β-d-葡萄糖苷、染料木素-7-o-葡萄糖-4′-o-新橙皮糖苷、山柰酚-3-o-(3′,4′-二-o-葡萄糖基)-鼠李糖-7-o-鼠李糖苷、山柰酚-3-o-槐糖7-o-鼠李糖苷、染料木素-7-o-丙二酰葡萄糖-4′-o-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-(3′-o-葡萄糖基)-芸香糖苷、染料木苷、芹菜素-7-o-(3″-乙酰基)-芸香糖苷、山柰酚-7-甲氧基-4′-o-葡萄糖基-3-o-(2-o-apio-呋喃酰基)葡萄糖、异鼠李素-3-o-槐糖、柚皮苷、芦丁、槐角苷、槐属双苷、染料木素-4′-o-(6″-丙二酰基)葡萄糖苷、山茶黄酮苷a、染料木素和山柰酚。

71、本发明还提供了记载了利用上述所述处理方法获得的液相色谱图的产品。

72、所述产品可为计算机存储介质；或者，为绘制或印刷的说明书。

73、较佳地，所述液相色谱图中，在如下一个或多个保留时间处有特征峰：19.83±0.01min、28.24±0.06min、33.60±0.04min、34.99±0.05min、36.28±0.05min、40.90±0.04min、41.63±0.07min、42.09±0.05min和43.58±0.03min。

74、较佳地，所述液相色谱图中，还进一步在如下一个或多个保留时间处有特征峰：5.60±0.05min、6.56±0.01min和45.31±0.03min。

75、较佳地，所述液相色谱图中，还进一步在如下一个或多个保留时间处有特征峰：11.31±0.02min、16.89±0.01min、22.97±0.04min、25.92±0.01min、27.44±0.02min、27.91±0.02min、30.14±0.05min、30.53±0.03min、32.78±0.02min、33.15±0.03min、34.06±0.03min、34.70±0.03min、35.96±0.06min、37.45±0.05min、38.27±0.05min、39.89±0.06min、43.35±0.02min、46.28±0.02min、46.74±0.04min和49.21±0.04min。

76、较佳地，所述液相色谱图中，在如下保留时间处有特征峰：5.60±0.05min、6.56±0.01min、11.31±0.02min、16.89±0.01min、19.83±0.01min、22.97±0.04min、25.92±0.01min、27.44±0.02min、27.91±0.02min、28.24±0.06min、30.14±0.05min、30.53±0.03min、32.78±0.02min、33.15±0.03min、33.60±0.04min、34.06±0.03min、34.70±0.03min、34.99±0.05min、35.96±0.06min、36.28±0.05min、37.45±0.05min、38.27±0.05min、39.89±0.06min、40.90±0.04min、41.63±0.07min、42.09±0.05min、43.35±0.02min、43.58±0.03min、45.31±0.03min、46.28±0.02min、46.74±0.04min和49.21±0.04min。

77、本发明还提供了一种记载了槐角生品的指纹图谱的产品，其在如下一个或多个保留时间处有特征峰：19.83±0.01min、28.24±0.06min、33.60±0.04min、34.99±0.05min、36.28±0.05min、37.45±0.05min、40.90±0.04min、41.63±0.07min、42.09±0.05min和43.58±0.03min。

78、所述产品可为计算机存储介质；或者，为绘制或印刷的说明书。

79、较佳地，所述槐角生品的指纹图谱中，还进一步在如下一个或多个保留时间处有特征峰：22.97±0.04min、25.92±0.01min、27.44±0.02min、27.91±0.02min、30.14±0.05min、30.53±0.03min、32.78±0.02min、33.15±0.03min、34.06±0.03min、35.96±0.06min、38.27±0.05min、39.89±0.06min、44.34±0.04min、44.60±0.03min和46.74±0.04min。

80、较佳地，所述槐角生品的指纹图谱在如下保留时间处有特征峰：19.83±0.01min、22.97±0.04min、25.92±0.01min、27.44±0.02min、27.91±0.02min、28.24±0.06min、30.14±0.05min、30.53±0.03min、32.78±0.02min、33.15±0.03min、33.60±0.04min、34.06±0.03min、34.99±0.05min、35.96±0.06min、36.28±0.05min、37.45±0.05min、38.27±0.05min、39.89±0.06min、40.90±0.04min、41.63±0.07min、42.09±0.05min、43.58±0.03min、44.34±0.04min、44.60±0.03min和46.74±0.04min。

81、本发明还提供了一种记录了槐角炮制品的指纹图谱的产品，其在如下一个或多个保留时间处有特征峰：5.60±0.05min、6.56±0.01min、33.60±0.04min、34.99±0.05min、37.45±0.05min、40.90±0.04min、41.63±0.07min和45.31±0.03min。

82、所述产品可为计算机存储介质；或者，为绘制或印刷的说明书。

83、较佳地，所述槐角炮制品的指纹图谱中，还进一步在如下一个或多个保留时间处有特征峰：5.31±0.01min、9.14±0.03min、11.31±0.02min、16.89±0.01min、22.97±0.04min、25.92±0.01min、27.44±0.02min、27.91±0.02min、30.53±0.03min、32.78±0.02min、34.70±0.03min、35.96±0.06min、38.27±0.05min、39.89±0.06min、43.35±0.02min、46.28±0.02min、46.74±0.04min和49.21±0.04min。

84、较佳地，所述槐角炮制品的指纹图谱在如下保留时间处有特征峰：5.31±0.01min、5.60±0.05min、6.56±0.01min、9.14±0.03min、11.31±0.02min、16.89±0.01min、22.97±0.04min、25.92±0.01min、27.44±0.02min、27.91±0.02min、30.53±0.03min、32.78±0.02min、33.60±0.04min、34.70±0.03min、34.99±0.05min、35.96±0.06min、37.45±0.05min、38.27±0.05min、39.89±0.06min、40.90±0.04min、41.63±0.07min、43.35±0.02min、45.31±0.03min、46.28±0.02min、46.74±0.04min和49.21±0.04min。

85、较佳地，所述槐角炮制品的指纹图谱中，所述槐角炮制品指槐角生品炒制20min得到的槐角炭。

86、本发明还提供了上述槐角生品的指纹图谱作为标准指纹图谱在槐角生品检测与质量控制中的应用。

87、本发明还提供了上述槐角炮制品的指纹图谱作为标准指纹图谱在槐角炮制品检测与质量控制中的应用。

88、所述的应用中，还可包括以下步骤：

89、a、取待检测的槐角生品或槐角炮制品，采用如本发明任一项所述的处理方法得到对应的液相色谱图；

90、b、将步骤a得到的液相色谱图与如本发明任一项所述的指纹图谱进行相似度评价。

91、较佳地，以上步骤b中，若相似度≥0.90，则合格。

92、在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

93、本发明所用试剂和原料均市售可得。

94、本发明的积极进步效果在于：

95、(1)本发明所述的槐角和槐角炭的指纹图谱，各自包括25个共有峰，并确定了其中峰面积较大的12个共有峰的化学结构，本发明所提供的槐角和槐角炭指纹图谱均能够在统一波长下的一张图谱中体现，更为全面、准确、可靠地对槐角药材和槐角炭质量进行评价。

96、(2)本发明所述的槐角和槐角炭的指纹图谱，能更全面地反映药品质量，对指导工业生产控制药品质量更加有意义，更好保证产品的质量。

97、(3)本发明所述的槐角和槐角炭的指纹图谱的建立方法，采用超高效液相色谱法，通过合理选择色谱条件，实现槐角和槐角炭指纹图谱的构建，具有简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。为进一步研究槐角和槐角炭化学成分和质量标准提供依据。

98、(4)本发明所提供的指纹图谱对槐角生品或槐角炭的多个有效成分例如没食子酸甲酯、二氢山柰酚-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(2”-o-β-d-葡萄糖基)-β-d-芸香糖苷等进行分离和定性鉴别，能充分反映产品疗效，对控制工艺稳定性、保障产品质量、稳定产品疗效具有重要意义。