一种成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用

1.本技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用。


背景技术：

2.血管衰老是多种心血管疾病如：动脉粥样硬化，血管钙化和高血压等的主要危险因素，同时血管衰老也是引起人体各器官系统衰老的重要病理生理基础。研究发现，随着年龄的增长，血管舒张功能及僵硬度等血管功能指标会逐步下降。血管衰老指的是血管随增龄和在心血管危险因素的共同作用下发生的功能、结构老化、退化的生理病理过程，因此针对血管衰老的早期评估和早期诊断，是评估和防治血管衰老及相关疾病的重要措施，具有重要的医学价值及社会意义。
3.目前对于血管衰老的评估主要集中在危险因素，血管功能及血管结构等方面，但是由于血清中的物质变化往往先于血管的结构或者功能的变化，因此通过对血清中这类物质的测量，较评估血管功能和血管结构方面更有助于早期预防、诊断、延缓血管衰及与血管衰老相关的心血管疾病，而这类物质被称为血清生物学标志物，但是目前针对血管衰老的血清生物学标志物仍然空白，因此如何提供针对血管衰老的血清生物学标志物，以弥补针对血管衰老的血清生物学标志物仍然空白，是目前亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本技术提供了一种成纤维细胞生长因子在血管衰老分子标志物的应用，以填补现有技术中针对血管衰老的血清生物学标志物的空白。
5.第一方面，本技术提供了一种成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用，所述应用包括根据所述成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白在所述血管内血液中的浓度非诊断目的的判断血管的衰老程度；
6.所述蛋白的浓度和所述血管的衰老程度呈正相关，且所述蛋白的浓度和所述血管的衰老程度之间通过正反馈调节。
7.可选的，基于所述血管每增龄10年的时长计，所述蛋白在所述血管内血液中的增加重量和所述血管内血液的体积之比为20pg/ml～30pg/ml。
8.可选的，所述衰老程度的指标包括脉搏波传导速度(pwv)、肱动脉血流介导的血管舒张功能(fmd)、踝肱指数(abi)和颈动脉内膜中层厚度(imt)中的至少一种。
9.第二方面，本技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测成纤维细胞生产因子21所表达的蛋白在血液中的浓度的试剂，所述成纤维细胞生产因子21所表达的蛋白在血液中的浓度和血管的衰老程度呈正相关，且所述蛋白在所述血液中的浓度和所述血管的衰老程度之间通过正反馈调节。
10.可选的，基于所述血管每增龄10年的时长计，所述成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白在所述血管内血液中增加的重量和所述血管内血液的体积之比为20pg/ml～30pg/
ml。
11.可选的，所述试剂包括抗体、蛋白质染色剂和荧光标记中的至少一种。
12.第三方面，本技术提供了一种第二方面所述的试剂盒在评估或辅助评估血管衰老程度的制剂中的应用。
13.第四方面，本技术提供了一种活性成分，用以根据第一方面所述的应用的原理抑制血管衰老，所述活性成分包括能提高成纤维细胞生长因子21的表达水平或能增加成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的数量的试剂。
14.可选的，所述试剂包括外源性成纤维细胞生长因子21及其类似物；和/或
15.所述试剂包括增强成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的稳定性的药物成分；和/或
16.所述试剂包括能表达成纤维细胞生长因子21的核酸分子及其载体。
17.第五方面，本技术提供了一种第四方面所述的活性成分在制备延缓血管衰老药物中的应用。
18.本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
19.本技术实施例提供的一种成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用，通过将成纤维细胞生长因子21首次作为血管衰老生物学标志物中，由于成纤维细胞生长因子21蛋白存在血液中，并且可以促进血管内皮细胞的一系列功能，包括促进细胞的糖酵解功能和一氧化氮(no) 的分泌的功能，而本技术创新性的发现了血液中的成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的浓度跟血管衰老程度呈正相关，衰老的血管对成纤维细胞生长因子21蛋白呈现抵抗现象，说明血管衰老伴随的血液中成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白浓度的上升是代偿性的上升，用于部分补偿成纤维细胞生长因子21表达的蛋白对衰老的血管细胞的有益的代谢调节作用的降低所产生的影响，说明该蛋白在血液中浓度和血管衰老之间可以通过正反馈调节进行调整，因此通过明确成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白在血液中的浓度和血管的衰老程度之间的相关性和调节方式，使得成纤维细胞生长因子21可以作为血管衰老的血清生物学标志物，以弥补针对血管衰老的血清生物学标志物的空白。
附图说明
20.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本技术的实施例，并与说明书一起用于解释本技术的原理。
21.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本技术实施例提供的健康人血液中fgf21蛋白浓度和不同血管年龄区间的关系结果图；
23.图2为本技术实施例提供的健康人血液中fgf21蛋白浓度和血管年龄之间的关系结果图；
24.图3为本技术实施例提供的健康人血液中fgf21蛋白浓度和血管衰老指标pwv的相关性示意图；
25.图4为本技术实施例提供的fgf21对内皮细胞释放一氧化氮影响荧光对比图；
26.图5为本技术实施例提供的fgf21对内皮细胞释放一氧化氮影响的荧光结果图；
27.图6为本技术实施例提供的fgf21对内皮细胞的基础糖酵解的影响结果图；
28.图7为本技术实施例提供的fgf21对内皮细胞的代偿性糖酵解的影响结果图；
29.图8为本技术实施例提供的fgf21随内皮细胞的衰老对内皮细胞中可调控基因的数量的减少的结果图；
30.图9为本技术实施例提供的敲除fgf21小鼠的fgf21相对mrna水平的对比结果图；
31.图10为本技术实施例提供的敲除fgf21小鼠的血液fgf21蛋白浓度的对比结果图；
32.图11为本技术实施例提供的敲除fgf21小鼠的收缩压的对比结果图；
33.图12为本技术实施例提供的敲除fgf21小鼠的pwv的对比结果图；
34.图13为本技术实施例提供的正常fgf21小鼠的血管剖面示意图；
35.图14为本技术实施例提供的敲除fgf21小鼠的血管剖面示意图；
36.图15为本技术实施例提供的敲除fgf21小鼠的血管管腔直径的变化结果图。
具体实施方式
37.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
38.本技术的创造性思维为：
39.血管衰老指的是血管随增龄和在心血管危险因素的共同作用下发生的功能、结构老化、退化的生理病理过程。从结构上来说，血管衰老会伴随细胞外基质重塑，引起大弹性动脉中弹性蛋白和胶原蛋白组成成分的变化。动脉内膜中层通过基质金属蛋白酶的上调发生弹力蛋白断裂和降解。胶原蛋白的沉积，取代了缺失的弹性蛋白分子，加速形成晚期糖基化终产物，促进结构蛋白的交联，加剧动脉硬化，从而促进血管衰老的形成。从功能上来说，血管衰老主要表现为动脉僵硬度增加、血管顺应性下降以及血管修复、新生能力的降低。
40.血管衰老是老年人群多种慢性疾病共同的发病机制之一，是影响健康老龄化的重要因素。血管衰老的早期评估和早期诊断，是评估和防治血管衰老及相关疾病的重要措施，具有重要的医学价值及社会意义。
41.目前对于血管衰老的评估主要集中在危险因素，血管功能及血管结构等方面，其中，针对血管衰老功能检测的常用指标包括血流介导的血管舒张(fmd)、硝酸甘油诱导的血管舒张 (nid)、肱踝脉搏波速度(bapwv)、肱踝指数(abi)等，针对血管结构的评估可通过核磁共振成像(mri)、内膜中层厚度(imt)来进行。循环系统中的血液是人类组织中最易采集和信息含量丰富的样本，对鉴定分子标志物非常重要，其中经分离得到的血清包含了人体各器官分泌和交流的载体—代谢小分子和蛋白质。因此血清中的物质变化往往先于血管的结构或者功能的变化，而通过对血清中这类物质的测量，较评估血管功能和血管结构方面更有助于早期预防、诊断、延缓血管衰及与血管衰老相关的心血管疾病，而这类物质被称为血清生物学标志物，但是目前针对血管衰老的血清生物学标志物仍然空白，因此如何提供针对血管衰老的血清生物学标志物，以弥补针对血管衰老的血清生物学标志物仍然空白，
是目前亟需解决的技术问题。
42.除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
43.本技术实施例提供一种成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用，所述应用包括根据所述成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白在所述血管内血液中的浓度非诊断目的的判断血管的衰老程度；
44.所述蛋白在所述血液中的浓度和所述血管的衰老程度呈正相关，且所述蛋白在所述血液中的浓度和所述血管的衰老程度之间通过正反馈调节。
45.在一些可选的实施方式中，基于所述血管每增龄10年的时长计，所述成纤维细胞生长因子21 所表达的蛋白在血管内血液的增加重量和所述血管内血液的体积之比为20pg/ml～30pg/ml。
46.本技术实施例中，控制血液中成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白增加的重量和所述血管内血液的体积之比为20pg/ml～30pg/ml的积极效果是在该重量体积比的范围内，能准确反映出随着血管增龄的变化对血液内成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的浓度的影响情况，从而通过对成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白在血液中浓度的增加的测量，就能反推出血管衰老程度。
47.在一些可选的实施方式中，所述衰老程度的指标包括脉搏波传导速度(pwv)、肱动脉血流介导的血管舒张功能(fmd)、踝肱指数(abi)和颈动脉内膜中层厚度(imt)中的至少一种。
48.本技术实施例中，控制衰老程度的指标种类的积极效果是能通过对血管实际的检测指标进行限定，能准确的通过血管实际的生理指标反映出血管衰老程度。
49.脉搏波传导速度(pulse wave velocity，pwv)是反映动脉血管的僵硬程度的常用评估指标之一，通过检测不同动脉节段之间的脉搏波传导距离和时间计算得到脉搏传导速度。血管衰老通常伴随着血管僵硬度的增加和脉搏波传导速度的增加。因此，通过对脉搏波传导速度的测量，可以一定程度上反映血管的衰老程度。
50.肱动脉血流介导的血管舒张功能(flow-mediated dilation,fmd)依赖于血管内皮细胞合成和分泌一氧化氮。一氧化氮具有强大的舒张血管、控制炎症、防止血液凝固等功能。血管的衰老会伴随着血管内皮细胞合成和分泌一氧化氮的功能的下降，进而可以通过评估肱动脉血流介导的血管舒张功能来评估血管内皮细胞的衰老和功能下降情况。
51.踝肱指数(ankle
–
brachial index，abi)指脚踝处(足背动脉或胫后动脉)测量的收缩压与肱动脉测量收缩压比值。当下肢动脉出现狭窄或闭塞，使远端踝部动脉血供减少时，abi降低；在血管管壁明显钙化等动脉硬化表现明显的情况下，测量时动脉管壁不能被挤压 (non-compressible)，使测量出的收缩压明显升高，abi出现异常升高。目前，abi小于0.9或大于1.3被认为异常。因此，abi值可以反映患者血管的疾病和衰老程度。abi大于1.3提示患者血管壁钙化老化以及血管失去收缩功能，可以一定程度上反映血管的衰老程度。
52.颈动脉内膜中层厚度(carotid intima-media thickness,cimt)由颈动脉超声检测。正常的颈动脉的内膜中层的厚度会随着增龄呈线性的增加的趋势。此外，颈动脉伴随的异常衰老和病变，如颈动脉中动脉粥样硬化斑块的形成，也会显著增加cimt的值。因此，cimt值的正常或异常增加也可以一定程度上反映血管的衰老和病变的程度。
53.基于一个总的发明构思，本技术实施例还提供一种试剂盒，用以根据第一方面所述的应用制备血管衰老的试剂盒，所述试剂盒包括检测成纤维细胞生产因子21所表达的蛋白在血液中的浓度的试剂，所述成纤维细胞生产因子21所表达的蛋白在血液中的浓度和所述血管的衰老程度呈正相关，且所述蛋白在所述血液中的浓度和所述血管的衰老程度之间通过正反馈调节。
54.该试剂盒是基于上述应用的原理来实现，该试剂盒的具体检测原理可参照上述实施例，由于该试剂盒采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
55.本技术实施例中，由于成纤维细胞生产因子21所表达的蛋白在血液中的浓度和所述血管的衰老程度呈正相关，根据此原理，在试剂盒中设置能够检测成纤维细胞生产因子21所表达的蛋白在血液中的浓度的试剂，就能间接的对血管的衰老程度作出较为准确的检测。
56.在一些可选的实施方式中，基于所述血管每增龄10年的时长计，所述成纤维细胞生长因子21 所表达的蛋白在血管内血液的增加重量和所述血管内血液的体积之比为20pg/ml～30pg/ml。
57.本技术实施例中，控制成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的增加重量和血管内血液的体积之比为20pg/ml～30pg/ml的积极效果是在该重量体积比的范围内，能准确反映出随着血管增龄的变化对血液内成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的浓度的影响情况，从而能通过试剂盒对血液内成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的浓度进行检测，再对比前后的浓度变化，就能反推出血管衰老程度。
58.在一些可选的实施方式中，所述试剂包括抗体、蛋白质染色剂和荧光标记中的至少一种。
59.本技术实施例中，控制试剂的具体种类的积极效果是由于成纤维细胞生长因子21的表达产物中有血液中的成纤维细胞生长因子21蛋白，因此只需要采用蛋白类试剂对成纤维细胞生长因子21所表达出的蛋白进行检测，就能准确的通过成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的前后浓度变化，就能反推出血管衰老程度。
60.基于一个总的发明构思，本技术实施例还提供一种所述试剂盒在评估或辅助评估血管衰老程度的制剂中的应用。
61.该应用是基于上述试剂盒来实现的，该应用的具体检测原理可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
62.本技术实施例中，利用试剂盒配合其他试剂，通过试剂盒对成纤维细胞生长因子21所表达出的蛋白进行检测，由于成纤维细胞生长因子21所表达出的蛋白的浓度跟血管衰老程度呈正相关，因此通过试剂盒检测成纤维细胞生长因子21所表达出的蛋白的浓度就能反推出血管衰老程度，实现通过试剂盒对血管衰老程度的评估或辅助评估。
63.基于一个总的发明构思，本技术实施例还提供一种活性成分，用以根据第一方面所述的应用的原理抑制血管衰老，所述活性成分包括能提高成纤维细胞生长因子21的表达水平或能增加成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白数量的试剂。
64.该活性成分是基于上述应用的原理来实现的，该活性成分的具体原理可参照上述
实施例，由于该活性成分采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
65.本技术实施例中，根据成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的浓度跟血管衰老程度呈正相关这一要点，同时在长期研究过程中发现成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的浓度和血管衰老程度之间为正反馈调节，通过加强成纤维细胞生长因子21的表达能力，能延缓血管衰老程度，因此通过限定活性成分包含这类试剂，就能延缓血管衰老程度。
66.在一些可选的实施方式中，所述试剂包括外源性成纤维细胞生长因子21及其类似物；和/或
67.所述试剂包括增强成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的稳定性的药物成分；和/或
68.所述试剂包括能表达成纤维细胞生长因子21的核酸分子及其载体。
69.本技术实施例中，控制试剂的具体种类，由于只要提高成纤维细胞生长因子21的表达水平或能增加成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的数量的试剂就能通过正反馈调节延缓血管衰老程度，因此只要针对成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白和影响成纤维细胞生长因子21表达过程的药物都可以作为活性成分中的试剂。
70.外源性成纤维细胞生长因子21及其类似物是指功能和结构上和成纤维细胞生长因子21相似或者相同的物质，例如聚乙二醇化成纤维细胞生长因子21、聚多肽与成纤维细胞生长因子21的融合蛋白。
71.增强成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的稳定性的药物成分是指了可以稳定成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白或者增加其半衰期的药物，例如成纤维细胞生长因子21的小分子化药物或成纤维细胞生长因子21的抗体药物；
72.表达成纤维细胞生长因子21的核酸分子及其载体是指含有能够表达出成纤维细胞生长因子 21的核酸分子或者承载有这类核酸分子的载体，例如：含有成纤维细胞生长因子21的质粒、腺病毒或慢病毒。
73.基于一个总的发明构思，本技术实施例还提供一种所述活性成分在制备延缓血管衰老药物中的应用。
74.该应用是基于上述活性成分来实现的，该应用的具体原理可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
75.本技术实施例中，根据提高成纤维细胞生长因子21的表达水平或能增加成纤维细胞生长因子 21所表达的蛋白的数量的试剂就能通过正反馈调节延缓血管衰老程度这一水平，利用活性成分混合其他药物成分，由于活性成分中含有提高成纤维细胞生长因子21的表达水平或能增加成纤维细胞生长因子21所表达的蛋白的数量，因此通过活性成分的加入，可以有效的延缓血管衰老。
76.下面结合具体的实施例，进一步阐述本技术。应理解，这些实施例仅用于说明本技术而不用于限制本技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
77.本技术实施例中的定量试验，均设置至少三次重复实验，结果取平均值。
78.本技术实施例中涉及到受试者标本的采集是基于《赫尔辛基宣言》进行的，充分尊重受试者及其家属的知情同意权，研究过程中使用的实验手段先进、科学，采样过程符合医疗常规，并制定了受试者保护方案，并已通过科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会的伦理审批。
79.本技术实施例中的小鼠实验是基于《湖北省实验动物管理条例》和《华中科技大学实验动物伦理委员会章程》进行的，并已通过华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物伦理委员会的伦理审批。
80.本技术实施例中各试剂的购买来源：
81.非必需氨基酸购自浙江森瑞生物科技有限公司；
82.低血清生长添加剂lsgs、0.05％胰酶和胎牛血清fbs购自gibco公司；
83.无菌pbs、蛋白上样缓冲液5
×
购自武汉博士德公司；
84.100
×
青霉素链霉素购自invitrogen公司；
85.m199培养基购自hyclone公司；
86.sybrgreen，rna逆转录试剂盒购自日本toyobo公司；
87.rfgf21购自美国peprotech公司；fgf21-elisa试剂盒购自abcam公司(ab222506)；
88.hipure rna提取试剂盒购自magen公司；
89.qpcr引物来自上海生物工程公司设计；
90.seahorsexf细胞糖酵解速率试剂盒(货号：103344-100)；
91.no检测试剂盒(碧云天)。
92.小鼠无创血压计(北京众实科技)；
93.组织研磨仪(武汉谷歌)；
94.气体麻醉机(英国mss)；
95.小动物无创超声多普勒血流仪(美国indus)；
96.384孔pcr仪(美国罗氏公司)；
[0097]-80℃超低温冰箱(日本三洋)；
[0098]
co2培养箱(美国thermo公司)；
[0099]
sunrise酶标仪(日本岛津)；
[0100]
激光共聚焦显微镜(nikon c2+，东京，日本)；
[0101]
seahorse xfp分析仪系统(agilent,santa clara,ca)。
[0102]
实施例1
[0103]
考察增龄伴随着健康人血液中成纤维细胞生长因子21(fgf21)蛋白浓度的增加，具体步骤如下：
[0104]
1.伦理批准：
[0105]
本研究得到了华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会的批准。本研究的实施过程完全符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》中关于人体医学研究的伦理准则和道德原则，本研究中涉及到的参与者在参与之前都已签署书面知情同意书。
[0106]
2.离体血浆的收集和测定：
[0107]
参与者为212名健康体检志愿者，其年龄在20～70岁，bmi在17kg/m2～25kg/m2之间，排除代谢性疾病如高血压、高脂血症、糖尿病、肿瘤、感染、炎症或明显的血管硬化(pwv
值在正常范围内)等可能影响fgf21浓度的指标。
[0108]
所有志愿者在采血前至少一周内禁止吸烟和饮酒，在禁食一晚后，早晨采集每个志愿者的血液样本。将收集的静脉血用含肝素的无菌真空管收集，离心机于320g离心20min，然后将离心后得到的上层血浆进行分装，于-80℃冰箱冷冻保藏直到使用。
[0109]
3.elisa检测血浆中fgf21浓度：
[0110]
(1)将收集冻存的血浆样品从冰箱取出，进行解冻和编号。
[0111]
(2)将样品按照比例稀释至样品稀释剂ns中。
[0112]
(3)准备好所有试剂，工作标准液和样品。
[0113]
(4)将板框上多余的微孔条取下，和干燥剂一同放回铝箔袋中，重新密封好，放回4℃存放处。
[0114]
(5)将50μl所有样品或标准液加到相应的测试孔中。
[0115]
(6)在每个孔中加入50μl抗体混合物。
[0116]
(7)密封板并在设置为400rpm的板振荡器上于室温孵育1h。
[0117]
(8)用3x350μl的1x wash buffer pt清洗每个孔，要求wash buffer pt应在孔中保留至少10秒钟(为了获得良好的性能，每次都必须彻底清除液体)；在最后一次清洗后，把板子倒过来，用干净的纸巾轻拍以去除多余的液体。
[0118]
(9)每个孔中加入100μl的tmb显影液，用锡箔纸包好避光，在设置为400rpm的平板振荡器上孵育10min。根据实验室环境条件，额外需要再进行孵育，孵育时间为20min。
[0119]
(10)向每个孔中加入100μl终止溶液。在平板振荡器上将平板摇晃1min左右，使其充分混合均匀。
[0120]
(11)提前打开酶标仪预热，设置好测试波长od值为450nm，将平板放入仪器进行测试，记录450nm处的od值，根据标准品测试的od值与实际标准品的浓度绘制出相应的标准曲线，得到曲线的公式，将样品测得的od值代入公式，算出样品对应的实际浓度，整理分析fgf21 生理浓度范围。
[0121]
如图1至图3显示的数据可知，：增龄伴随着健康人血液中fgf21蛋白浓度的增加，如图 1所示，平均每增龄10年血液中fgf21浓度增加25pg/ml，以及如图2所示血液中fgf21蛋白浓度与健康人年龄和如图3所示的血管衰老指标pwv呈正相关性。
[0122]
实施例2
[0123]
将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
[0124]
考察质量浓度为400pg/ml的fgf21对huvec释放一氧化氮功能的促进作用，具体步骤如下：
[0125]
1.内皮细胞分离步骤：
[0126]
(1)提前准备好无菌纱布，输液器，50ml的注射器，10ml的注射器，50ml的离心管， t25细胞培养瓶，m199基础培养基，完全培养基，分内皮细胞器械。并将0.1％胶原酶ii放在37 ℃进行预热。提前配制好原代内皮细胞完全培养基50ml，完全培养基包含84％的m199、10％胎牛血清(fbs)、2％生长因子(lsgs)、1％非必须氨基酸和1％青霉素-链霉素。
[0127]
(2)人脐静脉内皮细胞(huvecs)是来自没有传染病史，近期没有感染，没有家族遗传疾病的健康足月胎儿，在胎儿出生后4h内从新生儿脐带中分离出来的，在靠近胎盘处剪取长约9cm～16cm的脐带，挤出脐带血管里面剩余的血液，将其放在无菌预冷的pbs液中，将
样本移至实验室超净台中，分离细胞的过程应在4h内完成。
[0128]
(3)将脐带用镊子夹出移到培养皿中，在培养皿中用pbs清洗脐带中残留的血液，剪去脐带被镊子夹后水肿的部位，脐带的末端有三根血管，其中较粗的一根为脐静脉血管，清洗末端脐带上的血凝块(可以直接用手进行清洗)，用眼科剪将脐带两端剪掉。
[0129]
(4)将输液器针头置入较粗的脐静脉中(保留针套头，使其充当钝针头)，用血管钳夹住包含钝针头的脐静脉血管后，用5ml的注射器吸取10ml预热的pbs，注入输液器中对脐静脉血管进行冲洗，重复2到3次，待最后流出的液体为清澈透明时，用血管钳夹住脐带的另一端。
[0130]
(5)用注射器吸空静脉血管里面残留的气体，使血管腔内形成真空负压状态，之后缓慢加入10ml预热好的0.1％胶原酶ii，直到红色的胶原酶液体充满脐静脉，此时，血管呈现膨胀充盈状态，将脐带全部放在手掌心中，热敷13min左右。这个过程中需轻轻揉捏脐带几次，使内皮细胞充分掉落下来。
[0131]
(6)热敷时间到后便将末端脐带上的血管钳松开，用50ml的注射器吸取30ml左右的m199 细胞培养基，注入输液器后收集细胞消化液至50ml的离心管中。
[0132]
(7)将收集液进行离心，于1000rpm离心7min，用巴氏吸管轻轻吸走上清液。以免将细胞沉淀重悬扩散。
[0133]
(8)加入3ml～4ml左右配好的完全培养基，用巴氏吸管轻轻吹打混匀后加入到25cm2培养瓶中重悬，摇晃均匀后放入37℃，含5％co2细胞培养箱中培养。
[0134]
(9)过6小时左右待细胞贴壁后，可用无菌pbs轻轻冲洗细胞(防止贴壁细胞被冲洗下来)，加入新鲜的完全培养基后，将细胞放入培养箱继续培养。之后每48小时换液一次，当细胞密度达到80％至90％时便可进行传代。
[0135]
(10)细胞传代时，先弃掉上清，加入3ml的无菌pbs对细胞进行冲洗，弃掉pbs后加入1ml的质量浓度为0.05％胰蛋白酶-edta溶液，放入细胞培养箱中1～2min后取出，用手轻轻拍打培养皿周围，放入操作台后加入4ml的完全培养基，用巴氏吸管吹打混匀后分别加入到2 个新的10cm的培养皿中，补充完全培养基至7ml后放入细胞培养箱中。
[0136]
2.内皮细胞no检测
[0137]
将huvecs均匀种在共聚焦小皿中，细胞初始密度为40％，实验前每24h更换含不同浓度 rfgf21(0、400pg/ml)的培养基。细胞处理48h后，按照1:2000比例，用试剂盒提供的daf-fmda稀释液稀释daf-fm da，使终浓度为2.5μmol/l。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的daf-fm da(加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常一个共聚焦小皿加入稀释好的daf-fmda的体积为500μl)，于37℃细胞培养箱内孵育20min。用hanks溶液(ph 7.4)洗涤细胞三次，充分去除细胞周围的daf-fm da。使用495nm激发波长，515nm发射波长检测刺激前后荧光的强弱。
[0138]
图4和图5的结果显示：如图4所示，相比较对照组，使用400pg/ml的fgf21干预处理后，细胞平均荧光强度显著增加，由图5的数据对比可知，内皮细胞释放一氧化氮能力显著提升。
[0139]
实施例3
[0140]
将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：
[0141]
考察不同浓度fgf21对huvec糖酵解功能的促进作用，具体步骤如下：
[0142]
实验前3天，将huvecs按10000个细胞/孔的密度接种在24孔海马xf细胞培养微孔板上(agilent，santa clara，ca)。实验前每12h更换含不同浓度rfgf21(0、100、400、5000 pg/ml)的培养基。
[0143]
在实验前一天，传感器筒在一个37℃的非co2培养箱中，在seahorse xf calibrant中水化过夜，第二天，细胞在非co2培养箱中孵育1h。培养基改为含有葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺和hepes 缓冲液的海马培养基。根据制造商的说明书，使用seahorse xfp分析仪系统(agilent，santaclara，ca)在37℃下测量细胞的实时细胞外酸化率(ecar)和耗氧率(ocr)，以确定huvecs 的糖酵解率。
[0144]
如图6和图7所示，相比较对照组，图6中加入400pg/ml的fgf21处理后的内皮细胞基础糖酵解与图7中代偿性糖酵解率显著增加。
[0145]
实施例4
[0146]
将实施例4和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于：
[0147]
考察huvec中能否被400pg/ml的fgf21显著调控的基因随细胞的复制性衰老而显著降低，具体步骤如下：
[0148]
1.原代内皮细胞的培养与rfgf21处理：
[0149]
培养huvecs并计算群体倍增水平(pdl)，记录细胞生长的代数与传代的日期，当细胞由年轻到衰老生长到不同pdl(t0、t1、t2、t3、t4、t5)时，将细胞均匀铺在六孔板中，待细胞贴壁后用含2％的fbs的培养基饥饿细胞12h，更换含10％的fbs和同一浓度rfgf21 (400pg/ml)的培养基培养细胞48h，然后去除上清液，取hi pure rna extract kit中的350μlripe溶液裂解细胞。将裂解液加入到1.5ml的无酶ep管中，记录好操作时间和样本信息后放入-80℃冰箱中保存。
[0150]
2.rna的抽提，质检，mrna建库与差异表达基因的筛选：
[0151]
(1)rna的抽提：利用高纯rna提取试剂盒提取前述经过fgf21处理的huvecs中的总rna。
[0152]
(2)rna的质检：通过nanodrop 2000分光光度计(美国热电公司)在260/280nm处检查rna的完整性、纯化和质量，并通过生物分析仪4200(安捷伦，美国加利福尼亚州圣克拉拉) 和琼脂糖凝胶分析检查rna。
[0153]
(3)mrna的建库：每组脐带的rna样本送至华大基因有限公司(中国深圳)，在illuminahiseq x测序平台上进行mrna深度测序。按照制造商的说明，使用mirneasy micro试剂盒(德国希尔登市qiagen)从样品中提取总rna。使用(vazyme，中国南京)的vahtsmrna seq v2文库制备试剂盒制备ngs文库。向上述体系中加入3’末端加“a”缓冲反应体系。与下一步测序接头5’末端的单个“t”突出互补配对并准确连接，连接测序接头，对mrnas进行pcr 扩增，pcr产物进一步纯化并用于测序。
[0154]
(4)差异表达基因的筛选：数据分位数标准化，利用r软件包对基因进行筛选，用p《0.05 筛选差异表达基因，结果如表1和图8所示。
[0155]
表1
[0156][0157]
如图8和表1可知，400pg/ml的fgf21对衰老细胞中基因的调控逐渐减少，出现fgf21 抵抗现象。
[0158]
实施例5
[0159]
将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于：
[0160]
考察实施例4中肝脏内特异性敲除fgf21(cko)可否降低血液中fgf21的浓度至基线水平，具体步骤如下：
[0161]
1.转基因鼠的构建：由于fgf21基因有1个转录本，因此根据fgf21基因的结构，推荐fgf21-201 (ensmust00000033099.5)转录本的exon1-exon3作为敲除区域，该区域包含所有的编码序列，敲除该区域将导致蛋白质功能的中断。
[0162]
采用crispr/cas9技术对fgf21基因进行修饰，流程如下：体外转录sgrna，并构建供体载体；
[0163]
将cas9、sgrna和donor微量注射到c57bl/6jgpt小鼠受精卵中；
[0164]
受精卵移植获得f0阳性小鼠，经pcr和测序证实；
[0165]
将f0阳性小鼠与c57bl/6jgpt小鼠交配，获得稳定的f1代小鼠模型；
[0166]
flox小鼠与表达cre重组酶的小鼠交配后被敲除，导致靶基因在肝组织中的功能丧失。
[0167]
2.qpcr检测小鼠肝脏组织中fgf21 mrna表达水平：
[0168]
(1)用75％的酒精擦拭操作台。
[0169]
(2)准备好无rna酶ep管，移液器，提取rna的试剂盒(magen hipure total rnakits)。
[0170]
(3)提前配制好含有70％乙醇的depc处理水，离心机4℃提前预冷。
[0171]
(4)rna提取操作过程：
[0172]
1)从-80℃冰箱中取出肝脏组织，用电子天平秤取10mg肝脏组织，放置于1.5ml的无酶ep管中；加入600μl的buffer rl裂解液，加入2～3颗无酶研磨珠(2mm)放入-80℃冰箱预冷30min，研磨频率为6m/s，研磨时间为20s，暂停时间为15s，循环两次。研磨完毕后静置3min～5min后在4000rpm离心5min，收集上清。
[0173]
2)提rna时，离心机提前4℃预冷，把gdna过滤柱(蓝色)装在2ml收集管中，标记好过滤柱的序号，把细胞裂解液对应的加入到过滤柱中，离心机设置为14000g后离心 2min。
[0174]
3)离心结束后，将gdna过滤柱丢弃，向2ml收集管中加入等体积的含70％乙醇的 depc水，并用1ml的移液器吹打混匀4～5次。
[0175]
4)将hipure rna mini column放入到新的2ml收集管中，标记好顺序后将含70％乙醇混合好的液体移至过滤柱中，于12000g离心1min，将蛋白质去除，而使rna吸附留在过
滤柱上。
[0176]
5)将离完心后收集管中的液体弃掉后，向过滤柱里面加入500μl的buffer rw1，于 12000g离心1min。洗涤过滤柱，将过滤柱上的蛋白质和其他基质清洗去除干净。
[0177]
6)提前用乙醇按照比例稀释好buffer rw2，离心后便倒弃收集管中的滤液，把过滤柱放入到收集管中，每个过滤柱加入500μl的buffer rw2，于12000g离心1min，目的是去除过滤柱上的盐分。
[0178]
7)离心后倒弃收集管中的滤液，把过滤柱装回收集管中，每个过滤柱加入500μl的 buffer rw2，于12000g离心1min。
[0179]
8)弃掉收集管中的液体，把过滤柱重新放入收集管中空甩过滤柱，于12000g离心 2min，目的是去除过滤柱里剩余的乙醇。
[0180]
9)离心后将过滤柱取出并转移至新的1.5ml无酶ep管中，标记好ep管编号，将20 μl～30μl的rnase free water加入到过滤柱膜的中央，静置2min后在12000g条件下进行离心2min，此操作的目的是将rna洗脱下来。
[0181]
10)最后可将离心洗脱后的液体吸出，重新加入到过滤柱中，再次进行离心洗脱。
[0182]
11)将提取出的rna放置在冰盒上，进行rna浓度的测定。
[0183]
(5)rna浓度的测定：
[0184]
1)提前打开电脑，点开nano drop 2000软件后选择rna测定选项。
[0185]
2)用无酶水清洗测量头后进行校准和调零。
[0186]
3)用移液器吸取1.5μl待测rna样本并进行检测，每个样品需测量2次，最后计算取平均值。
[0187]
4)每次加样前先用擦拭纸将测量头擦拭干净，再滴加待测样本进行检测。
[0188]
(6)调节样本rna浓度大小：
[0189]
测试完成后，选出这一批样本中rna浓度的最小值，算出体积为14μl时总rna量。根据总rna量数值的大小，计算出其他样本的rna总体积vn，以及需要补加的无酶水体积为 (14-vn)μl，使所有样本的rna终浓度和终体积一致。
[0190]
(7)mrna逆转录成cdna：
[0191]
将浓度调为一致的样本重新加入到200μl的无酶ep管中，然后加入1μl的primer mix，构成15μl的体系，放置在pcr仪后，65℃
×
5min进行rna变性，继续配制mix，以20μl的体系进行计算，每管样品加入5μl的mix混合试剂，配制如下：4μl的5
×
rt buffer，1μl的rtenzyme mix。放入pcr仪器中37
°
℃
×
15min，98℃
×
5min，进行逆转录得到cdna。最后做好样本标记，放入-20℃冰箱中保存。
[0192]
(8)荧光定量pcr：
[0193]
1)使用toyobo sybr green mix进行qpcr实验，按照如表2的反应体系配制：
[0194]
表2
[0195]
10μl反应体系体积sybr green5μl无酶水2.5μlcdna0.1μl引物2.4μl
[0196]
2)上机检测：将上述试剂混匀后加入384孔板中，每个样本设置3个复孔，然后将384孔板放入384荧光定量pcr仪中，设定程序。根据引物tm值和扩增片段大小进行时间和循环次数设置。
[0197]
3)反应完成后，进行数据分析，采用2-δδct
值进行计算，得出mrna的相对表达量，其中，小鼠引物序列如表3所示。
[0198]
表3
[0199]
基因forwardreversefgf21cggttacaatgtgtaccagtctgtaaaggctctaccatgctcagβ-actinggctgtattcccctccatcgccagttggtaacaatgccatgtgapdhaatggtgaaggtcggtgtgtggagtcatactggaacatgtag18srnaatgcggcggcgttattccgctatcaatctgtcaatcctgtcc
[0200]
3.elisa检测小鼠血浆fgf21的表达变化：如实施例1中检测方法所示。
[0201]
如图9和图10所示，小鼠肝脏fgf21 mrna水平和血浆fgf21蛋白水平都显著降低。
[0202]
实施例6
[0203]
将实施例6和实施例5进行对比，实施例6和实施例5的区别在于：
[0204]
考察cko可显著升高小鼠的收缩压和pwv，具体步骤如下：
[0205]
1.小鼠无创血压测量：
[0206]
(1)使用合适大小的小鼠固定器将小鼠固定，尾部全部露出，确保小鼠在固定器中为正中位置固定无移动，小鼠鼻部可正常呼吸。提前将加热板打开并升温至37℃；
[0207]
(2)将小鼠固定器置于加热板上，将闭塞套套在鼠尾根部，将传感器(vpr)套在鼠尾上，距离闭塞套大约0.5cm距离即可；
[0208]
(3)启动测量选项，机器自动充气直至闭塞套完全阻断鼠尾血流，开始放气。
[0209]
(4)压力检校后，鼠尾动脉缓缓打开，机器识别压力变化起始点为收缩压，维持放气，直至血流由动脉进入静脉，在静脉打开的一瞬间感受器记录值为舒张压。
[0210]
2.pwv仪器检测小鼠pwv值变化：
[0211]
小鼠使用异氟烷气体麻醉平稳后(流量＝5，浓度＝1.5)，仰卧放置在加热心电传导平板上，四肢末端使用导电糊黏贴在电极位置，观察小鼠心电图正常无干扰杂波。使用多普勒超声(mousedoppler)进行pwv测量。将耦合剂均匀涂抹在小鼠胸部及下腹部，使用20mhz探头在小鼠胸部及下腹部靠近正中线腹主动脉走行部位进行测量，待显示屏上标椎压力波形出现时进行保存，并记录胸部及下腹部探头之间的垂直距离。
[0212]
pwv＝distance between probe tips(mm)/(time between start of wave at position 1 and start of wave at position 2)(ms)
[0213]
图11和图12的结果显示：cko组小鼠的收缩压和pwv显著增加。
[0214]
实施例7
[0215]
将实施例7和实施例5进行对比，实施例7和实施例5的区别在于：
[0216]
考察cko可否显著增加小鼠的血管管腔直径，具体步骤如下：
[0217]
1.实验钱准备：小鼠普通饮食喂养40周结束后，使用4％水合氯醛麻醉小鼠，待麻醉平稳，摘除眼球取血，将血液置于提前肝素化后的1.5ml的ep管中，使用离心机分离血浆及血细胞(3000rpm，15min)，吸取分离后位于上层的血浆，置于200μl的ep管中，于-80℃低
温保存。快速打开小鼠胸腔及腹腔，使用眼科剪在右心房剪一破口，静脉输液针头由心尖部左心室部位插入，使用提前预冷的pbs溶液进行灌流，观察到小鼠肝脏由红色变为灰黄色提示灌流完全。快速分离并提取小鼠胸主动脉，使用4％多聚甲醛固定并使用30％蔗糖水溶液4℃脱水后进行石蜡包埋。
[0218]
2.he染色：
[0219]
(1)石蜡切片(脱蜡至水洗过程)；依次将石蜡切片放入二甲苯中静置20min，再放入另一新鲜二甲苯中静置20min，在无水乙醇中5min，再在另一新鲜无水乙醇中静置5min，75％酒精，5min梯度脱蜡，水洗结束；
[0220]
(2)苏木素染色：使用苏木素工作液对制备好的切片进行染色，时间3min～5min；染色结束后使用清水洗净多余的染色液；使用1％盐酸水溶液分化数秒钟，快速用清水冲净；使用0.6％氨水溶液反蓝，再用清水冲洗数秒；
[0221]
(3)伊红染色：使用85-95％乙醇溶液对石蜡切片进行梯度脱水，放入伊红染色色液中孵育5分钟；
[0222]
(4)脱水封片：制备好的石蜡切片依次放入无水乙醇中静置5min，再在另一新鲜无水乙醇中静置5min，再次一新鲜无水乙醇中静置5min，正丁醇中静置5min，二甲苯中静置5min，再在另一新鲜二甲苯中静置5min至透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，使用中性树胶封片
[0223]
(5)使用image pro plus 6软件对血管直径进行分析，结果如图13至图15所示。
[0224]
如图13至图15所示，相比较对照组，cko组小鼠的血管管腔直径显著增加。
[0225]
因此，通过上述的各实施例可知，可以明显观察到血液中fgf21蛋白质浓度和血管衰老之间存在正相关的关系，依据这一关系可以预测血管衰老的发生或者血管衰老进行评估和诊断、危险分层等。
[0226]
本技术实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
[0227]
(1)本技术实施例提供的一种成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用，通过限定血液中fgf21蛋白水平随血管的增龄而增加，推导出fgf21蛋白浓度和血管的衰老程度呈正相关，并且与反应血管僵硬度的pwv呈正相关性。
[0228]
(2)本技术实施例提供的一种成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用，通过多组实验考察，发现随着血管内皮细胞的衰老，fgf21对衰老细胞的调控作用显著降低，而在小鼠的肝脏中敲除fgf21基因可显著降低小鼠血液中的fgf21水平至基线水平，伴随着高脂饲料喂养下小鼠呈现明显的血管衰老加速的现象，包括衰老和血管衰老指标收缩压和pwv的显著上升以及血管管腔的显著增大，明确了fgf21在抑制血管衰老中的显著作用。
[0229]
(3)本技术实施例提供的一种成纤维细胞生长因子21在血管衰老生物学标志物的应用，一方面，fgf21在衰老的人群血液中浓度上调，且与血管衰老指标pwv呈正相关；另一方面，衰老的血管对fgf21呈现一种抵抗现象，衰老伴随的血液fgf21浓度的上升是一种代偿性的上升，用于部分补偿fgf21对衰老的血管细胞的有益的代谢调节作用的降低。在敲除fgf21表达小鼠模型中，小鼠血液中fgf21浓度显著降低，导致高脂饲料喂养下小鼠呈现明显的血管衰老加速的现象，包括血管衰老指标收缩压和pwv的显著上升以及血管管腔的显著增大，明确了fgf21在抑制血管衰老中的显著作用。因此，fgf21蛋白可作为评估或辅助评
估血管衰老的血液标记物，可以预测血管衰老及相关疾病的发生，对血管衰老进行评估和诊断，危险分层，延缓血管衰老，防治血管衰老相关疾病。
[0230]
本技术的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本技术范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
[0231]
在本技术中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本技术说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a，和/ 或b，和/或c，可以表示单独存在a、b、c中的任意一项，或者同时存在其中任意一项，或者同时存在其中三项。其中a，b，c可以是单个技术特征或者多个技术特征的合集。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b, c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
[0232]
以上所述仅是本技术的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本技术。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。