一种基于特征性肽段的燕窝真伪鉴别方法与流程

1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种基于特征性肽段的燕窝真伪鉴别方法。


背景技术：

2.可食用燕窝一般指是雨燕科金丝燕属的六种鸟类在繁殖过程中分泌出的唾液与羽毛等混合凝结而筑成的巢穴。同时，有雨燕科雨燕属某些鸟类的巢穴也可以作为燕窝。燕窝在我国有悠久的历史，早在唐代就有食用燕窝的记录。直到现在，人们一直将燕窝作为高级保健品食用。
3.从成分上看，燕窝主要含蛋白质、糖类、脂质、一些无机元素、维生素、激素等。有研究分析了燕窝中含有的氨基酸，发现其含有天冬氨酸、谷氨酸等20种常见氨基酸，不含羟脯氨酸和肌氨酸，而含有8种必需氨基酸。燕窝中糖类的含量仅次于蛋白质，主要有唾液酸、甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺等。脂质大约占燕窝的0.14-0.28％，脂肪酸成分有硬脂酸、棕榈酸、亚麻酸、亚油酸等。燕窝中无机元素含量较高，且含有人类所必需的微量元素。研究表明，燕窝中含量较高的元素为四种常量元素ca＞mg＞na＞k，其次为五种必需微量元素fe＞zn＞mn＞cr＞cu。
4.然而，燕窝本身是一个复杂体系，尽管进行了多年的研究，燕窝的物质基础依然不够明确，造假或以次充好的事件时有发生。2011年，我国发生了“血燕”造假导致产生大量亚硝酸盐的食品安全事件，给燕窝行业带来了严重打击，也暴露出燕窝质量和安全性很大程度上无法得到保证的问题。对燕窝的鉴别和质量控制研究也更加重视。而随着各种分析技术以及分子生物学的发展，燕窝的研究也更加深入。
5.目前，研究者针对燕窝的真伪鉴定已经开发了各种各样的方法，利用紫外灯照射、特异性的化学反应能够定性鉴别燕窝。而多种仪器分析技术也可以用于燕窝的鉴别中，比如红外光谱、高效液相色谱等。分子生物学的发展为燕窝研究提供了新的技术，分子生物学技术不仅可以用于分析燕窝本身，还可以识别其物种来源。主要用于燕窝分析的技术有实时荧光pcr和双向电泳。
6.因此，急需开发一种基于特征性肽段的特征肽段的鉴定方法，同时能够区分燕窝及其掺假物。


技术实现要素：

7.为了克服上述技术缺陷，本发明最主要的技术目的是提供一种基于特征性肽段的燕窝真伪鉴别方法，包括以下步骤：
8.(1)蛋白样品的制备：在待检品蛋白中加入尿素混匀后进行冰浴超声，混匀后提取上清液，然后在所述上清液中加入5倍体积的冷乙腈并进行沉淀；随后对沉淀进行离心并弃上清，将所述沉淀用冷乙腈洗涤后用尿素或碳酸氢铵(abc)超声重悬，制备蛋白样品；
9.(2)蛋白烷基化和酶切：用bca试剂盒进行蛋白浓度测定，将提取出的蛋白溶于碳
酸氢铵(abc)中，并进行还原和烷基化；以1:80的比例加入质谱级胰蛋白酶消化4h，补加胰酶至1：50消化24h；然后进行离心后取上清液，将所述上清液过滤膜并取续滤液；
10.(3)燕窝肽段uplc-qtof-ms检测：肽段经acquity uplc beh c18色谱柱分离；流动相a为含0.1％甲酸的水溶液，流动相b为含0.1％甲酸的乙腈；流动相梯度为0-1.5min:5％b；1.5～3min:5％～15％b；3～13min:15％～40％b；13～13.5min:40％～95％b；13.5～16min:95％b；
11.(4)燕窝特征性肽段标准曲线建立：以燕窝原料样本中的各肽段浓度作为标准浓度进行标准曲线的绘制；将各标准曲线溶液从低到高分别进行lc-ms分析，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线；
12.(5)特征性肽段检测：从所述标准曲线读出供试品溶液中相当于多肽em,ll,yp,la,le的量；检验是否检出以下5条特征性肽段序列，若均未被检出，则鉴定待检品不含燕窝成分。
[0013][0014][0015]
进一步地，步骤(1)中提取上清液的步骤为在4℃下以转速15000r/min，离心45min后转移上清液。
[0016]
进一步地，步骤(1)在上清液中加入5倍体积的冷乙腈，在-20℃冰箱沉淀过夜，并在4℃下以8000r/min，离心8min后弃上清。
[0017]
进一步地，步骤(2)中将提取出的蛋白溶于50mm碳酸氢铵(abc)中，使得蛋白浓度为0.6mg/ml。
[0018]
进一步地，步骤(2)中分别加入2μl二硫苏糖醇(dtt)、6μl碘乙酰胺(iaa)、1μl二硫苏糖醇(dtt)反应30min、30min、15min，进行还原和烷基化。
[0019]
进一步地，步骤(3)中的色谱柱分离步骤中流速为0.3ml/min，柱温为35℃。
[0020]
进一步地，步骤(4)中对于燕窝原料及成品，所述5条特征性肽段序列均应被检出，且总含量在蛋白质中应高于1μg/mg。
[0021]
进一步地，步骤(4)中进行标准曲线的绘制时，根据标准浓度c将各肽段的标准品配成0.15625c，0.3125c，0.625c，1.25c，2.5c，5c，10c，20c，40c的溶液，以燕窝原料样本中的各肽段浓度作为标准浓度进行标准曲线的绘制。
[0022]
本发明采用上述的技术方案，基于蛋白质组学技术，利用胶内酶切方法鉴定了不同分子量的燕窝蛋白和肽段，选取特征性肽段对燕窝真伪进行鉴别，具有很高的准确性。
附图说明
[0023]
图1是基于uplc-qtof-ms检测的燕窝特征性肽段的总离子流图及提取离子流图；
[0024]
图2为本发明基于特征性肽段的燕窝真伪鉴别方法流程；
[0025]
图3是5条燕窝特征性肽段的标准曲线；
[0026]
图4是5条燕窝特征性肽段的提取离子流图；
[0027]
图5是干燕窝原料y1-y16中5条特征性肽段检测结果；
[0028]
图6是炖煮燕窝产品c1、c2、j1-j4中5条特征性肽段检测结果。
具体实施方式
[0029]
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0030]
为筛选合适的特征性肽段，确定肽段筛选的标准为：
①
长度较短。较短的肽段可能具有更好的稳定性。
②
没有漏切。胰蛋白酶会在精氨酸和赖氨酸的c端将蛋白酶解成肽段，这个过程中如果出现漏切会导致肽段的真实含量发生变化。
③
翻译后修饰较少。蛋白酶切时会加入碘乙酰胺进行烷基化以提高酶切效率，这样会使得半胱氨酸上带有修饰而影响分析。因此，尽量选择没有半胱氨酸的肽段。
④
肽段来自多个不同蛋白，保证了肽段来源的丰富性。
[0031]
按照上述标准可以从燕窝的全部特征性肽段中筛选出了8条肽段进行后续的定性及定量研究，这8条肽段分别为yedlaqr(seq id no.1),yplittlk(seq id no.2),legavieltr(seq id no.3),lanwpyghr(seq id no.4),llvgfptygr(seq id no.5),fssqihnngr(seq id no.6),slsepdvtcstk(seq id no.7),emmvaafeqear(seq id no.8)。然后随机随机混合了三种燕窝样品并对上述7条肽段进行检测，如图1所示，有5条肽段具有明显的信号峰，这5条窝燕窝特征性肽段信息如表1所示，下面以这5条肽段作为对燕窝进行真伪鉴别的特征性鉴别。
[0032]
表1燕窝中5种特征性肽段信息
[0033][0034]
基于以上研究结果，本实施例提出的特征性肽段的燕窝真伪鉴别方法流程如图3所示，具体步骤如下：
[0035]
准备干燕窝原料样本(y1-y16)、炖煮燕窝成品(c1,c2,j1-j4)及掺假物大豆蛋白(w1)蛋清(w2)、明胶(w3)、银耳(w4)、鱼鳔(w5)、猪皮(w6)。具体按照以下步骤进行真伪鉴别。
[0036]
(1)蛋白提取：将样品在液氮中研磨成干粉，称取0.15～0.2g，加5ml 8m尿素混匀
后冰浴超声(80％，6轮*8下)；或称取称炖煮燕窝产品1.5-2g，加4ml 8m尿素混匀，冰浴超声(80％，8轮*8下)，混匀后取出1ml至ep管。在4℃下以转速15000r/min，离心45min，转移上清液至新ep管。在上清液中加入5倍体积的冷乙腈，在-20℃冰箱沉淀过夜。在4℃下以8000r/min，离心8min，弃上清。沉淀用冷乙腈洗涤1次，用8m尿素或50mm碳酸氢铵(abc)超声重悬(40％，3轮*7下)。
[0037]
(2)提取蛋白质酶切：用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。对于各500ul样品，使蛋白浓度在0.6mg/ml左右(溶于50mm abc)；分别加入2μl二硫苏糖醇(dtt)、6μl碘乙酰胺(iaa)、1μl二硫苏糖醇(dtt)(均为1m)反应30、30、15min，进行还原和烷基化；以1:80的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入质谱级胰蛋白酶消化4h，补加胰酶至1：50消化24h；15000rpm离心30分钟，取上清液。上样前再次以同样条件离心，再取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液至样品瓶。
[0038]
(3)燕窝肽段超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(uplc-qtof-ms)检测：色谱条件：肽段经acquity uplc beh c18(2.1mm
×
100mm，1.7um)色谱柱分离。流动相a为含0.1％甲酸的水溶液，流动相b为含0.1％甲酸的乙腈。流速为0.3ml/min，柱温为35℃。流动相梯度为0-1.5min:5％b；1.5～3min:5％～15％b；3～13min:15％～40％b；13～13.5min:40％～95％b；13.5～16min:95％b。上样量为2μl。
[0039]
质谱数据通过安捷伦6560q-tof质谱采集。数据收集由masshunter b.08软件控制。正离子模式下质谱参数为：气体温度(gas tempreture)225℃,干气体(drying gas)10l/min，喷雾器(nebulizer)25psi，鞘气温度(sheath gas tempreture)400℃,鞘气流量(sheath gas flow)12l/min，vcap 3500v，喷嘴电压(nozzle voltage)500v，碎裂电压(fragmentorvoltage)400v,扫描范围为20-1700m/z。
[0040]
(4)燕窝特征性肽段标准曲线建立及方法学验证：以燕窝原料样本中的各肽段浓度作为标准浓度c，将各肽段的标准品配成0.15625c、0.3125c、0.625c、1.25c、2.5c、5c、10c、20c、40c的溶液进行标准曲线的绘制。将各标准曲线溶液从低到高分别进行液相色谱-质谱联用仪(lc-ms)分析，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线，如图2所示。向燕窝原料样本中分别加入0.5c、c和2c浓度的肽段标准品进行回收率验证。
[0041]
为了进行定量分析，对这5条肽段的线性和方法学进行了验证，结果如表2所示，它们的线性系数r2分别为0.9950，0.9954，0.9997，0.9972，0.9990，显示出了良好的线性。另外，分别对这5条肽段的检测限、定量限、重复性及回收率做了验证。图4是5条燕窝特征性肽段的提取离子流图，从中可以到这5条肽段具有明显区别于各掺假物的特征峰。结果表明，这5条肽段均可以作为燕窝特征性肽段进行定量研究。
[0042]
表2特征性肽段的方法学验证
[0043][0044]
(5)燕窝及其制品测定：按照上述检测方法对干燕窝原料样本(y1-y16)及炖煮燕窝成品(c1,c2,j1-j4)进行测定，测定结果分别如图5和图6所示。从标准曲线读出样品中相
当于多肽em、ll、yp、la、le的量，计算即得。
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对于燕窝原料及成品，若表1中的5条肽段均未被检出，则样品不含燕窝成分。对于燕窝原料及成品，5条肽段均应被检出，且总含量在蛋白质中应高于1μg/mg(0.1％)，否则认为不合格。对于燕窝成品，原溶液中5条肽段总含量在8-10ug/ml或以上可视为质量较高。
[0046]
本发明基于蛋白质组学技术，利用胶内酶切方法鉴定了不同分子量的燕窝蛋白和肽段，选取特征性肽段对燕窝真伪进行鉴别，具有很高的准确性。
[0047]
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本技术的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。