一种UPLC同时检测柑橘中10种呋喃香豆素的方法

一种uplc同时检测柑橘中10种呋喃香豆素的方法
技术领域
1.本发明涉及食品技术领域，具体来说，涉及一种uplc同时检测柑橘中10种呋喃香豆素的方法。


背景技术：

2.呋喃香豆素是自然界中广泛存在的次级代谢产物，由一系列由呋喃环连接香豆素组成的化合物组成，是由香豆素母核的7位羟基与6位或8位取代的异戊烯基缩合形成呋喃环的一类化合物及其衍生物的总称。呋喃香豆素类通常存在于高等植物中，主要分布在芸香科、桑科、豆科和芹菜科四个高等植物科。
3.目前，呋喃香豆素的检测方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法、液质联用法等。紫外分光光度法操作简便，但测定的是样品中呋喃香豆素的总量，且测量结果极易受样品中其他有较强紫外吸收物质的干扰。hplc是分析复杂样品中呋喃香豆素类成分的常用方法，但由于这类样品基质复杂，干扰多，而常规hplc的分离时间较长，且分离能力有限，容易产生误判。液质联用仪器设备则较为昂贵，操作维护复杂。
4.超高效液相色谱(uplc)是近年来液相色谱发展的新方向之一，它采用亚2 μm填料，使分离效能、峰容量和分析速度均有大幅度提高。李贵节等（李贵节, 谭祥, 王华,等. hplc-dad-fld同时测定柑橘果汁中12种多甲氧基黄酮和香豆素类物质[j]. 食品科学, 2017, 38(20):7.）建立了hplc-dad-fld能同时检测出柑橘果汁中佛手柑素、佛手柑内酯、环氧佛手柑素、佛手酚4种呋喃香豆素的方法，采用的柱子是thermo scientific hypurity c18 (4.6
×
150 mm，3
ꢀµ
m)，但柑橘中的呋喃香豆素种类多且结构复杂，远不止以上四种。赵喜娟等（zhao x j , guo p m , pang w h , et al. a rapid uhplc-qqq-ms/ms method for the simultaneous qualitation and quantitation of coumarins, furocoumarins, flavonoids, phenolic acids in pummelo fruits[j]. food chemistry, 2020, 325:126835.）建立了一种uhplc-qqq-ms/ms方法，用于同时测定柚子中包括花椒毒内酯、补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素在内的8种呋喃香豆素，采用的柱子是waters acquity uplc hss t3 (2.1
ꢀ×ꢀ
100 mm，1.8
ꢀµ
m)，仍不能达到分离10种呋喃香豆素的效果，同时前处理较为复杂且液质联用仪器较为昂贵，操作维护复杂。
[0005]
由于呋喃香豆素种类较多，uplc法同时检测多种呋喃香豆素的方法鲜有报道，uplc法同时检测10种呋喃香豆素的研究尚无报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明针对背景技术中的不足，提供了一种uplc同时检测柑橘中10种呋喃香豆素的方法，该方法能同时测定柑橘样品中是否存在花椒毒内酯、佛手酚、异茴芹内酯、环氧佛手柑素、佛手柑素、欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素、佛手柑内酯、异补骨脂素成分，步骤简单，准确度高，重现性好，具有快速、高通量检测的特点。
[0007]
为实现上述目的，本发明技术解决方案如下：
一种uplc同时检测柑橘中10种呋喃香豆素的方法，同时检测方法包括如下步骤：1）配制标准品：称取10种呋喃香豆素的标准品，分别置于容量瓶中，加入甲醇溶液溶解稀释定容，获得单一标准储备液；2）配制标准溶液：分别移取步骤1）中的单一标准储备液，加入甲醇溶液稀释配制成混合标准溶液；3）样品前处理：称取柑橘样品置于离心管中，加入甲醇溶液，浸泡提取，水浴震荡辅助提取，离心收集上清液，旋转蒸发至无醇，加入甲醇溶液复溶，通过滤膜过滤，获得待测样品；4）检测分析：将步骤2）的混合标准溶液和步骤3）的待测样品分别上超高效液相色谱仪进行定性和定量分析测定，得到混合标准溶液的标准工作曲线和柑橘样品中呋喃香豆素的种类及含量。
[0008]
进一步地，所述步骤1）的10种呋喃香豆素成份的标准品的重量称取5mg；所述容量瓶体积采用10ml。
[0009]
进一步地，所述步骤2）的混合标准溶液的浓度为50μg/ml。
[0010]
进一步地，所述步骤3）的柑橘样品准确称取2g，置于50ml的离心管中，加入甲醇15ml，浸泡提取30 min，水浴震荡辅助提取30min（100rpm、30℃）， 4000rpm离心10 min，收集上清液，向残留物中再加入甲醇10ml，水浴震荡辅助提取30min， 4000rpm离心10 min，收集上清液，重复两次，合并上清液。
[0011]
进一步地，所述步骤3）合并的上清液在35℃真空旋转蒸发仪上旋转蒸发至无醇，用色谱级甲醇定容于5 ml，经0.22μm的尼龙滤膜过滤后待检测。
[0012]
进一步地，所述步骤4）的标准工作曲线由步骤2）的混合标准溶液移取5μl、10μl、25μl、50μl、75μl及100μl分别置于50ml的离心管中，不加入样品并根据步骤3）处理后上机测定得到。
[0013]
进一步地，所述步骤4）的超高效液相色谱仪的测试条件如下：1）液相色谱条件色谱柱:waters cortecs c18+柱，3.0mm
×
150mm，1.6μm；柱温：30
°
c；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；检测波长：310nm；流动相a：0.1%甲酸-水；流动相b：0.1%甲酸-乙腈；采用梯度洗脱。
[0014]
进一步地，所述梯度洗脱的程序：0~3.00min，流动相b的体积分数5%至15%；3.00~8.00min，流动相b的体积分数由15%至21%；8.00~16.00min，流动相b的体积分数为21%；16.00~29.00min，流动相b的体积分数由21%至30%；29.00~42.00min，流动相b的体积分数由30%至42%；42.00~50.00min，流动相b的体积分数由42%至60%；50.00~59.00min，流动相b的体积分数由60%至95%；59.00~59.10min，流动相b的体积分数由95%至5%；59.10~62.00min，流动相b的体积分数为5%。
[0015]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1) 本发明首次报道了同时检测柑橘中10种呋喃香豆素（花椒毒内酯、佛手酚、异茴芹内酯、环氧佛手柑素、佛手柑素、欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素、佛手柑内酯、异补骨脂素）的方法，测量的种类高于已有文献中的数量。
[0016]
2）本发明采用的色谱柱为waters cortecs c18+柱，3.0mm
×
150mm，1.6μm，比已报道的方法中的柱子，具有填料粒度更小、柱子更长的特点，因此具有分离度高的优点，解决了现有方法中部分呋喃香豆素单体间无法分离的问题。同时该柱子具有分离效率高，时间远短于其他柱子。
[0017]
3）提供一种uplc同时检测柑橘中10种呋喃香豆素的方法，该方法操作简便，专属性强，准确度高，适用性广，可以更好的控制柑橘加工制品的品质，为食品安全提供保障，本发明为柑橘制品的质量控制提供可靠的检测方法。
附图说明
[0018]
图1为实施例1中10种呋喃香豆素标准品的标准工作曲线；图2为实施例1中10种呋喃香豆素标准品（50μg/ml）的色谱图；图3为对比例1中10种呋喃香豆素标准品（50μg/ml）的色谱图；图4为对比例2中10种呋喃香豆素标准品（50μg/ml）的色谱图；图5为对比例3中10种呋喃香豆素标准品（50μg/ml）的色谱图；图6为实施例2中9种柑橘果肉中呋喃香豆素的含量；图7为实施例2中8种柑橘果皮中呋喃香豆素的含量；图8为对比例4中9种柑橘果肉中呋喃香豆素的含量；图9为对比例4中8种柑橘果皮中呋喃香豆素的含量。
具体实施方式
[0019]
以下结合图1～图9详细说明本发明的具体实施方式，使本领域的技术人员更清楚地理解如何实践本发明。尽管结合其优选的具体实施方案描述了本发明，但这些实施方案只是阐述，而不是限制本发明的范围。
[0020]
实施例1本发明公开了一种uplc同时检测柑橘中10种呋喃香豆素的方法，分别为花椒毒内酯、佛手酚、异茴芹内酯、环氧佛手柑素、佛手柑素、欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素、佛手柑内酯、异补骨脂素，同时检测方法包括如下步骤:1）配制标准品:称取10种呋喃香豆素的标准品，重量称取5mg，分别置于10ml的容量瓶中，加入甲醇溶液溶解稀释定容，获得单一标准储备液。
[0021]
2）配制标准溶液:分别移取步骤1）中的单一标准储备液，加入甲醇溶液稀释配制成浓度为50μg/ml的混合标准溶液。
[0022]
3）样品前处理:准确称取2克柑橘冷冻干燥粉末，加入甲醇15ml，浸泡提取30 min，水浴震荡辅助提取30min（100rpm、30℃）， 4000rpm离心10 min，收集上清液，向残留物中再加入甲醇10ml，水浴震荡辅助提取30min，4000rpm离心10 min，收集上清液，重复两次，合并上清液，将合并的上清液在35℃真空旋转蒸发仪上蒸发至无醇，用色谱级甲醇定容于5 ml，经0.22μm的尼龙滤膜过滤，获得待测样品。
[0023]
4）检测分析:将步骤2）的混合标准溶液移取5μl、10μl、25μl、50μl、75μl及100μl分别置于50ml的离心管中，不加入样品并根据步骤3）处理后上机测定得到混合标准溶液的标准工作曲线，如图1所示，10种呋喃香豆素标准品呈良好的线性关系，说明仪器具有良好的精密度。将步骤3）的待测样品分别上超高效液相色谱仪进行定性和定量分析测定，得到样品中呋喃香豆素的种类及含量。
[0024]
超高效液相色谱仪的测试条件如下:1）超高效液相色谱（uplc）条件色谱柱:waters cortecs c18+柱，3.0mm
×
150mm，1.6μm；柱温：30
°
c；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；检测波长：310nm；流动相a：0.1%甲酸-水；流动相b：0.1%甲酸-乙腈；运行时间：62 min；梯度洗脱程序为：0~3.00min，流动相b的体积分数5%至15%；3.00~8.00min，流动相b的体积分数由15%至21%；8.00~16.00min，流动相b的体积分数为21%；16.00~29.00min，流动相b的体积分数由21%至30%；29.00~42.00min，流动相b的体积分数由30%至42%；42.00~50.00min，流动相b的体积分数由42%至60%；50.00~59.00min，流动相b的体积分数由60%至95%；59.00~59.10min，流动相b的体积分数由95%至5%；59.10~62.00min，流动相b的体积分数为5%。
[0025]
色谱图如图2，可以看出，花椒毒内酯、佛手酚、异茴芹内酯、环氧佛手柑素、佛手柑素、欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素、佛手柑内酯、异补骨脂素10种呋喃香豆素标准品均能较好的分离，在62min内除了峰3（异补骨脂素）和峰4（花椒毒内酯）之间的分离度（r）为1.42以外，其它色谱峰之间的分离度均大于1.5，能够达到完全分离，并且峰形尖锐，对称性好，可满足多种呋喃香豆素的同时分离。
[0026]
对比例1配制标准品、配制标准溶液、样品前处理过程与实施例1相同，高效液相色谱（hplc）条件为:色谱柱: agilent zorbax sb-c18（250
×
4.6 mm,5μm），预柱c18（30
×
4.6 mm, 5μm）；柱温：30
°
c；流速：1ml/min；进样量：20μl；检测波长：310nm；流动相a：0.1%甲酸-水；流动相b：0.1%甲酸-乙腈；运行时间：55 min；梯度洗脱程序为：0~15.00min，流动相b的体积分数5%至20%；15.00~20.00min，流动相b的体积分数由20%至30%；20.00~35.00min，流动相b的体积分数由30%至100%；35.00~40.00min，流动相b的体积分数为100%。
[0027]
40.00~45.00min，流动相b的体积分数由100%至5%；45.00~55.00min，流动相b的体积分数为5%。
[0028]
色谱图如图3，可以看出，在55min内除峰1（佛手酚）、峰2（补骨脂素）、峰6（佛手柑
内酯）、峰7（环氧佛手柑素）能完全分离；峰3（异补骨脂素）与峰4（花椒毒内酯）峰形重叠，峰5（异茴芹内酯）与峰6（佛手柑内酯）峰形重叠，峰7（环氧佛手柑素）与峰8（欧前胡素）峰形重叠，6个物质均不能分离，无法测定其含量。
[0029]
对比例2配制标准品、配制标准溶液、样品前处理过程与实施例1相同，高效液相色谱（hplc）条件为:色谱柱: waters xbridge c18（250
×
4.6 mm,5μm）；柱温：30
°
c；流速：1ml/min；进样量：20μl；检测波长：310nm；流动相a：0.1%甲酸-水；流动相b：0.1%甲酸-乙腈；运行时间：100 min；梯度洗脱程序为：0~5.00min，流动相b的体积分数5%至15%；5.00~15.00min，流动相b的体积分数由15%至25%；15.00~30.00min，流动相b的体积分数为25%；30.00~45.00min，流动相b的体积分数由25%至42%；45.00~65.00min，流动相b的体积分数由42%至60%；65.00~95.00min，流动相b的体积分数由60%至100%；95.00~95.10min，流动相b的体积分数由100%至5%；95.10~100.00min，流动相b的体积分数为5%。
[0030]
色谱图如图4，可以看出，在100min内，花椒毒内酯、佛手酚、环氧佛手柑素、佛手柑素、欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素、异补骨脂素8个物质能较好的分离，但峰5（异茴芹内酯）和峰6（佛手柑内酯）峰形重叠，2种物质无法分离，无法测定其含量且分离时间过长，实际应用耗材量大。
[0031]
对比例3配制标准品、配制标准溶液、样品前处理过程与实施例1相同，超高效液相色谱（uplc）条件为:色谱柱: agilent zorbax extend-c18（100
×
2.1 mm,1.8μm）；柱温：30
°
c；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；检测波长：310nm；流动相a：0.1%甲酸-水；流动相b：0.1%甲酸-乙腈；运行时间：30 min；梯度洗脱程序为：0~3.00min，流动相b的体积分数5%至15%；3.00~7.00min，流动相b的体积分数由15%至22%；7.00~10.00min，流动相b的体积分数为22%；10.00~15.00min，流动相b的体积分数由22%至42%；15.00~20.00min，流动相b的体积分数由42%至60%；20.00~25.00min，流动相b的体积分数由60%至95%；25.10~30.00min，流动相b的体积分数为5%。
[0032]
色谱图如图5，可以看出，在30min内，佛手酚、环氧佛手柑素、佛手柑素、欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素6个物质能较好的分离，但峰3（异补骨脂素）和峰4（花椒毒内酯）峰形重叠，峰5（异茴芹内酯）和峰6（佛手柑内酯）峰形重叠，4种物质无法分离，无法测定其含量。
ug/g dw；含量最少为白柚皮，为8.22
±
0.41 ug/g dw；佛手酚、补骨脂素、异补骨脂素、花椒毒内酯、欧前胡素、异欧前胡素柑橘果皮中含量较高且分布品种多；异茴芹内酯、环氧佛手柑素、佛手柑素、佛手柑内酯在柑橘果皮中含量较少且分布品种少；检测到芦柑皮中的异欧前胡素最少，为0.61
±
0.10 ug/g dw。
[0038]
对比例4采样、样品前处理过程与实施例1相同，高效液相色谱（hplc）条件为:色谱柱: waters xbridge c18（250
×
4.6 mm,5μm）；柱温：30
°
c；流速：1ml/min；进样量：20μl；检测波长：310nm；流动相a：0.1%甲酸-水；流动相b：0.1%甲酸-乙腈；运行时间：100 min；梯度洗脱程序为：0~5.00min，流动相b的体积分数5%至15%；5.00~15.00min，流动相b的体积分数由15%至25%；15.00~30.00min，流动相b的体积分数为25%；30.00~45.00min，流动相b的体积分数由25%至42%；45.00~65.00min，流动相b的体积分数由42%至60%；65.00~95.00min，流动相b的体积分数由60%至100%；95.00~95.10min，流动相b的体积分数由100%至5%；95.10~100.00min，流动相b的体积分数为5%。
[0039]
由图8图9可知，在检测的9种不同柑橘品种的果肉中，均检测到佛手酚的存在，而在检测到有佛手酚的品种中，西柚果肉中佛手酚的含量显著高于其他柑橘品种，为15.19
±
0.09 ug/g dw;含量最少为芦柑，为0.31
±
0.02 ug/g dw;佛手酚、补骨脂素在柑橘果肉中含量较高且分布品种多; 异补骨脂素、花椒毒内酯、环氧佛手柑素、佛手柑素、欧前胡素、异欧前胡素在柑橘果肉中含量较少且分布品种少；检测到芦柑中的佛手酚最少，为0.31
±
0.01 ug/g dw。在检测的8种不同柑橘品种的果皮中，均检测到较高含量的佛手酚和补骨脂素，其中西柚皮中佛手酚的含量显著高于其他柑橘品种，为21.15
±
0.42 ug/g dw；芦柑皮中补骨脂素的含量显著高于其他柑橘品种，为35.43
±
0.31 ug/g dw；含量最少为红柚皮，为7.19
±
0.34ug/g dw；佛手酚、补骨脂素、花椒毒内酯、欧前胡素柑橘果皮中含量较高且分布品种多；异补骨脂素、环氧佛手柑素、佛手柑素、异欧前胡素在柑橘果皮中含量较少且分布品种少；检测到芦柑皮中的环氧佛手柑素最少，为0.93
±
0.05 ug/g dw；且异茴芹内酯、佛手柑内酯保留时间重叠，无法检测其在柑橘样品中的含量，只能检测出柑橘样品中8种呋喃香豆素的含量。
[0040]
实例2与对比例4相比，时间缩短38分钟，并且峰形尖锐，对称性好，可达到10种呋喃香豆素完全分离；并且检测到的呋喃香豆素种类精确，检测限更低，多种在柑橘样品中含量较少的呋喃香豆素能被检测出，例如实例2中的胡柚中检测到少量的异补骨脂素，脐橙中检测到少量的佛手酚，白柚中检测到少量的花椒毒内酯，而对比例4中均未检测出；一些呋喃香豆素在实例2中检测出的呋喃香豆素含量较对比例4中的略高，且更精确、稳定。
[0041]
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。