一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法

1.本发明属于生物化学检测领域，具体涉及一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法。


背景技术：

2.头足类是重要的海洋经济动物，被联合国粮农组织认为未来最有开发潜力的渔业资源种类之一，其中柔鱼类是世界头足类渔业和我国远洋鱿钓渔业的重要捕捞对象，根据联合国粮农组织的最新数据显示，近十年来世界商业捕捞的柔鱼类总渔获量约为300万吨/年，同时这些种类在海洋生态系统中占有重要的生态学地位，在海洋生态食物链中处于中间位置，有些种类甚至是其栖息海域的顶级捕食者。
3.脂肪酸在食物链传递过程中相对保守，可以作为标志物示踪研究对象的营养关系。同时，脂肪酸是动物个体的重要营养物质和能量物质，影响胚胎发育及正常的生长。目前，脂肪酸作为生物标志物已经成为生态学领域的重要内容，已经被证实为探究生物生态学、摄食生态学等方面的重要技术手段。最近，脂肪作为生物标志物也被应用于大洋性柔鱼类生殖能量积累及其生殖投入策略的研究中，示踪生殖能量的来源方式及其与栖息海域环境的选择适应性。然而，有别于在摄食生态学上的应用研究，生殖投入策略研究不仅仅需要比较分析组织之间、消费者与被捕食者之间的脂肪酸组成相似性及其变化模式，还需要进行脂肪酸质量含量的变化趋势比较。因此，在利用气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)测定研究对象的脂肪酸浓度后，需要进行脂肪酸质量分数的转化。
4.值得注意的是，脂肪酸测定之前需要萃取测试组织的脂肪。为了获得准确的脂肪酸数据，组织脂肪需要尽可能地萃取完全，并且过程中要最大可能地降低萃取过程中脂肪氧化现象的发生。然而，柔鱼类不同组织的脂肪含量存在较大的差异，比如肌肉组织的脂肪偏低，平均为湿重的1％
–
2％；而消化腺组织的脂肪含量很高，平均为湿重的30％
–
50％。因此，在萃取这些种类的组织脂肪时，需要针对不同组织设定不同的萃取方案，将给实验带来较多的时间成本和系统误差。特别地，在进行消化腺组织脂肪萃取时，时间会相对很长而导致脂肪被氧化严重。为此，在进行柔鱼类组织脂肪酸测定时，需要同时考虑组织脂肪的萃取完整和被氧化，以测定获得准确的脂肪酸质量分数数据。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提供一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法，解决柔鱼类不同组织脂肪萃取时间差异而导致的组织脂肪萃取不完全以及组织脂肪萃取过程中被氧化等问题，准确测定并得出柔鱼类肌肉、消化腺、性腺不同组织的脂肪酸质量分数。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法，基于组织脂肪索氏萃取法进行柔鱼类肌肉、消化腺、性腺组织的粗脂肪萃取和脂肪酸测定，得到不同组织脂肪酸质量分数，包括以下步骤：
8.步骤1、采集柔鱼类胴体肌肉组织、消化腺组织和性腺组织的鲜样各5.00g；
9.步骤2、肌肉组织、消化腺组织和性腺组织的鲜样零下80℃冷冻保存24
–
36小时，分别置入冷冻干燥机冷冻干燥至恒重；
10.步骤3、称量肌肉组织、消化腺组织和性腺组织的干燥样品重量，研磨粉碎，每个组织称取0.3
–
0.5g干燥的粉碎样品，精确到
±
0.1mg；
11.步骤4、使用组织脂肪索氏萃取法对上述肌肉组织、消化腺组织和性腺组织样品中脂肪进行两个阶段萃取：
12.第一个阶段：分别萃取肌肉、消化腺和性腺样品组织的部分脂肪含量，萃取时间均为30分钟，萃取得到的部分脂肪物质经旋转蒸发、氮吹至恒重，记录脂肪含量，精确到
±
0.1mg；随后组织脂肪直接用于脂肪酸甲酯化，置入气相色谱-质谱联用仪的脂肪酸测样瓶，测定每个组织的脂肪酸浓度，单位为mg/ml；
13.第二个阶段：对已经萃取部分脂肪含量后的组织样品继续使用组织脂肪索氏萃取法进行组织脂肪完全脱脂，完全脱脂后的组织样品置入干燥烘箱干燥至恒重，称量此时的组织样品干重，根据肌肉、消化腺和性腺样品组织脱脂前和脱脂后的干重，得出每个组织的脂肪含量，精确到
±
0.1mg；
14.步骤5、根据上述步骤中肌肉、消化腺、性腺组织的脂肪含量(以下称作“总脂肪”)，以及用于脂肪酸测定的部分脂肪含量(以下称作“脂肪酸脂肪”)，得出脂肪酸脂肪占总脂肪的百分比，记作“脂肪酸脂肪占比”，单位％；
15.步骤6、根据脂肪萃取用的肌肉、消化腺、性腺组织样品干燥重量以及脂肪酸脂肪占比，得出每个组织脂肪酸脂肪所对应的样品干燥重量，记作“脂肪酸脂肪样品干重”，单位mg；
16.步骤7、根据测定的肌肉、消化腺、性腺组织的脂肪酸浓度(mg/ml)，得出每个组织的脂肪酸质量分数，公式为：
[0017][0018]
式中，fa为组织的脂肪酸质量分数，单位为mg/mg；c为gc-ms测定的脂肪酸浓度，单位为mg/ml；hv为组织脂肪酸甲酯化时加入的正己烷体积，单位为ml；sw为脂肪酸脂肪所对应的样品干燥重量，单位为mg；k为肌肉、消化腺、或性腺组织；i为gc-ms测定的每个单体脂肪酸。
[0019]
作为优选，所述柔鱼类选为阿根廷滑柔鱼。
[0020]
本发明还提供上述柔鱼类组织脂肪酸含量的检测方法在海洋生态学和繁殖生物生态学领域脂肪酸生物标志物测定与分析中的应用。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明基于组织脂肪索氏抽提处理的基础上获得精确的组织脂肪含量，并准确测定和得出组织的脂肪酸质量分数，最大限度地降低由于不同组织脂肪含量差异及萃取时间不同而产生的实验误差，解决柔鱼类不同组织脂肪萃取时间差异而导致的组织脂肪萃取不完全以及组织脂肪萃取过程中被氧化等问题，准确测定并得出柔鱼类肌肉、消化腺、性腺不同组织的脂肪酸质量分数，定量测定组织的单位质量脂肪酸含量，通过对5尾阿根廷滑柔鱼的胴体、消化腺、性腺等组织进行脂肪萃取并
得出脂肪酸质量分数，结果显示胴体组织的c20:4n6、c20:5n3和c22:6n3质量分数分别为1.05
±
0.09mg/g、9.83
±
2.35mg/g和41.46
±
6.07mg/g；性腺组织的c20:4n6、c20:5n3和c22:6n3质量分数分别为2.20
±
0.31mg/g、22.10
±
3.74mg/g和65.70
±
11.45mg/g；消化腺的c20:4n6、c20:5n3和c22:6n3质量分数分别为2.30
±
1.19mg/g、15.62
±
5.16mg/g和37.64
±
7.72mg/g；可应用于海洋生态学、繁殖生物生态学等领域中开展脂肪酸生物标志物的测定与分析。
附图说明
[0022]
图1是实施例中柔鱼类组织脂肪酸质量分数的测定流程图。
[0023]
图2是实施例中阿根廷滑柔鱼的胴体、消化腺、性腺组织c20:4n6、c20:5n3、c22:6n3的质量分数。
具体实施方式
[0024]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
实施例1
[0026]
如图1所示，本实施例提供一种柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法，基于组织脂肪索氏萃取法进行柔鱼类肌肉、消化腺、性腺组织的粗脂肪萃取和脂肪酸测定，得出组织脂肪酸质量分数，步骤以下：
[0027]
1、采集柔鱼类胴体肌肉组织、消化腺组织和性腺组织的鲜样各5.00g；
[0028]
2、肌肉组织、消化腺组织和性腺组织鲜样零下80℃冷冻保存24
–
36小时后，分别置入冷冻干燥机，冷冻干燥至恒重；
[0029]
3、称量肌肉组织、消化腺组织和性腺组织的干燥样品重量，研磨粉碎。每个组织称取0.3g
–
0.5g干燥的粉碎样品，精确到
±
0.1mg；
[0030]
4、使用组织脂肪索氏萃取法，进行肌肉、消化腺和性腺样品组织脂肪的两个阶段萃取；
[0031]
第一个阶段：分别萃取肌肉、消化腺和性腺样品组织的部分脂肪含量，萃取时间均为30分钟。萃取得到的部分脂肪物质经旋转蒸发、氮吹至恒重，记录脂肪含量，精确到
±
0.1mg。随后，组织脂肪直接用于脂肪酸甲酯化，置入气相色谱-质谱联用仪专用的脂肪酸测样瓶，测定每个组织的脂肪酸浓度，单位为mg/ml；
[0032]
第二个阶段：对已经萃取部分脂肪含量后的组织样品，继续使用组织脂肪索氏萃取法，实现组织脂肪的完全脱脂。完全脱脂后的组织样品置入干燥烘箱，干燥至恒重，称量此时的组织样品干重。根据肌肉、消化腺和性腺等样品组织脱脂前和脱脂后的干重，得出每个组织的脂肪含量，精确到
±
0.1mg。
[0033]
5、根据肌肉、消化腺、性腺组织的脂肪含量(以下称作“总脂肪”)，以及用于脂肪酸测定的部分脂肪含量(以下称作“脂肪酸脂肪”)得出脂肪酸脂肪占总脂肪的百分比，记作“脂肪酸脂肪占比”，单位％；
[0034]
6、根据脂肪萃取用的肌肉、消化腺、性腺组织样品干燥重量以及脂肪酸脂肪占比，得出每个组织脂肪酸脂肪所对应的样品干燥重量，记作“脂肪酸脂肪样品干重”，单位mg；
[0035]
7、根据测定的肌肉、消化腺、性腺组织的脂肪酸浓度(mg/ml)，得出每个组织的脂肪酸质量分数，得出公式为：
[0036][0037]
式中，fa为组织的脂肪酸质量分数，单位为mg/mg；c为gc-ms测定的脂肪酸浓度，单位为mg/ml；hv为组织脂肪酸甲酯化时加入的正己烷体积，单位为ml；sw为脂肪酸脂肪所对应的样品干燥重量，单位为mg；k为肌肉、消化腺、或者性腺组织；i为gc-ms测定的每个单体脂肪酸。
[0038]
根据实施例1中柔鱼类不同组织脂肪酸质量分数的测定方法，对5尾阿根廷滑柔鱼的胴体、消化腺、性腺组织进行脂肪酸质量分数测定，得出的c20:4n6、c20:5n3和c22:6n3的质量分数结果如图2所示，胴体组织的c20:4n6、c20:5n3和c22:6n3的质量分数分别为1.05
±
0.09mg/g、9.83
±
2.35mg/g和41.46
±
6.07mg/g；性腺组织的c20:4n6、c20:5n3和c22:6n3的质量分数分别为2.20
±
0.31mg/g、22.10
±
3.74mg/g和65.70
±
11.45mg/g；消化腺的c20:4n6、c20:5n3和c22:6n3的质量分数分别为2.30
±
1.19mg/g、15.62
±
5.16mg/g和37.64
±
7.72mg/g。
[0039]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。