一种全血蛋白质组学分析方法与流程

1.本发明属于蛋白质组学分析技术领域，具体地，涉及一种全血蛋白质组学分析方法。


背景技术：

2.血液中包含生物体各类组织器官释放的物质，潜藏着大量可发掘的生理或病理信息。据推测，血液中的蛋白质种类超过万种，但是由于目前检测鉴定技术有限，只有很小的一部分蛋白质可被检测出来。由于血液中含有数十种高丰度蛋白，占了总蛋白量的95％以上，给血液蛋白组的检测带来了巨大的挑战。目前，即使通过使用商业化去高丰度抗体试剂盒，也仅能将蛋白鉴定数提高到400～800个。
3.血液样本采集后通常需要通过离心去除血细胞得到上层血浆后，才能进行后续样本制备和质谱检测，否则检测过程中，血细胞容易破裂释放出大量高丰度蛋白，干扰检测结果。同时由于溶血原因，如果不去除血细胞，血液样本无法长期保存。如果全血采样后未能及时处理，或不具备离心分离血浆条件，通常无法继续用于蛋白组学分析。在离心分离血浆的过程中，不可避免地会损失掉部分蛋白信息。同时，由于离心分离血浆过程的操作差异，包括温度、离心力、离心时间在内的各种因素，均可能造成血浆蛋白组信息的人为差异，对血浆蛋白组分析和相关生理病理信息的挖掘产生干扰。。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种全血蛋白质组分析方法，利用纳米材料富集方法，选择性吸附低丰度蛋白，可以同时应用于新鲜采集或冷冻保存的全血样本。处理新鲜全血标本时，可以保护血细胞防止其破裂，从而可以省略血浆分离步骤而直接从全血样本中检测蛋白质组学信息，其结果与血浆样本具有良好的定量相关性。对于不具备及时处理条件的全血样本，冷冻保存后再用本发明方法进行样本处理，也可以有效去除样本中血浆和血细胞来源的高丰度蛋白，选择性富集血液标本中的低丰度蛋白，蛋白组分析结果具有较高的蛋白鉴定数及定量稳定性。
5.技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种全血蛋白质组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.s1、向全血样本中加入结合缓冲液和磁珠，混合孵育后，经过磁分离收集磁珠；
8.s2、向步骤s1所得磁珠中，加入清洗缓冲液，重悬清洗后，经过磁分离收集磁珠，重复该步骤数次；
9.s3、将步骤s2所得磁珠制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。
10.步骤s1中，所述全血样本选自不同物种、部位来源的抗凝全血样本，可以为新鲜采集、部分溶血或或冷冻保存的抗凝全血样本，优选冷冻保存的edta抗凝静脉全血。
11.所述结合缓冲液成分包括tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、甲酸、乙
酸、碳酸氢铵、氯化钙、乙腈、氢氧化钠、盐酸、edta、sds、np-40、chaps、吐温、triton、peg的中的一种或任意组合，优选为tris、edta的组合缓冲液。
12.优选的，步骤s1中，所述磁珠材料选自四氧化三铁，或其与聚苯乙烯、分子筛、二氧化硅中的一种或几种的复合物，例如四氧化三铁与聚苯乙烯形成的复合物磁性聚苯乙烯微球等。
13.优选的，步骤s1中，所述混合孵育条件为：孵育温度为4～37℃，孵育时间为1～120分钟，震荡速度为0～1000转/分钟。
14.优选的，步骤s2中，所述清洗缓冲液选自步骤s1所使用的结合缓冲液或相应稀释液；所述重悬清洗条件为为4～37℃，震荡速度为0～3000转/分钟，时间为1～30分钟。
15.优选的，步骤s2中，该步骤可重复多次，优选3次。
16.优选的，步骤s3中，所述蛋白质组样品的制备方法包括如下步骤:向所述磁珠中加入还原试剂和烷基化试剂，经还原烷基化反应后，向体系中加入测序级及以上的胰蛋白酶及消化缓冲液，进行酶解反应；酶解后样品经脱盐后，得到蛋白质组样品。
17.进一步优选的，
18.所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原试剂后于45～95℃条件下反应0～60分钟，再加入烷基化试剂避光室温反应5～60分钟；
19.所述消化缓冲液包括氯化钙、碳酸氢铵等，ph值为7.0～8.8；所述胰蛋白酶的加入量为0.1～10ug/μl；所述酶解条件为：温度为25～37℃，时间为1～16小时；所述脱盐步骤为使用所述相同硅铝酸盐类、聚苯乙烯类、c18类等材料进行吸附、清洗及解吸附或加入终浓度》80％的乙腈、甲醇、乙醇等有机溶剂将肽段沉淀在磁珠表面并去除溶液中的盐类。
20.优选的，步骤s3中，所述质谱检测方法为：采用液相色谱-串联质谱方法进行检测，使用软件对数据进行抽提后，获得蛋白及肽段定量定性数据。
21.有益效果：与现有技术相比，本发明利用磁珠和特定的缓冲体系，可以直接富集全血样本中的蛋白质，可以同时应用于新鲜或冷冻的全血样本。对于新鲜采集的样本，所采用的缓冲液体系可以在蛋白富集过程中有效保护血细胞不受破坏，从而避免血细胞破裂释放出干扰蛋白，蛋白鉴定数及定量值与血浆样本具有良好一致性。对于冷冻保存的全血标本，磁珠选择性吸附血液中的低丰度蛋白，可以同时有效去除样本中血浆和血细胞来源的高丰度蛋白，具有稳定的高蛋白鉴定数及更高的定量稳定性。本发明方法应用于全血蛋白组分析，可以简化样本前处理步骤，避免离心分离血浆过程中造成的蛋白损失，对于不能及时处理或不具备离心条件的全血样本可以直接冷冻保存后再检测。
附图说明
22.图1新鲜全血样本经本发明方法处理后离心分层图。
23.图2本发明方法处理全血样本后的蛋白凝胶电泳图：1为磁珠处理的冷冻全血蛋白，2为磁珠处理的新鲜全血蛋白，3为磁珠处理的血浆蛋白，4为未处理血浆对照。
24.图3本发明方法处理新鲜全血样本和血浆样本鉴定蛋白韦恩图。
25.图4本发明方法处理新鲜全血样本和血浆样本定量相关性。
26.图5本发明方法处理采集后0-8小时内冷冻保存的添加不同抗凝剂的全血样本蛋
白定量相关性：1为edta抗凝全血，2为枸橼酸钠抗凝静脉全血。
27.图6本发明方法处理三例采集后8-72小时内冷冻保存的全血样本蛋白定量相关性。
具体实施方式
28.以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
29.实施例1
30.1.取新鲜采集的抗凝静脉血，等分为两份；
31.2.其中一份轻微颠倒2～3次使样本混合均匀，得到全血样本；
32.3.将另一份于4℃离心机中，1300g离心10分钟，取上层血浆样本；
33.4.取100ul步骤2得到的全血样本或步骤3得到的血浆样本，加入400ul结合缓冲液(50mm tris，10mm edta)和加入1mg磁性聚苯乙烯微球(直径1微米)，室温孵育10分钟；
34.5.磁分离后，去除上清液；
35.6.向底部磁珠沉淀中加入1ml清洗缓冲液(50mm tris，10mm edta)，涡旋震荡清洗5分钟，磁分离并去除上清液；
36.7.将步骤5中吸出的上清液，于4℃离心机中，1300g离心10分钟，观察样本溶血状态，结果如图1；
37.8.重复步骤6两次；
38.9.向最终得到的结合蛋白的磁珠沉淀中，加入蛋白电泳缓冲液并煮沸5分钟，磁分离后，上清液使用sds-page电泳检测，结果如图2；
39.10.向另一份平行制备的磁珠沉淀中，加入还原试剂三(2-羧乙基)膦、烷基化试剂氯乙酰胺及tris-hcl缓冲液，95℃度反应10分钟；
40.11.冷却至室温后，加入1.5ug胰蛋白酶，37℃酶解3小时；
41.12.加入终浓度1％的甲酸溶液，12,000g离心5分钟，将上清液加入预活化的sdb除盐柱，离心使酶解后肽段吸附在sdb柱上；
42.13.清洗sdb柱数次后，解吸附得到纯化的肽段溶液；
43.14.将纯化肽段冷冻干燥后，于-20℃保存；
44.15.使用上机缓冲液复溶后，使用纳升级高效液相色谱串联质谱进行dia数据采集；
45.16.使用spectronaut软件对质谱数据进行抽提，获得蛋白定性定量结果。
46.17.三个样本的全血或血浆蛋白组质谱鉴定结果见表1：
47.表1质谱鉴定的全血/血浆蛋白数量
[0048] proteingroupspeptides原始血浆3081852血浆提取后305318817全血提取后326019325
[0049]
将全血和血浆中鉴定到的蛋白进行共鉴定分析和定量相关性分析，结果如图3和图4；结论：
[0050]
1)通过图1，可以看出处理后的全血样本经离心分离血细胞层后，上清溶液为无色澄清透明，说明血细胞完整未破坏，证明了缓冲液成分可以有效保护血细胞；
[0051]
2)通过图2，可以看出本发明方法能够较好去除高丰度蛋白；
[0052]
3)通过表1，未经处理的血浆样本中仅能鉴定到约300个蛋白，经相同方法平行分析的血浆和全血样本中蛋白鉴定数为3000以上、肽段数19000左右，表明同一人同次采血的样本经本发明方法处理后，全血和血浆蛋白组信息量基本相当；
[0053]
4)通过图3和图4，94％的血浆蛋白均可以直接在全血样本中鉴定到，且共鉴定蛋白定量相关性达到0.9，可以看出通过本发明方法直接富集全血蛋白与血浆蛋白定量基本一致。
[0054]
实施例2
[0055]
1.分别采集edta和枸橼酸钠抗凝全血，每份样本各分装为5份，分别于4℃保存0(2个重复)、2、4、8小时后，转移至低温冰箱冷冻保存；
[0056]
2.从冰箱中取出冷冻全血标本，解冻后充分混匀标本；
[0057]
3.取100ul全血样本，按照实施例1相同步骤进行富集、清洗、还原烷基化、酶解、脱盐、干燥、复溶、质谱检测和数据分析；
[0058]
4.其中，1个0小时冻存样本在清洗步骤后得到的结合蛋白的磁珠沉淀中，加入蛋白电泳缓冲液并煮沸5分钟，磁分离后，上清液使用sds-page电泳检测，结果如图2；
[0059]
5.两组样本的蛋白组质谱鉴定结果见表2；
[0060][0061]
将两组样本的蛋白组质谱结果分别进行组内相关性分析，结果见图5
[0062]
结论：
[0063]
1)通过图2，可以看出本发明方法可以较好的去除全血样本中的高丰度蛋白；
[0064]
2)通过表2和图5，采集后0、2、4、8小时后冷冻保存，再经本发明方法富集后，添加edta或枸橼酸钠的全血样本均能鉴定到》3000个蛋白和18000肽段，且蛋白鉴定数量差异很小，各时间点间蛋白定量相关性》0.9，表明本发明方法对两种临床常见的抗凝剂均有良好适用性，且采集后8小时内冷冻保存稳定性良好。
[0065]
实施例3
[0066]
1.采集3例edta抗凝静脉全血，每份样本各分装为4份，分别于4℃保存8-72小时后，转移至低温冰箱冷冻保存；
[0067]
2.从冰箱中取出冷冻全血标本，解冻后充分混匀标本；
[0068]
3.取100ul全血样本，按照实施例1相同步骤进行富集、清洗、还原烷基化、酶解、脱盐、干燥、复溶、质谱检测和数据分析；
[0069]
4.三组样本的蛋白组质谱鉴定结果见表3；
[0070]
表3三组不同时间冻存的edta抗凝静脉全血蛋白鉴定数量
[0071][0072]
将三组样本的蛋白组质谱结果分别进行组内蛋白定量值相关性分析，结果见图6。
[0073]
结论：
[0074]
通过表3和图6，采集后8、24、48、72小时后再冷冻保存的抗凝全血样本，经本发明方法处理后，三组样本均能稳定鉴定到》3000个蛋白和》18000肽段，且不同时间点样本间蛋白/肽段鉴定数差异较小，蛋白定量相关性》0.9，表明采血后72小时内冻存后再经过本发明方法处理均有良好的稳定性，适用于采血后未能及时处理的样本。