凝血酶时间质控品及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及凝血酶时间质控品及其制备方法与应用。


背景技术：

2.凝血：血液凝固的简称，是血液由液体状态转为凝胶状态的过程，是哺乳动物止血功能的重要组成部分。凝血是一系列的凝血因子相继被酶解激活，最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块的过程。凝血过程常包括三种途径，内源性凝血途径、外源性凝血途径和共同凝血途径。
3.凝血酶时间：是指在血浆中加入标准化的凝血酶后血液凝固的时间。在凝血共同凝血途径中，所生成的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，可用凝血酶时间来反映。
4.凝血因子是哺乳动物血液中参与血液凝固级联反应的一系列蛋白，在不同的哺乳动物之间具有同源性，在动物体内血液凝固过程与人相似。
5.目前国内应用的凝血酶时间质控品均为国外进口产品，价格昂贵，原料不易获得，不适用于批量生产，不易溶解。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供凝血酶时间质控品及其制备方法与应用，该质控品成本较低，且具有良好的复溶稳定性。
7.本发明提供了凝血酶时间质控品，其原料包括血液、抗凝剂和冻干保护液，所述冻干保护液包括b-400水性消泡剂、烟酰胺、hepes、蔗糖、月桂酸钠盐、全氟辛酸钠、硫柳汞、牛血清白蛋白、甘氨酸和naoh；所述冻干保护液中b-400水性消泡剂、烟酰胺、hepes、蔗糖、月桂酸钠盐、全氟辛酸钠、硫柳汞、牛血清白蛋白、甘氨酸的质量比为(5～10)：(45.6～91.59)：(123.6～357.45)：(100～200)：(0.555～0.111)：(0.104～0.218)：(2.5～5.0)：(100～200)：(25～50)，用naoh调ph至7.3～7.6。
8.一些实施例中，本发明所述的凝血酶时间质控品中，所述冻干保护液中各组分的浓度为b-400水性消泡剂为5g/l～10g/l、烟酰胺为45.6g/l～91.59g/l、hepes为123.6g/l～357.45g/l、蔗糖为100g/l～200g/l、月桂酸钠盐为0.555g/l～0.111g/l、全氟辛酸钠为0.104g/l～0.2180g/l、硫柳汞为2.5g/l～5.0g/l、牛血清白蛋白为100g/l～200g/l、甘氨酸为25g/l～50g/l和naoh。
9.另一些实施例中，本发明所述的凝血酶时间质控品中，所述冻干保护液中各组分的浓度为b-400水性消泡剂为10g/l、烟酰胺为91.59g/l、hepes为357.45g/l、蔗糖为200g/l、月桂酸钠盐为0.111g/l、全氟辛酸钠为0.2180g/l、硫柳汞为5.0g/l、牛血清白蛋白为200g/l、甘氨酸为50g/l和naoh。
10.本发明所述的凝血酶时间质控品中，所述血液为猪血液。
11.本发明所述的凝血酶时间质控品中，所述抗凝剂为2wt％～4wt％的柠檬酸三钠水溶液。
12.一些实施例中，本发明所述的凝血酶时间质控品中，所述抗凝剂是3.8wt％的柠檬酸三钠水溶液。
13.本发明所述的凝血酶时间质控品中，所述含有抗凝剂的血液和所述冻干保护液的体积比为(0.6～0.7)：(0.3～0.4)。
14.本发明所述的凝血酶时间质控品中，其ph值为7.3～7.6。一些实施例中，所述凝血酶时间质控品的ph值为7.40。
15.本发明提供的凝血酶时间质控品，其原料包括血液、抗凝剂和冻干保护液，该质控品不仅复溶后稳定性好，而且冻干品长期稳定性好。实验表明，其冻干品稳定性可达33个月。实验中发现，质控品制备过程中，抗凝剂和冻干保护液的选择对于质控品的品质影响显著。申请人通过对各组分的选择和用量进行优化，使各个组分相互配合，彼此互相支持，在相互作用下，共同实现了良好的稳定性。本发明还提供了所述凝血酶时间质控品的制备方法，其包括将所述冻干保护液与含有抗凝剂的血液混合后，经冷冻干燥，获得凝血酶时间质控品。
16.本发明所述的方法中，所述含有抗凝剂的血液的制备方法包括：将血液与所述抗凝剂混合后经离心分离获得血浆；所述血液与所述抗凝剂的体积比为9:1。
17.本发明所述的方法中，所述离心的条件包括2000g～2500g，离心时间20min～40min。
18.一些实施例中，本发明所述的方法中，所述离心的条件包括2000g，离心时间30min。
19.本发明提供了凝血酶时间质控品，其原料包括血液、抗凝剂和冻干保护液，制备的质控品复溶后稳定性好，冻干品长期稳定性好，冻干品稳定性可达33个月。并且，本发明质控物制备工艺简单价格低廉、原料易获得、适用于大批量生产，有较好工业化和临床应用前景。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
21.图1示本发明凝血酶时间质控品与市售凝血酶时间质控品开瓶稳定性检测结果；
22.图2示本发明凝血酶时间质控品与市售品长期稳定性检测结果。
具体实施方式
23.本发明提供了凝血酶时间质控品及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
24.本发明的目的是提供一种采用猪血浆制备凝血酶时间质控品的方法。为实现上述
目的，本发明采取以下技术方案：
25.取血浆放置于塑料烧杯中，加入冻干保护液稀释血浆，然后进行冷冻干燥，获得长期稳定的凝血酶时间质控品。
26.本发明实施例中，所述血浆采用猪血浆，其制备方法包括：猪颈静脉采集的血液，将血液按与抗凝剂9:1的比例加入抗凝剂，此处所述抗凝剂是2％～5％柠檬酸三钠水溶液。将加入抗凝剂的血液离心30分钟，相对离心力为2000g～2500g，小心分离吸取上层血浆。
27.所述的冻干保护液配方为，其与血浆的体积比为(0.3～0.4)：(0.6～0.7)。
28.序号原辅料名称浓度1b-400水性消泡剂5～10g/l2烟酰胺45.6～91.59g/l3hepes123.6～357.45g/l4蔗糖100～200g/l5月桂酸钠盐0.555～0.111g/l6全氟辛酸钠0.104～0.2180g/l7硫柳汞2.5～5.0g/l8牛血清白蛋白100～200g/l9甘氨酸25～50g/l1010m naoh60～120ml
29.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.实施例1
31.1、猪颈静脉采集的血液，将血液按与抗凝剂9:1的比例加入抗凝剂(3.8wt％的柠檬酸三钠水溶液)。将加入抗凝剂的血液离心30分钟，相对离心力为2000g，小心分离吸取上层血浆。
32.2、取一定量的上层猪血浆放置于塑料烧杯中，加入保护液稀释猪血浆至30％(体积分数)，经冻干获得质控品。
33.所述冻干保护液的配方如下：
34.[0035][0036]
对比例1
[0037][0038]
效果验证
[0039]
以实施例1和对比例1以及市售质控品为样品，对凝血酶时间质控品的稳定性进行检测。
[0040]
1、开瓶稳定性检测：将实施例1中制备的凝血酶时间质控品准确复溶在室温(20℃～28℃)条件下保存，每24小时取样一次，检测凝血酶时间质控品。检测结果如图1、表1。结果显示本发明制备的凝血酶时间质控品复溶后在室温储存条件下较稳定，市售质控品在室温条件下开瓶储存从第七天开始浓度下降，说明发明制备的凝血酶时间质控品有更好的稳定性。
[0041]
表1：开瓶稳定性检测结果
[0042]
储存时间(天)实施例1质控品(s)市面售质控品(s)对比例1质控品(s)045.220.145.9144.722.143.5245.121.044.0346.223.045.7444.021.046.2545.221.147.1645.820.147.7746.221.047.3847.823.148.7946.524.149.11045.524.648.9
[0043]
本发明质控品回归方程为：y＝0.169x+44.81，对斜率b与0的显著性差异进行双侧t检验，根据统计学计算得，tb＝1.985，p＞0.05，表明本发明制备的凝血酶时间质控品复溶后在室温条件下储存10天基本是稳定的。市售质控品回归方程为：y＝0.290x+20.48tb＝
2.347，p＜0.05，表明市售质控品在室温条件下开瓶储存10天，凝血酶时间检测值明显变化，对照质控品回归方程为y＝0.510x+44.18tb＝6.77，p＜0.05表明去除部分保护剂的质控品稳定性较差，且由图1可以看出，从第7天开始凝血酶时间检测值明显延长。
[0044]
由此可见，本发明制备的凝血酶时间质控品与市售产品相比，具有更好的开瓶稳定性，对于医院临床检验科，特别是业务量较小的基层医院，在凝血酶时间检测的质控工作中，质控品开瓶后保存更长时间，可以减少试剂浪费，降低检测成本，给工作带来方便。
[0045]
2、长期稳定性检测：将实施例1中制备的凝血酶时间质控品冻干品在2～8℃条件下保存，每3个月取出一瓶准确复溶，检测凝血酶时间质控品浓度。检测结果如图2、表2。结果显示本发明制备的凝血酶时间质控品冻干品在33个月后仍较稳定，有利于商品化生产。
[0046]
表2：长期定性检测结果
[0047]
储存时间(天)实施例1质控品(s)市面售质控品(s)对比例1质控品(s)045.821.145.6345.622.246.7644.221.346.2946.021.045.91545.220.147.71844.822.047.12144.720.148.12446.521.248.32745.219.848.93046.918.849.73345.418.250.1
[0048]
通过直线回归法分析，y＝0.017x+45.2，对斜率b与0的显著性差异进行双侧t检验，根据统计学计算得，tb＝0.728，p＞0.05，表明本发明制备的凝血酶时间质控品在+2～+8℃条件保存33个月基本稳定，长期稳定性较好，有利于商品化生产。
[0049]
市售质控品回归方程为：y＝0.101x+20.357，tb＝2.337，p＜0.05，表明市售质控品在+2～+8℃条件保存33个月，出现明显的变化，且由图2可以看出，从第27个月开始，凝血酶时间检测值明显延长。
[0050]
对照质控品回归方程为：y＝0.435x+45.49tb＝10.14，p＜0.05，表明去除部分保护剂的质控品稳定性较差。
[0051]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。