血型反定型和血型抗体滴度POCT检测卡及其制备方法与应用与流程

血型反定型和血型抗体滴度poct检测卡及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及血液检测技术领域，具体涉及一种血型反定型和血型抗体滴度poct检测卡及其制备方法与应用。


背景技术：

2.血型鉴定的原理是基于抗原-抗体反应产生的细胞凝集。使用血型定型试剂检测红细胞表面抗原称为正定型方法；相反使用红细胞表面抗原检测血清中的相应抗体则称之为反定型方法。对于应急采血来说，首当其冲需要解决的检验难题即为血型鉴定。战现场便携可靠的血型鉴定技术与产品是应急采血和血液供应的基础。但血型鉴定需要使用的抗血清和反定型用标准红细胞均需要低温保存，尤其是标准红细胞在保存中易发生溶血，保存期短，这些特点导致血型鉴定成为严重灾难或战争情况下采供血保障的难点之一，因此，必须研发血型鉴定用抗血清或标准红细胞常温保存、且结果易于判读的快速血型鉴定技术。
3.其次，在医疗机构中，目前有两种新鲜全血可用：其一是来自流动血库的新鲜全血；其次是献血中心提供的低温低滴度o型全血(low titer group o whole blood,ltowb)。新鲜全血最好从预先经过筛选的低滴度o型献血者体内抽取，且首先应使用全血治疗失血性休克，其次，无论在哪一级救治机构，ltowb都是治疗失血性休克伤员的首选血液制品。根据中国国家军用标准要求，通用型全血，即血浆抗a和抗b抗体滴度小于1:128的o型全血。由于血浆中的抗a和抗b igm抗体滴度会随着时间而变化，因此“流动血库”中o型血的入库人员还应定期筛查血浆中抗a和抗b igm抗体滴度，理想情况下推荐每3个月筛查一次。但近期的一项研究报道表明，血浆抗a和抗b igm抗体滴度水平波动较大，无规律可循。有21％的低抗体滴度o型血献血源3个月后转变为变为高抗体滴度，而62％的高抗体滴度o型血献血者抗体滴度降低，成为可以提供通用型全血的人员。因此，在现场应急采血前及“流动血库”献血后对血液进行抗体滴度检测，可以更有效避免血型抗体造成的急性溶血性输血反应的发生。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种血型反定型和血型抗体滴度poct检测卡及其制备方法与应用，本发明的检测卡可常温保存，无需冷藏，保存期限为6个月，且不易发生微生物污染及溶血现象，所述检测卡基于渗滤法进行血型反定型和抗体滴度检测，血型检测结果准确率高，抗体滴度检测滴度可达到1:8，无液体医疗废物产生，检测更加安全。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种血型反定型和抗体滴度的检测卡，所述检测卡包括反应区，所述反应区包括保存液包被的红细胞膜修饰的荧光微球；
7.所述保存液包括以下含量比例的成分：
8.na2hpo
4 10～14g、tris 3.4～3.8g、bsa 8～12g、果糖18～22g、pvp-40 0.8～1.2g、hcl 1.2～1.4ml、nan
3 0.02～0.03g、酪蛋白6～10g、nacl 0.8～0.9g、peg-25 4～
6g。
9.优选地，所述红细胞膜修饰的荧光微球的制备方法，包括以下步骤：
10.将荧光微球用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化，加入红细胞膜和保存液，混匀后即得红细胞膜修饰的荧光微球。
11.优选地，所述检测卡还包括渗滤区，所述渗滤区依次搭接有吸水纸、导水纸、渗滤膜和挡板。
12.优选地，所述红细胞膜修饰的荧光微球包括a型、b型、o型红细胞膜修饰荧光微球中的一种或多种。
13.优选地，所述检测卡包括2个以上反应区。
14.进一步优选地，当检测卡对血型反定型检测时，所述检测卡有2～4个反应区，所述2～4个反应区为含有红细胞膜修饰荧光微球的反应孔1和质控反应孔1；
15.当检测卡对抗体滴度检测时，所述检测卡有2～4个反应区，所述2～4个反应区为含有红细胞膜修饰荧光微球的反应孔2和质控反应孔2；
16.当检测卡同时对血型反定型和抗体滴度检测时，所述检测卡有4～8个反应区，所述4～8个反应区为含有红细胞膜修饰荧光微球的反应孔1、质控反应孔1、红细胞膜修饰荧光微球的反应孔2和质控反应孔2；
17.所述红细胞膜修饰荧光微球的反应孔1含有a型、b型和o型红细胞膜修饰荧光微球的反应孔的一种或多种，所述质控反应孔1为荧光微球反应孔；
18.所述红细胞膜修饰荧光微球的反应孔2含有a型和/或b型红细胞膜修饰荧光微球的反应孔，所述质控反应孔2为已知抗体滴度红细胞膜修饰荧光微球的反应孔。
19.优选地，所述红细胞膜的制备方法包括：将红细胞用裂解液裂解，洗涤后，即得红细胞膜。
20.本发明还提供了一种上述检测卡的制备方法，包括以下步骤：
21.将保存液涂覆在反应孔内，烘干，然后分别将所述红细胞膜修饰荧光微球涂覆在反应孔内，烘干，即得处理后的反应孔；
22.将吸水纸、导水纸、渗滤膜、挡板依次搭接在下壳体上，连接含有处理后的反应孔的上壳体，即得检测卡。
23.优选地，所述保存液含量为40～60μl；涂覆红细胞膜修饰荧光微球的含量为10～20μl；所述的烘干温度为50～60℃。
24.本发明还提供了一种使用上述试纸条检测血型反定型和抗体滴度的方法，包括以下步骤：
25.取待测血浆滴加于反应孔内，待20～40s红细胞膜修饰的荧光微球复溶后，混匀2～3min后进行检测。
26.优选地，上述步骤还包括抽出挡板，冲洗干净反应孔内液体后进行检测。
27.本发明的有益效果如下：
28.本发明的血型反定型和抗体滴度检测卡及其制备方法与检测方法，所述检测卡的反应区包括保存液包被的红细胞膜修饰的荧光微球，本发明使用红细胞膜修饰的荧光微球代替标准红细胞作为血型抗体滴度的检测试剂，可常温保存，无需冷藏，保存期限为6个月，且不易发生微生物污染及溶血现象。本发明的检测卡对血型抗体进行定量或半定量检测，
检测时间短，检测结果准确可靠。本发明的检测卡对抗体滴度检测时，检测灵敏度高。
29.本发明的检测方法更快速，操作简便快捷，无需借助离心设备或者借助玻片，整个反应及检测体系在一个检测中即可完成，且适用环境更加广泛，无液体医疗废物产生，检测更加安全。
附图说明
30.图1为血型反定型和抗体滴度检测卡原理及方法示意图；
31.图2为血型反定型判读结果图，a为血型反定型判读方式示意图，b为代表性样本实物图；
32.图3为血型抗体滴度荧光手电照射时判读结果图；
33.图4为igm抗a抗体在1：8～1：256抗体滴度下拟合的标准曲线及计算公式。
具体实施方式
34.本发明提供了一种血型反定型和抗体滴度的检测卡，所述检测卡包括反应区，所述反应区包括保存液包被的红细胞膜修饰的荧光微球；
35.所述保存液包括以下含量成分：
36.na2hpo
4 10～14g、tris 3.4～3.8g、bsa 8～12g、果糖18～22g、pvp-40 0.8～1.2g、hcl 1.2～1.4ml、nan
3 0.02～0.03g、酪蛋白6～10g、nacl 0.8～0.9g、peg-25 4～6g。
37.在本发明中，所述检测卡由上壳体、反应区、渗滤区、下壳体四部分构成，所述反应区包括反应孔和渗滤孔，所述渗滤区包含吸水纸、导水纸、渗滤膜、挡板。作为一优选的实施方式，所述的上壳体或下壳体的材质优选包括ps、abs或pet塑料，所述的上壳体或下壳体的尺寸可为长6.0cm、宽3.0cm、高0.3cm；所述反应区优选地包括2个以上反应区，如2、3、4、5、6、7、8个反应区，所述反应孔优选为椭圆浅底状凹槽，所述反应孔的材质优选包括ps、abs或pet塑料；所述反应孔的直径大于渗滤孔，作为一可选的实施方式，所述反应孔直径为1.5cm，渗滤孔直径为0.3cm；所述渗滤区优选地包括2个以上渗滤试纸条，如2、3、4、5、6、7、8个渗滤试纸条；所述渗滤试纸条与反应区的个数相同；作为一优选的实施方式，所述渗滤区依次搭接有吸水纸、导水纸、渗滤膜和挡板，所述吸水纸的材质优选为棉浆纸，所述吸水纸的尺寸可选为长2.7cm、宽0.4cm，本发明的吸水纸具有吸去多余的液体的作用；所述导水纸材质为导水性和亲水性的多孔高分子材料，优选地如玻璃纤维，所述导水纸的尺寸可选为长1.0cm、宽0.4cm，本发明的导水纸是使渗滤下去的荧光到吸水纸上去，避免这些荧光对实验结果的干扰；所述渗滤膜材质为亲水性、耐酸碱、绝对孔径的有机高分子材料和无机材料，优选如pe/pp膜、尼龙膜，所述渗滤膜的尺寸可为长1.0cm、宽0.4cm，所述的渗滤膜具有过滤掉未凝集的红细胞膜标记的荧光微球的作用；本发明挡板的材质为疏水性材料，优选聚四氟乙烯，本发明的挡板的尺寸可为长4.0cm、宽0.4cm，本发明的挡板起到阻拦反应区和渗滤区的目的。
38.在本发明中，所述检测卡优选地包括2个以上反应区；作为一优选的实施方式，当检测卡对血型反定型检测时，所述检测卡有2～4个反应区，所述2～4个反应区为含有红细胞膜修饰荧光微球的反应孔1和质控反应孔1。作为一优选的实施方式，当检测卡对抗体滴
度检测时，所述检测卡有2～4个反应区，所述2～4个反应区为含有红细胞膜修饰荧光微球的反应孔2和质控反应孔2。作为一优选的实施方式，当检测卡同时对血型反定型和抗体滴度检测时，所述检测卡有4～8个反应区，所述4～8个反应区为含有红细胞膜修饰荧光微球的反应孔1、质控反应孔1、红细胞膜修饰荧光微球的反应孔2和质控反应孔2。其中，所述红细胞膜修饰荧光微球的反应孔1优选含有a型、b型和o型红细胞膜修饰荧光微球的反应孔的一种或多种，所述质控反应孔1为荧光微球反应孔。所述红细胞膜修饰荧光微球的反应孔2含有a型和/或b型红细胞膜修饰荧光微球的反应孔，所述质控反应孔2为已知抗体滴度红细胞膜修饰荧光微球的反应孔，如已知抗a抗体滴度红细胞膜修饰荧光微球的反应孔和已知抗b抗体滴度红细胞膜修饰荧光微球的反应孔中的一种或两种。
39.在本发明中，所述红细胞膜修饰的荧光微球的制备方法，优选地包括以下步骤：将荧光微球用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化，加入红细胞膜和保存液，混匀后即得红细胞膜修饰的荧光微球。
40.在本发明中，所述的荧光微球可选为聚苯乙烯荧光微球、aie荧光微球、量子点荧光微球、时间分辨荧光微球中的一种，所述荧光微球：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：红细胞膜的体积比优选1：20：100；所述红细胞膜与保存液的体积比优选为1：10。在本发明中，所述红细胞膜的制备方法优选地包括：将红细胞用裂解液裂解，洗涤后，即得红细胞膜，其中，所述裂解液优选为十二烷基磺酸钠、氯化钙或曲拉通，所述红细胞与裂解液的体积比优选为1:0.8～1.2。在本发明中，所述红细胞膜修饰的荧光微球优选地包括a型、b型、o型红细胞膜修饰荧光微球中的一种或多种。
41.本发明还提供了一种上述检测卡的制备方法，包括以下步骤：
42.将保存液涂覆在反应孔内，烘干，然后分别将红细胞膜修饰荧光微球涂覆在反应孔内，烘干，即得处理后的反应孔；将吸水纸、导水纸、渗滤膜、挡板依次搭接在下壳体上，连接含有处理后的反应孔的上壳体，即得检测卡。本发明制得的检测卡的卡壳设计界面简洁、结构简单、四层搭接、上下壳体间通过挡板将反应区和渗滤区分开，各自行使其功能区功能。
43.在本发明中，将保存液涂覆在反应孔内，烘干。所述保存液含量优选为40～60μl，进一步优选为45～55μl；所述烘干的温度优选为50～60℃，进一步优选为54～58℃。
44.在本发明中，烘干后，分别将红细胞膜修饰荧光微球涂覆在反应孔内，烘干，即得处理后的反应孔。在本发明中，涂覆红细胞膜修饰荧光微球的含量优选为10～20μl，进一步优选为12～18μl。所述烘干的温度优选为50～60℃，进一步优选为54～58℃。本发明红细胞膜修饰的荧光微球可以为a型、b型、o型红细胞膜修饰的荧光微球，烘干后复溶仍有良好的血型抗原活性，从而使滴度检测从液相反应转移至固相载体中发生。
45.本发明还提供了一种使用上述检测卡检测全血抗体滴度的方法，包括以下步骤：
46.取待测血浆滴加于反应孔内，待20～40s红细胞膜修饰的荧光微球复溶后，混匀2～3min后进行检测。
47.在本发明中，取待测血浆滴加于反应孔内，所述血浆含量优选为30～50μl，进一步优选为35～45μl。在本发明中，待20～40s红细胞膜修饰的荧光微球复溶后，混匀2～3min，所述混匀采用上下左右颠倒的方式进行。在本发明中，为了让反应区的液体转移到渗漏区，上述步骤还优选地包括抽出挡板，冲洗干净反应孔内液体后进行检测。本发明中，优选地采
用生理盐水冲洗反应孔内液体。本发明中，反应区的液体转移到渗漏区，还可以使用翻转法等方式。本发明中，在结果判读时，也可以使用反应区图像识别，浊度判读等方式，优选地采用荧光仪读取渗滤膜上是否存在荧光的方式进行判读。
48.本发明的检测方法，首先将检测试剂冻干于反应区表面，加入待测样本，发生抗原抗体反应后，通过一个渗滤装置，使得凝集物质留在滤纸表面，未凝集物质穿过滤纸到达吸水纸上，将阳性反应和阴性反应区分，且实现了干式—湿式—干式的转变，无液体废物产生，减少污染，结果可长期保存，判读也更加方便。
49.在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
50.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
51.实施例1
52.一种血型反定型和抗体滴度的检测卡，该检测卡包括上壳体、反应区、渗滤区、下壳体四部分，其中反应区包括反应孔和渗滤孔；渗滤区包括吸水纸、导水纸、渗滤膜、挡板，反应区含有a型、b型和o型红细胞膜修饰荧光微球和荧光微球四个反应孔，渗滤区对应包括四个渗滤试纸条；
53.所述的上壳体或下壳体的材质为ps塑料，长6.0cm、宽3.0cm、高0.3cm。所述反应孔为椭圆浅底状凹槽，材质为ps塑料，直径1.5cm；所述渗滤孔22直径为0.3cm；所述吸水纸材质为棉浆纸，长2.7cm、宽0.4cm；所述导水纸32材质为玻璃纤维，长1.0cm、宽0.4cm；所述渗滤膜33材质为尼龙膜，长1.0cm、宽0.4cm；所述挡板材质为聚四氟乙烯，长4.0cm、宽0.4cm。
54.上述检测卡的制备方法，包括以下步骤：
55.(1)取3份以上人新鲜全血混合后，3000rpm离心5分钟，弃去上清，然后使用pbs或生理盐水将红细胞洗涤2～3遍，收集红细胞；
56.(2)将体积比为1:1的红细胞与质量分数为5％十二烷基磺酸钠溶液混合裂解，混匀后静置30分钟，10000rpm离心5分钟，弃去上清，然后加入在裂解后的红细胞中加入超纯水洗涤，其中裂解后的红细胞与超纯水的体积比1:3，混匀后，10000rpm离心5分钟，重复以上洗涤步骤3～4遍，直至上清无色透明为止，收集沉淀即为红细胞膜；
57.(3)取0.1ml聚苯乙烯荧光微球与10ml超纯水，8000rpm离心5分钟，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)将聚苯乙烯荧光微球进行活化，之后加入上述4ml红细胞膜，10000rpm离心5分钟，弃去上清，最后加入10ml保存液，混匀后即为红细胞膜修饰的聚苯乙烯荧光微球；其中所述的保存液为1000ml水中加入na2hpo
4 12g、tris 3.6g、bsa 10g、果糖20g、pvp-40 1g、hcl 1.34ml、nan
3 0.025g、酪蛋白8g、nacl 0.85g、peg-25 5g混匀后即可制得；
58.(4)取保存液50μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，然后加入上述制好的a型、b型、o型红细胞膜修饰荧光微球、荧光微球各15μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，即得处理后的反应孔；
59.(5)将下壳体在最底层，吸水纸放于下壳体上，玻璃纤维搭接于吸水纸上方，渗滤
膜搭接于玻璃纤维上方，使用热熔胶固定边缘，然后将挡板搭接于渗滤膜上方，连接含有处理后的反应孔的上壳体，即得检测卡。
60.上述检测卡的检测方法，包括以下步骤：
61.1)取待测血浆40μl滴加于反应孔内，等待30s使红细胞膜修饰的聚苯乙烯荧光微球充分复溶，上下左右颠倒混匀2.5分钟使抗原抗体充分反应，将挡板快速抽出使反应孔内液体经渗滤孔留至渗滤膜上，滴加生理盐水3滴将反应孔内液体冲洗干净；
62.2)使用荧光仪读取渗滤膜上是否存在荧光，进行结果判读。
63.其中，血型反定型结果判读方式和代表性样本实物图检测结果见图2。
64.实施例2
65.一种血型反定型和抗体滴度的检测卡，该检测卡包括上壳体、反应区、渗滤区、下壳体四部分，其中反应区包括反应孔和渗滤孔；渗滤区包括吸水纸、导水纸、渗滤膜、挡板，反应区含有a型、b型和o型红细胞膜修饰荧光微球和荧光微球四个反应孔，渗滤区对应包括四个渗滤试纸条；
66.所述的上壳体或下壳体的材质为abs塑料，长6.0cm、宽3.0cm、高0.3cm。所述反应孔为椭圆浅底状凹槽，材质为abs塑料，直径1.5cm；所述渗滤孔直径为0.3cm；所述吸水纸材质为棉浆纸，长2.7cm、宽0.4cm；所述导水纸材质为玻璃纤维，长1.0cm、宽0.4cm；所述渗滤膜33材质为pe膜，长1.0cm、宽0.4cm；所述挡板材质为聚四氟乙烯，长4.0cm、宽0.4cm。
67.上述检测卡的制备方法，包括以下步骤：
68.(1)取3份以上人新鲜全血混合后，3000rpm离心5分钟，弃去上清，然后使用pbs或生理盐水将红细胞洗涤2～3遍，收集红细胞；
69.(2)将体积比为1:1的红细胞与质量分数为10％氯化钙溶液混合裂解，混匀后静置30分钟，10000rpm离心5分钟，弃去上清，然后加入在裂解后的红细胞中加入超纯水洗涤，其中裂解后的红细胞与超纯水的体积比1:3，混匀后，10000rpm离心5分钟，重复以上洗涤步骤3～4遍，直至上清无色透明为止，收集沉淀即为红细胞膜；
70.(3)取0.1ml量子点荧光微球与10ml超纯水，8000rpm离心5分钟，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)将量子点荧光微球进行活化，之后加入上述4ml红细胞膜，10000rpm离心5分钟，弃去上清，最后加入10ml保存液，混匀后即为红细胞膜修饰的量子点荧光微球；其中所述的保存液为1000ml水中加入na2hpo
4 14g、tris 3.4g、bsa 8g、果糖22g、pvp-40 1.2g、hcl 1.2ml、nan
3 0.02g、酪蛋白10g、nacl 0.8g、peg-25 6g混匀后即可制得；
71.(4)取保存液40μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，然后加入上述制好的a型、b型、o型红细胞膜修饰量子点荧光微球、荧光微球各10μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，即得处理后的反应孔；
72.(5)将下壳体在最底层，吸水纸放于下壳体上，玻璃纤维搭接于吸水纸上方，渗滤膜搭接于玻璃纤维上方，使用热熔胶固定边缘，然后将挡板搭接于渗滤膜上方，连接含有处理后的反应孔的上壳体，即得检测卡。
73.上述检测卡的检测方法，包括以下步骤：
74.1)取待测血浆30μl滴加于反应孔内，等待40s使红细胞膜修饰的聚苯乙烯荧光微球充分复溶，上下左右颠倒混匀3分钟使抗原抗体充分反应，将挡板快速抽出使反应孔内液
体经渗滤孔留至渗滤膜上，滴加生理盐水3滴将反应孔内液体冲洗干净；
75.2)使用荧光仪读取渗滤膜上是否存在荧光，进行结果判读。
76.实施例3
77.一种血型反定型和抗体滴度的检测卡，该试纸条包括上壳体、反应区、渗滤区、下壳体四部分，其中反应区包括反应孔和渗滤孔22；渗滤区包括吸水纸、导水纸、渗滤膜、挡板，反应区含有a型、b型和已知抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球三个反应孔，渗滤区对应包括三个渗滤试纸条；
78.所述的上壳体或下壳体的材质为pet塑料，长6.0cm、宽3.0cm、高0.3cm。所述反应孔为椭圆浅底状凹槽，材质为pet塑料，直径1.5cm；所述渗滤孔直径为0.3cm；所述吸水纸材质为棉浆纸，长2.7cm、宽0.4cm；所述导水纸材质为玻璃纤维，长1.0cm、宽0.4cm；所述渗滤膜材质为pp膜，长1.0cm、宽0.4cm；所述挡板材质为聚四氟乙烯，长4.0cm、宽0.4cm。
79.上述检测卡的制备方法，包括以下步骤：
80.(1)取3份以上人新鲜全血混合后，3000rpm离心5分钟，弃去上清，然后使用pbs或生理盐水将红细胞洗涤2～3遍，收集红细胞；
81.(2)将体积比为1:1的红细胞与质量分数为1％曲拉通溶液混合裂解，混匀后静置30分钟，10000rpm离心5分钟，弃去上清，然后加入在裂解后的红细胞中加入超纯水洗涤，其中裂解后的红细胞与超纯水的体积比1:3，混匀后，10000rpm离心5分钟，重复以上洗涤步骤3～4遍，直至上清无色透明为止，收集沉淀即为红细胞膜；
82.(3)取0.1ml时间分辨荧光微球与10ml超纯水，8000rpm离心5分钟，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)将时间分辨荧光微球进行活化，之后加入上述1ml红细胞膜，10000rpm离心5分钟，弃去上清，最后加入10ml保存液，混匀后即为红细胞膜修饰的时间分辨荧光微球；其中所述的保存液为1000ml水中加入na2hpo
4 10g、tris 3.8g、bsa 12g、果糖18g、pvp-40 0.8g、hcl 1.4ml、nan
3 0.03g、酪蛋白6g、nacl 0.9g、peg-25 4g混匀后即可制得；
83.(4)取保存液60μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，然后加入上述制好的a型、b型红细胞膜修饰时间分辨荧光微球、已知抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球各20μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，即得处理后的反应孔；
84.(5)将下壳体在最底层，吸水纸放于下壳体上，玻璃纤维搭接于吸水纸上方，渗滤膜搭接于玻璃纤维上方，使用热熔胶固定边缘，然后将挡板搭接于渗滤膜上方，连接含有处理后的反应孔的上壳体，即得试纸条；
85.上述检测卡的检测方法，包括以下步骤：
86.1)取待测血浆50μl滴加于反应孔内，等待20s使红细胞膜修饰的聚苯乙烯荧光微球充分复溶，上下左右颠倒混匀3分钟使抗原抗体充分反应，将挡板快速抽出使反应孔内液体经渗滤孔留至渗滤膜上，滴加生理盐水3滴将反应孔内液体冲洗干净；
87.2)使用荧光仪读取渗滤膜上是否存在荧光，进行结果判读。
88.实施例4
89.一种血型反定型和抗体滴度的检测卡，该检测卡包括上壳体、反应区、渗滤区、下壳体四部分，其中反应区包括反应孔和渗滤孔；渗滤区包括吸水纸、导水纸、渗滤膜、挡板，反应区含有a型、b型红细胞膜修饰荧光微球、已知抗a抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球、
抗b抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球四个反应孔，渗滤区对应包括四个渗滤试纸条；
90.所述的上壳体或下壳体的材质为ps塑料，长6.0cm、宽3.0cm、高0.3cm。所述反应孔为椭圆浅底状凹槽，材质为ps塑料，直径1.5cm；所述渗滤孔22直径为0.3cm；所述吸水纸材质为棉浆纸，长2.7cm、宽0.4cm；所述导水纸32材质为玻璃纤维，长1.0cm、宽0.4cm；所述渗滤膜33材质为尼龙膜，长1.0cm、宽0.4cm；所述挡板材质为聚四氟乙烯，长4.0cm、宽0.4cm。
91.上述检测卡的制备方法，包括以下步骤：
92.(1)取3份以上人新鲜全血混合后，3000rpm离心5分钟，弃去上清，然后使用pbs或生理盐水将红细胞洗涤2～3遍，收集红细胞；
93.(2)将体积比为1:1的红细胞与质量分数为5％十二烷基磺酸钠溶液混合裂解，混匀后静置30分钟，10000rpm离心5分钟，弃去上清，然后加入在裂解后的红细胞中加入超纯水洗涤，其中裂解后的红细胞与超纯水的体积比1:3，混匀后，10000rpm离心5分钟，重复以上洗涤步骤3～4遍，直至上清无色透明为止，收集沉淀即为红细胞膜；
94.(3)取0.1ml聚苯乙烯荧光微球与10ml超纯水，8000rpm离心5分钟，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)将聚苯乙烯荧光微球进行活化，之后加入上述4ml红细胞膜，10000rpm离心5分钟，弃去上清，最后加入10ml保存液，混匀后即为红细胞膜修饰的聚苯乙烯荧光微球；其中所述的保存液为1000ml水中加入na2hpo
4 12g、tris 3.6g、bsa 10g、果糖20g、pvp-40 1g、hcl 1.34ml、nan
3 0.025g、酪蛋白8g、nacl 0.85g、peg-25 5g混匀后即可制得；
95.(4)取保存液50μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，然后加入上述制好的a型、b型红细胞膜修饰荧光微球、已知抗a抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球、抗b抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球各20μl均匀涂覆于反应孔内，置于56℃烘箱烘干，即得处理后的反应孔；
96.(5)将下壳体在最底层，吸水纸放于下壳体上，玻璃纤维搭接于吸水纸上方，渗滤膜搭接于玻璃纤维上方，使用热熔胶固定边缘，然后将挡板搭接于渗滤膜上方，连接含有处理后的反应孔的上壳体，即得检测卡。
97.上述检测卡的检测方法，包括以下步骤：
98.1)取待测血浆40μl滴加于反应孔内，等待30s使红细胞膜修饰的聚苯乙烯荧光微球充分复溶，上下左右颠倒混匀2.5分钟使抗原抗体充分反应，将挡板快速抽出使反应孔内液体经渗滤孔留至渗滤膜上，滴加生理盐水3滴将反应孔内液体冲洗干净；
99.2)使用荧光仪读取渗滤膜上是否存在荧光，进行结果判读。
100.实施例5
101.本实施例与实施例1的不同之处在于：反应区含有a型、b型、o型红细胞膜修饰荧光微球、荧光微球、a型、b型红细胞膜修饰荧光微球、已知抗a抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球、已知抗b抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球八个反应孔，渗滤区对应包括八个渗滤试纸条；步骤(4)加入上述制好的a型、b型、o型红细胞膜修饰荧光微球、荧光微球、a型、b型红细胞膜修饰荧光微球、已知抗a抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球、已知抗b抗体滴度的红细胞膜修饰荧光微球各20μl均匀涂覆于反应孔内，其余操作相同。
102.试验例1
103.将512例临床样本用实施例1检测方法和采用经典方法(试管法)进行全血血型反
定型检测，检测结果见表1
104.表1实施例1检测卡和经典法的血型检测结果
[0105][0106]
表1结果表明，本发明的检测卡和经典法检测得到结果一致，符合率达100％，表明本发明的检测卡适用于全血血型反定型检测，检测结果准确度高。
[0107]
试验例2
[0108]
将滴度为256的igm抗a标准品进行倍比稀释，依次稀释为1：128、1：64、1：32、1：16、1：8、1：4、1：2、1：1，分别取50μl加入涂覆于有20μla膜反应孔中，然后用实施例4所述的检测方法检测，检测结果如图3所示和表2所示。
[0109]
表2血型抗体滴度荧光仪判读结果
[0110][0111][0112]
由图3和表2表明血型抗体滴度越高，检测荧光值越强。
[0113]
由图4表明，血型抗体滴度与荧光值在1:8～1:256之间存在线性相关关系，相关系数r＝0.97，且该检测卡最低检测限为1:8。
[0114]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。