检测活性可溶性尿激酶受体的方法和检测用试剂盒与流程

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及对活性尿激酶受体进行检测的方法，特别是涉及对活性可溶性尿激酶受体进行检测的方法，该活性可溶性尿激酶受体亦称为活性可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(active soluble urokinase-type plasminogenactivator receptor，active soluble upar，活性supar)。本发明还涉及上述检测方法所用的试剂盒。

背景技术：

1、cn105954522b(中国专利申请号201610541379.6)公开了一种活性尿激酶受体的检测方法，其全部内容通过引用并入本文。尿激酶受体(urokinase type plasminogenacitivator receptor，尿激酶型纤溶酶原激活剂受体，upar)是一种细胞表面受体。该受体由stoppelli等于1985年发现，1989年roldan等克隆了其cdna，1990年behrendt等用亲和层析法从人淋巴瘤细胞u937的细胞膜抽提液中纯化出该蛋白。在第五次国际白细胞分化抗原会议上，upar被命名为分化抗原簇87(cluster of differentiation 87，cd87)。upar是一种高度糖基化的表面膜蛋白，广泛表达于免疫细胞表面，例如激活的嗜中性粒细胞、单核细胞、激活的t淋巴细胞、巨噬细胞，以及多种恶性肿瘤细胞表面，但是在绝大多数正常细胞表面表达量较低[a.estreicher,et al.the journal of cell biology 111(2)(1990)783-92；c.pyke,et al.histopathology 24(2)(1994)131-8；m.thuno,et al.diseasemarkers27(3)(2009)157-72；f.blasi,et al.molecular cell biology 3(12)(2002)932-43；t.plesner,et al.stem cells 15(6)(1997)398-408]。

2、作为一种柔性分子，upar可与多种配体或受体相互作用。如玻连蛋白(vitronectin)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，upa)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low density lipoprotein receptor-relatedprotein 1，lrp1)、整联蛋白(integrin)、g蛋白偶联受体(g protein coupledreceptor，gpcr)等。这些不同的相互作用在人体多种生理及病理过程中发挥着广泛的重要作用，包括纤溶酶原的激活、细胞黏附和迁移、细胞分化、化学增活现象、趋化因子受体调节、免疫应答、炎症反应等。upar由三个富含半胱氨酸、大小为81-87个氨基酸的ly6/upar结构域组成(d1，d2，d3)，分子量约为55kda。upar通过其c端的糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，gpi)锚定在细胞膜表面[f.blasi,et al.naturereviews.molecular cell biology 3(12)(2002)932-43；h.w.smith,et al.naturereviews.molecular cell biology 11(1)(2010)23-36]。

3、尿激酶受体存在着多种的形式，包括全长的膜受体、不含穿膜区的可溶性尿激酶受体(soluble upar，supar)、以及各种的降解片段。全长的upar膜受体易受磷脂酰酶c的水解，使upar从细胞膜表面脱落，形成不含糖基化磷脂酰肌醇的可溶性尿激酶受体(solubleupar，supar)。另外upar也对多种水解酶敏感，能够被进一步水解成d1和d2-d3片段[m.thuno,et al.supar:the molecular crystal ball,disease markers27(3)(2009)157-72]。

4、已有的晶体结构研究表明，upar通过它的三个结构域形成一个碗状结构，而正是这个碗状结构能高效结合它的配体upa[c.yuan,m.huang,cellular and molecular lifesciences:cmls 64(9)(2007)1033-7]，将upa富集在细胞表面，而将纤溶酶原激活为纤溶酶，进而对胞外基质进行降解，在细胞迁移在发挥重要作用。此外，还证明了upa与upar的结合可大大提高upar与玻连蛋白的结合[q.huai,et al.nature structural&molecularbiology 15(4)(2008)422-3]，而大量的文献也证明了upa与upar的结合对其与整合素相互作用的重要性[h.w.smith,et al.molecular cell biology 11(1)(2010)23-36；c.yuan,m.huang,cellular and molecular life sciences:cmls 64(9)(2007)1033-7]。这些蛋白与其他蛋白如caveolin等在病灶局部黏附、积聚，整合素受体启动细胞内信号，从而将信号从细胞外传入细胞内，激活细胞内蛋白激酶，促进细胞分裂及细胞迁移。这种upar被定义为活性supar。只有有活性的upar可进行信号的传导，而与肿瘤的侵袭和转移密切相关，而其他upar片段没有活性。目前尚没有测定活性supar的方法。

5、由于upar含量与疾病密切相关，目前市场上有很多针对upar的诊断方法，它们主要是通过双抗体夹心法来进行检测，一般测定的是血液中有活性和非活性的总量supar。如丹麦virogates公司推出的检测supar的酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbentassay，elisa)试剂盒已通过了欧洲的ce-ivd(体外诊断试剂)认证，用于指导临床。这种方法是基于总supar在血液中的浓度增高预示着病人免疫系统被持续激活[m.thuno,et al.disease markers27(3)(2009)157-72]，总supar在血液中的浓度水平也可作为病情进展的评定指标以及用于病人风险状态的临床决策[o.slot,et al.annals of therheumatic diseases 58(8)(1999)488-92；m.persson,et al.atherosclerosis 220(2)(2012)502-5；n.sidenius,et al.blood 96(13)(2000)4091-5]。另外，supar也可用于重症监护病房病人病情严重程度的筛选以及病人治疗效果的评价[i.casagranda,etal.internal and emergency medicine 10(6)(2015)725-30；r.uusitalo-seppala,etal.journal of internal medicine 272(3)(2012)247-56]。具体的，supar的浓度范围在0.1-4.0μg/l表示受检者为正常，没有感染或炎症反应；4-6μg/l表明受检者可能有感染，或免疫系统非正常激活需要进一步检查；>6μg/l表明疾病在快速进展中，需要严密监测以及跟进治疗。然而，目前类似于这些抗体双夹心法检测到的都是血液内多种形式supar的总值，无法直接地检测血液中活性supar的含量。

6、尽管在先申请cn105954522b(中国专利申请号201610541379.6)公开的活性尿激酶受体的检测方法能够直接地检测血液中活性supar的含量，然而它依然有需要改进的方面。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种对活性尿激酶受体进行检测的方法，或者是提供一种对可溶性尿激酶受体进行检测的方法，该活性可溶性尿激酶受体亦称为活性可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(active soluble urokinase-type plasminogen activatorreceptor，active soluble upar，活性supar)。或者，本发明一个目的是提供上述检测方法所用的试剂盒，以及用于此试剂盒的检测试剂。

2、为此，本发明第一方面提供一种检测生物样品中的可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体的方法，包括如下步骤：

3、1)使捕获试剂与待测样品在适合于所述捕获试剂捕获待测样品中活性supar的条件下接触，形成捕获试剂与活性supar的复合物；

4、2)使所形成的复合物与特异性结合被捕获的活性supar的试剂结合，并通过检测所述特异性结合被捕获的活性supar的试剂来检测被捕获的活性supar，

5、其中：

6、所述捕获试剂是含有atf的融合蛋白；

7、所述特异性结合被捕获的活性supar的试剂是结合于活性supar外侧的单克隆抗体。

8、根据本发明第一方面的方法，所述结合于活性supar外侧的单克隆抗体是用upar-d2d3(氨基酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗supar抗体。

9、根据本发明第一方面的方法，所述结合于活性supar外侧的单克隆抗体是抗体atn-658。

10、根据本发明第一方面的方法，随所述单克隆抗体还添加甘油磷酸钠，二者添加的质量比为1：50～100，例如1：75。

11、根据本发明第一方面的方法，所述特异性结合被捕获的活性supar的试剂还包括与所述单克隆抗体结合的二抗，该二抗例如是碱性磷酸酶标记的抗鼠igg。

12、根据本发明第一方面的方法，所述atf的融合蛋白是atf与另一种蛋白质或多肽或其片段的融合蛋白。所述另一种蛋白质或多肽或其片段可以是血清白蛋白，例如人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)，也可以是卵清蛋白(ova)。在一个优选的实施方案中，含有atf的融合蛋白是atf-hsa融合蛋白。

13、根据本发明第一方面的方法，所述atf的融合蛋白被固定在固体基质上。所述固体基质包括但不限于多孔板(如96孔板)、蛋白质芯片底膜(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)、磁珠、荧光微球等。

14、根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：

15、(1)向多孔板(在本发明的任一实施方案中，如未另外说明，该多孔板(亦称酶标板)均可用磁珠、荧光微球、蛋白质芯片底膜(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)等本领域常规的载体作为固体基质代替)的孔内加入经包被液稀释的atf-hsa蛋白溶液进行包被(4℃过夜)，洗涤并干燥；(2)向孔中加入封闭液进行封闭，室温孵育，洗涤并干燥；(3)向一些孔中分别加入一系列浓度的活性supar标准品，向另一些孔中加入的样品稀释液作为空白对照，向其它孔中加入待检样品(例如用样品稀释液稀释10倍的稀释液)；室温孵育，洗涤并干燥；(4)向所有孔内加入经样品稀释液稀释的鼠抗人源ssupar的单克隆抗体例如为atn-658抗体，室温孵育，洗涤并干燥；(5)向所有孔内加入碱性磷酸酶标记的抗鼠igg(例如碱性磷酸酶标记二抗(anti-mouse igg,ap-linked antibody))，室温孵育，洗涤并干燥；(6)向每孔内加入显色液，接着将多孔板置于酶标仪上于405nm读取吸光度；(7)依据不同浓度活性supar标准品的吸光度随时间变化的动力学过程(酶反应速度)与标准品浓度求得回归方程，用该回归方程计算样品中活性supar的浓度。

16、根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：

17、(1)向多孔板的孔内加入100μl经包被液稀释的atf-hsa蛋白溶液(100～150μg/ml例如120μg/ml)进行包被，4℃过夜，洗涤并干燥；(2)向孔中加入100μl封闭液进行封闭，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥；(3)向一些孔中加入不同浓度的活性supar标准品100μl，所述不同浓度分布在0.01～2μg/l浓度范围内例如在0.03～1μg/l浓度范围内例如分别为1μg/l、0.5μg/l、0.25μg/l、0.125μg/l、0.0625μg/l、0.03125μg/l；向另一些孔中加入100μl的样品稀释液作为空白对照，空白对照中不含有upar；向其它孔中加入待检样品的用样品稀释液稀释10倍的稀释液；室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥；(4)向所有孔内加入100μl 5～15μg/ml例如12～15μg/ml经样品稀释液稀释的鼠抗人源supar的单克隆抗体，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥(例如，所述单克隆抗体是用upar d2d3(氨基酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗supar抗体，例如为atn-658抗体)；或者，向所有孔内加入(a)100μl的5μg/ml经样品稀释液稀释的鼠抗人源supar的单克隆抗体和(b)25μl的1.5mg/ml甘油磷酸钠溶液，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥(例如，所述单克隆抗体是用upar d2d3(氨基酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗supar抗体，例如为atn-658抗体)；(5)向所有孔内加入100μl经样品稀释液500倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗鼠igg(例如碱性磷酸酶标记二抗(anti-mouse igg,ap-linked antibody))，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥；(6)向每孔内加入100μl显色液，接着将酶标板置于酶标仪上于405nm读取吸光度，共读取60min，每1min读取一次吸光度值；(7)依据不同浓度活性supar标准品的吸光度随时间变化的动力学过程(酶反应速度)与标准品浓度求得回归方程，用该回归方程计算样品中活性supar的浓度。

18、根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：

19、(1)血浆样品的处理：将采集自待检受试者的外周血置于edta-2na抗凝管中，离心分取血浆，用样品稀释液稀释，分装，待用；(2)包被：向酶标板(即多孔板，96孔)的1a-12h所有孔内加入100μl经包被液稀释的atf-hsa蛋白溶液(120μg/ml)，4℃过夜；用洗涤液洗涤，干燥；(3)封闭：向酶标板内1a-12h所有孔中加入100μl封闭液，密封，孵育，用洗涤液洗涤，干燥；(4)加样：分别向酶标板1a-1f加入不同浓度的活性supar标准品100μl，向g1、g2分别加入100μl的样品稀释液作为空白对照，向酶标板内其它孔加入待检受试者的稀释血浆样品，密封，室温孵育，用洗涤液洗涤，干燥；(5)加一抗：向酶标板1a-12h所有孔内加入(a)100μl的5μg/ml经样品稀释液稀释的atn-658抗体和(b)25μl的1.5mg/ml甘油磷酸钠溶液，密封，室温孵育，用洗涤液洗涤，干燥；(6)加酶标二抗：向酶标板1a-12h所有孔内加入100μl经样品稀释液500倍稀释的碱性磷酸酶标记二抗，密封，室温孵育，用洗涤液洗涤，干燥；(7)加显色液：向每孔内快速加入100μl显色液，接着将酶标板置于酶标仪上于405nm读取吸光度，共读取60min，每1min读取一次吸光度值；依据不同浓度活性supar标准品的吸光度随时间变化的动力学过程(酶反应速度)与标准品浓度求得回归方程，用该回归方程计算样品中活性supar的浓度。

20、根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：

21、(1)血浆样品的处理：将采集自待检受试者的外周血置于edta-2na抗凝管中，以4℃、1500g离心30min，分取血浆，用样品稀释液稀释10倍，分装于1.5ml离心管中，-80℃保存待用；(2)包被：向酶标板(即多孔板，96孔)的1a-12h所有孔内加入100μl经包被液稀释的atf-hsa蛋白溶液(120μg/ml，用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，并于)4℃过夜；洗涤并干燥(揭开密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔6次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留)；(3)封闭：向酶标板内1a-12h所有孔中加入100μl封闭液，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，于室温80转/分的摇床上孵育1小时；揭开密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液洗涤每孔6次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；(4)加样：分别向酶标板1a-1f加入不同浓度的活性supar标准品100μl，每一浓度有两个复孔(a1、a2：1μg/l；b1、b2：0.5μg/l；c1、c2：0.25μg/l；d1、d2：0.125μg/l；e1、e2：0.0625μg/l；f1、f2：0.03125μg/l)。向g1、g2分别加入100μl的样品稀释液作为空白对照。然后向酶标板内其它孔加入待检受试者的稀释血浆样品，每个血浆样品2个重复，然后用密封胶带将96孔板密封好，并于室温80转/分钟的摇床上孵育1小时。揭开密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔6次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；(5)加一抗：向酶标板1a-12h所有孔内加入(a)100μl的5μg/ml经样品稀释液稀释的atn-658抗体和(b)25μl的1.5mg/ml甘油磷酸钠溶液，并用密封胶带将96孔板密封好，并于室温80转/分钟的摇床上孵育1小时。揭开密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔6次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；(6)加酶标二抗：向酶标板1a-12h所有孔内加入100μl经样品稀释液500倍稀释的碱性磷酸酶标记二抗(anti-mouse igg,ap-linked antibody)，并用密封胶带将96孔板密封好，并于室温80转/分钟的摇床上孵育1小时。揭开密封胶带，甩干酶标板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔6次，然后再用排枪吸取去离子水洗涤每孔3次。将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；(7)加显色液：然后用排枪向每孔内快速加入100μl显色液，接着将酶标板置于酶标仪上于405nm读取吸光度，共读取60min，每1min读取一次吸光度值；依据不同浓度活性supar标准品的吸光度随时间变化的动力学过程(酶反应速度)与标准品浓度求得回归方程，用该回归方程计算样品中活性supar的浓度。

22、根据本发明第一方面的方法，所述待检样品是血浆样品。在一个实施方案中，所述血浆样品是照如下方式处理的：将采集自待检受试者的外周血置于edta-2na抗凝管中，以4℃、1500g离心30min，分取血浆，用样品稀释液稀释10倍，分装于1.5ml离心管中，-80℃保存待用。

23、根据本发明第一方面的方法，所述atf-hsa融合蛋白是照本发明实施例1所载方法制备的；亦可是市售途径购得或者借鉴其它文献方法制备得到。

24、根据本发明第一方面的方法，所述活性supar标准品是通过在s2果蝇胚胎细胞中表达的重组supar，经亲合柱结合离子柱纯化得到的。

25、根据本发明第一方面的方法，所述atn-658抗体是购自antibody system公司的货号fhf99110的产品，规格100ug/支，1mg/ml的产品。

26、根据本发明第一方面的方法，所述甘油磷酸钠是β-甘油磷酸钠。

27、根据本发明第一方面的方法，所述包被液是包含40mm nahco3和10mm na2co3的ph9.6的水溶液。

28、根据本发明第一方面的方法，所述封闭液是包含10％w/v牛血清白蛋白/10mm磷酸钠/150mm nacl的溶液；例如封闭液是blockertmbsa/pbs(10x)溶液，即10％w/v牛血清白蛋白/10mm磷酸钠/150mm nacl溶液，ph7.4，赛默飞世尔，货号：37525。

29、根据本发明第一方面的方法，所述洗涤液/样品稀释液是包含0.5‰的tween-20的ph7.4的pbs溶液，其中pbs配方为nacl 8g/l、kcl 0.2g/l、na2hpo4·12h2o 3.58g/l、kh2po4 0.27g/l。

30、根据本发明第一方面的方法，所述显色液包含：100mm tris·hcl(ph9.5)、100mmnacl、5mm mgcl2、2mg/ml pnpp。

31、根据本发明第一方面的方法，所述碱性磷酸酶标记二抗可以是市面上售可得任何碱性磷酸酶标记二抗例如是anti-mouse igg,ap-linked antibody，cell signalingtechnology,inc.，货号#7056。

32、根据本发明第一方面的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、血浆、细胞培养液、唾液和尿液。

33、本发明所述方法所用的各种检测材料可以配置于试剂盒中，为此，本发明第二方面提供了一种试剂盒，例如用于检测可溶性尿激酶受体的方法的试剂盒，例如用于本发明第一方面任一项所述方法的试剂盒。

34、根据本发明第二方面的试剂盒，其包括：

35、酶标板(即多孔板，例如96孔)、atf-hsa蛋白(干粉或溶液，例如1ml，例如浓度1～1.5mg/ml的溶液)、活性supar标准品(干粉或稀释液，例如1ml，例如浓度1mg/ml的溶液)、atn-658抗体(例如1mg/ml，例如100μl)、碱性磷酸酶标记二抗(例如25μl，例如500×碱性磷酸酶标记二抗)、甘油磷酸钠溶液(例如5ml)、包被液(例如10ml)、稀释液(例如20ml)、洗涤液(例如20ml)、封闭液(例如10ml)、显色液(例如10ml)、任选的血样处理抗凝管若干支、以及任选的试剂盒使用说明书(其中记载了本发明任一实施方案所述的检测方法)。

36、在本发明的一个/一些实施方案中，本发明方法所用的各种检测材料可以配置于试剂盒中。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测被捕获的活性supar的一种或多种试剂，其中所述捕获试剂被可检测的成对标记成分中的一个成分标记，并且用于检测被捕获的活性supar的一种或多种试剂被成对标记成分中的另一个标记。通过检测成对标记成分之间的相互作用可以实现对被捕获的活性supar的检测。在优选的实施方案中，所述用于检测被捕获的活性supar的一种或多种试剂包括结合于活性supar外侧的单克隆抗体和/或与该单克隆抗体结合的二抗，例如碱性磷酸酶标记的抗鼠igg。

37、在本发明的一个/一些实施方案中，可以通过本领域技术人员熟知的具体检测系统和/或具体检测方法对被捕获的活性supar进行检测。所选择的具体检测方法可以是异质或同质测定法。异质测定法是包括一次或多次清洗步骤的测定法，而在同质测定法中，此类清洗步骤不是必需的，仅将检测试剂和待检测样品混合并测量。所述测定方法包括但不限于基于elisa(酶联免疫吸附测定法)的测定法、干式荧光免疫层析法、化学发光法、delfia(解离增强镧系元素荧光免疫测定法)、spa(闪烁邻近测定法)、flashplate测定法、fret(荧光共振能量转移)测定法、tr-fret(时间分辨荧光共振能量转移)测定法、fp(荧光偏振)测定法、alpha(放大化学发光亲合均相检测)、efc(酶片段互补)测定法、双杂交测定法或共免疫沉淀测定法。

38、在本发明的一个/一些实施方案中，在上述活性supar的检测方法中，步骤2)可以包括使所形成的复合物与特异性结合被捕获的活性supar的试剂结合，并通过检测所述特异性结合被捕获的活性supar的试剂来检测被捕获的活性supar。在该类检测过程中，可以通过对反应体系中所包含的检测成分的测定来实现对被捕获的活性supar进行检测。所述检测成分包括捕获试剂(例如捕获试剂中所含有的atf或其融合蛋白)和/或与被捕获的活性supar特异性结合的试剂。对检测成分的测定可以通过使用可检测的标记成分进行标记并检测标记成分来进行。可检测的标记成分根据具体使用的测定方法而有所不同。本发明中，可以以多种方式，例如但不限于用生物素、酶、荧光染料(如fitc、荧光素、罗丹明、cy染料或alexa fluor)，来标记检测成分，也可以使用放射性标记物(如3h、32p、35s、125i或14c)及常见的酶标记物如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶来进行标记。例如，可以将标记成分标记在与被捕获的活性supar特异性结合的试剂上，通过检测标记成分实现对被捕获的活性supar的检测；也可以将成对的标记成分中的一个标记在捕获试剂上，另一个标记在与被捕获的活性supar特异性结合的试剂上，通过成对的标记成分之间的相互作用的检测实现对被捕获的活性supar的检测；还可以将标记成分标记在捕获试剂上，捕获试剂与活性supar的结合会导致捕获试剂上的标记成分发生变化，通过检测标记成分的变化实现对被捕获的活性supar的检测；这些标记成分及其检测方法都是本领域技术人员熟知的。

39、本文使用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除了少数可能存在的天然发生的突变之外，单克隆抗体高特异性地针对单个抗原表位。制备特定抗原的单克隆抗体的方法是本领域公知的，例如通过杂交瘤方法获得。本发明所述结合于活性supar外侧的单克隆抗体是指所针对的抗原表位位于活性supar外侧的单克隆抗体。所述活性supar外侧是活性supar上相对于atf所插入的活性疏水性口袋的内侧而言的外侧上的位点。活性supar与atf结合情况下，与其外侧位点结合的单克隆抗体可以与所形成的复合物相结合，从而可以实现对被捕获的活性supar的检测。鉴定单克隆抗体所针对的抗原表位的方法是本领域公知的，因此本领域技术人员可以通过其所熟知的方法确定单克隆抗体是否与活性supar外侧相结合。

40、本领域技术人员知晓，对该单克隆抗体的测定可以通过使用可检测的标记成分对检测成分进行标记并检测标记成分来进行。检测成分包括捕获试剂(含有atf或含有atf的融合蛋白)、结合于活性supar外侧的单克隆抗体和/或与该单克隆抗体结合的二抗。例如，可以将标记成分标记在单克隆抗体上，通过检测标记成分实现对被捕获的活性supar的检测；也可以使单克隆抗体与二抗结合，将标记成分标记在二抗上，通过检测标记成分实现对被捕获的活性supar的检测；还可以将成对的标记成分中的一个标记在捕获试剂上，另一个标记在该单克隆抗体或与该单克隆抗体结合的二抗上，通过成对的标记成分之间的相互作用的检测实现对被捕获的活性supar的检测；还可以将标记成分标记在捕获试剂上，捕获试剂与活性supar的结合会导致捕获试剂上的标记成分发生变化，通过检测标记成分的变化实现对被捕获的活性supar的检测；这些标记成分及其检测方法都是本领域技术人员熟知的。可检测的标记成分包括但不限于生物素、酶、荧光染料(如fitc、荧光素、罗丹明、cy染料或alexa fluor)、放射性标记物(如3h、32p、35s、125i或14c)以及常见的酶标记物如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

41、本发明所述活性supar捕获剂atf的氨基酸序列如seq id no.2所示。

42、在本发明中，所使用的术语“upa”指尿激酶型纤溶酶原激活物。

43、在本发明中，所使用的术语“upar”指尿激酶型纤溶酶原激活物受体，也可称为尿激酶受体。

44、在本发明中，所使用的术语“supar”指尿激酶型纤溶酶原激活物受体(upar)的可溶形式。

45、在本发明中，所使用的术语“活性supar”是指结构上含三个完整结构域d1和d2d3、功能上能够结合天然配体upa和玻连蛋白的upar。本文所述的“活性supar”包含全长的upar膜受体、不含穿膜区的可溶性尿激酶受体(soluble upar，supar)，但不包含supar的各种降解片段。

46、在本发明的一个/一些实施方案中，本发明的检测方法是非诊断目的的，并且是在体外进行的。

47、在本发明的一个/一些实施方案中，所述捕获试剂被可检测的标记成分标记。捕获试剂与活性supar的结合会导致捕获试剂上的标记成分发生变化，通过检测捕获试剂上的标记成分的变化可以实现对被捕获的活性supar的检测。

48、在本发明的一个/一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测被捕获的活性supar的一种或多种试剂，其中所述捕获试剂被可检测的成对标记成分中的一个成分标记，并且用于检测被捕获的活性supar的一种或多种试剂被成对标记成分中的另一个标记。通过检测成对标记成分之间的相互作用可以实现对被捕获的活性supar的检测。在优选的实施方案中，所述用于检测被捕获的活性supar的一种或多种试剂包括结合于活性supar外侧的单克隆抗体和/或与该单克隆抗体结合的二抗，例如碱性磷酸酶标记的抗鼠igg。

49、在本发明的一个/一些实施方案中，所述试剂盒还包含任何适用于检测被捕获试剂捕获的活性supar的可检测的标记成分。

50、在本发明中，可检测的标记成分包括但不限于生物素、酶、荧光染料(如fitc、荧光素、罗丹明、cy染料或alexa fluor)、放射性标记物(如3h、32p、35s、125i或14c)以及常见的酶标记物如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

51、在本发明的一个/一些实施方案中，在本发明的试剂盒中，捕获试剂可以被固定在固相基质上，例如被固定在多孔板(如96孔板)、蛋白质芯片底膜(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)、磁珠上。试剂盒中还可以包含包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、以及用于检测标记成分的试剂中的一种或多种。

52、在本发明的一个/一些实施方案中，本发明的试剂盒包含：酶标板；atf-hsa蛋白溶液；活性supar标准品；用人upar d2d3(氨基酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗supar抗体；碱性磷酸酶标记的抗鼠igg；包被液；洗涤液/样品稀释液；封闭液和显色液。

53、在本发明的一个/一些实施方案中，本发明的试剂盒包含：酶标板；atf-hsa蛋白溶液(例如1ml，浓度1～1.5mg/ml)；活性supar标准品(例如1ml，浓度1mg/ml)；用upar d2d3(氨基酸88-283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗supar抗体(例如1mg/ml，100μl)；25μl 500×碱性磷酸酶标记的抗鼠igg；包被液10ml；30×洗涤液/样品稀释液20ml；bsa封闭液10ml；pnpp显色液10ml。

54、在本发明的一个/一些实施方案中，包被液优选为含40mm nahco3，10mm na2co3，ph9.6的水溶液。

55、在本发明的一个/一些实施方案中，封闭液可为用包被液配制的5％的bsa溶液；亦可为blockertmbsa/pbs(10x)溶液，即10％w/v牛血清白蛋白/10mm磷酸钠/150mm nacl溶液，ph7.4，赛默飞世尔，货号：37525。

56、在本发明的一个/一些实施方案中，洗涤液/样品稀释液优选为含0.5‰tween-20ph 7.4的pbs溶液，其中pbs配方为nacl 8g/l，kcl 0.2g/l，na2hpo4·12h2o 3.58g/l，kh2po4 0.27g/l。

57、在本发明的一个/一些实施方案中，显色液优选含有0.1m tris·hcl(ph9.5)，0.1m nacl，5mm mgcl2，2mg/ml pnpp。

58、使用本发明的检测方法和检测试剂盒，可特异地检测各种样本中的活性supar。

59、本发明中所使用的“包含”、“包括”或“含有”可以指“包括但不限于”、“基本由…组成”或“主要由…组成”。在本发明中使用“包含”、“包括”或“含有”的技术方案还可以是由所列成分组成的技术方案。

60、本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

61、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(supar)是一种来源于细胞膜结合的尿激酶型纤溶酶原激活物受体(upar)的蛋白。supar及其片段存在于体液中，包括血液和尿液[c.wei,et al.nature medicine 17(8)(2011)952-60；h.de witte,et al.journalinternational du cancer 77(2)(1998)236-42；r.w.stephens,et al.clinicalchemistry 43(10)(1997)1868-76；k.wahlberg,et al.cancer research 58(15)(1998)3294-8；c.f.sier,et al.laboratory investigation；a journal of technical methodsand pathology 79(6)(1999)717-22]。在许多病理条件下，包括系统性红斑狼疮(sle)、人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)感染、2型糖尿病肾病、活动性肺结核(tb)、脓毒症、疟疾以及各种实体瘤(如非小细胞肺癌、乳腺癌和结直肠癌)中，都记录到血浆或血清中supar水平升高[n.sidenius,,et al.blood 96(13)(2000)4091-5；c.z.wu,et al.clinicalbiochemistry(2015)；s.r.ostrowski,et al.the journal of infectious diseases 191(8)(2005)1331-41；h.pappot,,et al.european journal of cancer 33(6)(1997)867-72；j.eugen-olsen,,et al.the international journal of tuberculosis and lungdisease:the official journal of the international union against tuberculosisand lung disease 6(8)(2002)686-92；k.kofoed,et al.european journal of clinicalmicrobiology&infectious diseases:official publication of the european societyof clinical microbiology 27(5)(2008)375-83；r.w.stephens,et al.journal of thenational cancer institute 91(10)(1999)869-74；h.enocsson,et al.translationalresearch:the journal of laboratory and clinical medicine 162(5)(2013)287-96]。

62、发现高水平的supar在预测癌症患者、hiv感染者和急诊科疑似感染患者的严重程度和预后方面具有很强的预后价值[n.sidenius,,et al.blood 96(13)(2000)4091-5；r.w.stephens,et al.journal of the national cancer institute 91(10)(1999)869-74；r.uusitalo-seppala,et al.journal of internal medicine 272(3)(2012)247-56]。此外，supar被认为是局灶性节段性肾小球硬化症(fsgs)危重患者和糖尿病肾病(dn)不同阶段患者的稳定生物标志物[c.wei,et al.nature medicine 17(8)(2011)952-60；c.z.wu,et al.clinical biochemistry(2015)；a.koch,et al.critical care 15(1)(2011)r63]。最近，大量患者(1335)的supar水平升高与慢性肾脏疾病和估计肾小球滤过率加速下降独立相关[s.s.hayek,et al.the new england journal of medicine 373(20)(2015)1916-25]。persson首次将upar应用于人类癌症患者的pet成像[m.persson,etal.theranostics 5(12)(2015)1303-16]。

63、已经发现upar靶向成像试剂被原发性肿瘤病变和淋巴结转移显著吸收，这与移除的肿瘤组织中upar的高表达平行。upar包含三个ly6/upar型(lu)结构域，通过糖磷酰肌醇(gpi)-锚定连接到细胞表面。已有的晶体结构研究表明，lu结构域紧密地聚集在一个球状蛋白中，并具有一个中央凹形裂缝，这是由所有三个结构域的贡献形成的[q.huai,etal.science 311(5761)(2006)656-9；p.llinas,et al.the embo journal 24(9)(2005)1655-63]。upar的中心腔在所谓的氨基末端片段(atf；upa残基1-134)处与初级配体尿激酶型纤溶酶原激活剂(upa)结合。

64、atf包含用于upar识别的所有结构元件，并以与全长upa无法区分的亲和力(0.1-1nm)结合受体[q.huai,et al.science 311(5761)(2006)656-9；m.ploug,currentpharmaceutical design 9(19)(2003)1499-528；l.lin,et al.j biol chem 285(14)(2010)10982-92；r.mazzieri,et al.molecular biology of the cell 17(1)(2006)367-378]。除了upa的主要配体外，upar还识别一系列其他不同的配体[g.eden,et al.currentpharmaceutical design 17(19)(2011)1874-89]，例如维管连蛋白[q.huai,et al.naturestructural&molecular biology 15(4)(2008)422-3]，与upar的广泛功能作用一致[o.cunningham,et al.the embo journal 22(22)(2003)5994-6003；h.w.smith,etal.molecular cell biology 11(1)(2010)23-36]。然而，upa仍然是upar的主要和最紧密的结合剂。已经发现，upar可在体外和体内被切割成更小的片段[g.hoyer-hansen,etal.eur j biochem 243(1-2)(1997)21-6；b.k.pliyev,mol cell biochem 321(1-2)(2009)111-122；n.behrendt,et al.j biol chem 266(12)(1991)7842-7]，并且在体内鉴定出许多upar片段[28]，即supar d1结构域和supar d2d3结构域。此外，最近的生物化学和结构研究表明，supar的构象高度不稳定，尤其是其d1结构域[h.gardsvoll,et al.j biolchem 286(38)(2011)33544-56]。这些新结果对选择合适的构象特异性抗体用于uparelisa和测量upar的形式提出了挑战。

65、atf-hsa作为捕获剂：众所周知，atf含有与supar的完全结合能力，与全长upa无区别。在本发明中，将atf与人血清白蛋白融合，使用重组蛋白atf-hsa来捕获supar，而不仅仅是使用atf本身来捕获supar。这一方案可实现两个目的：1)通过hsa的间隔效应增加atf受体结合表位的暴露，并避免atf过于靠近板表面，atf是一种肽，分子量约为16kda，而hsa的大小为8nm，分子量高得多，为66kda；2)它有助于在微孔板上涂覆捕获剂，大尺寸的hsa促进了捕获剂与maxisorp板孔的结合，从而确保了板的高结合能力。hsa(人血清白蛋白，humanserum albumin)是人类血液中最丰富的蛋白质，约占血液总蛋白质的60％。hsa在体外和体内都非常稳定，在血液中的半衰期为19天，并能在60℃温度下进行10小时的热巴氏灭菌。这是由于单个hsa分子中存在17个二硫键，保持其三级结构的紧密折叠。另外，hsa通常与其他蛋白质没有特异性相互作用，不应影响测定。因此，本发明制备重组atf-has并期望其保持与hsa自身相似的稳定性。

66、atn-658作为捕获剂：已知atn-658不与非人upar结合，不阻断upa与upar的结合，即使upar被upa占据，也能与upar结合，因此，选择atn-658检测supar是有益的。

67、血液中存在不同形式的supar，它们可能的生理意义亦是不同的。已知upar是多种类型细胞表面表达的多功能受体，参与细胞外基质蛋白水解、细胞粘附、迁移和增殖以及细胞信号事件。upar通过连接到upar的d3结构域的gpi锚连接到细胞表面，该结构域进一步连接到d2结构域，然后通过长连接子连接到d1结构域。不同长度的upar片段可以通过在d1和d2d3之间的gpi锚定物或长连接体区域处切割形成，产生包括supar(d1-d3)、supar-d1或supar-d2d3的片段[m.thuno,et al,disease markers 27(3)(2009)157-72；f.fazioli,etal,the embo journal 16(24)(1997)7279-86.]。这些upar片段已被鉴定为发挥不同的功能作用。upar-d1来源于upar长连接区的切割，不能与其配体upa结合(比全长upar弱1000倍)[n.sidenius,et al,febs lett 470(1)(2000)40-46]。supar-d1仅在尿液中发现，可能是由于其从血液中快速清除的性能。supar-d2d3可由多种类型的细胞产生，包括人中性粒细胞，并由于存在趋化表位(连接区中的氨基酸srsry)而表现出趋化功能。已知supar的所有三个结构域都是upa结合所必需的[q.huai,et al,science 311(5761)(2006)656-9]。supar能够特异性结合upa和vitronectin，因此可以与膜结合的upar竞争，并作为upa或vitroneptin的清除剂。

68、已知对于supar的d2d3片段的重组蛋白，即使浓度高达120ng/ml也没有检测到信号，表明全长supar需要结合其配体upa或atf，而supar之d2d3片段或supar之d1片段没有显示出明显的结合[g.hoyer-hansen,et al,febs lett 420(1)(1997)79-85；n.sidenius,etal,febs lett 470(1)(2000)40-46；m.ploug,et al,biochemistry-us 33(30)(1994)8991-8997]。亦有文献表明，使用人atf与人supar结合的亲和力比之于与鼠supar结合的亲和力高两个数量级[l.lin,et al,j biol chem 285(14)(2010)10982-92]。因此，使用atf-has融合蛋白的测定方法将具有非常好的特异性，对小鼠upar或人upar片段没有交叉反应。