一种基于1-十五烯物质含量评判大曲曲虫活跃度的方法与流程

1.本技术涉及曲虫活跃度检测技术领域，尤其是涉及一种基于1-十五烯物质含量评判大曲曲虫活跃度的方法。


背景技术：

2.大曲是酿酒过程中的重要原料，通常需贮存一定时间后才能投入生产使用。大曲在贮存过程中会受到曲虫啃食，因曲虫啃食造成的损失可达大曲总量的10％～20％，曲虫数量过多不仅会减轻大曲重量，还会降低大曲品质，影响大曲微生物、糖化力、液化力等指标。在大曲中发现的曲虫有赤拟谷盗、咖啡豆象、谷蠹、扁盗、长头谷盗等。为了能够对大曲的质量进行评价，同时采取相对的防虫措施，需要对大曲曲虫进行活跃度分析。
3.在曲虫活跃度分析上，可根据曲虫数量多少进行评判，曲虫数量高低在粮食行业中主要通过清数虫体或虫卵数量来反映，但观察清数虫体数量耗时长。现有技术中常用的虫卵检测方法较多，包括浮选法、几丁质法、染色法等，其中用浮选法检测率较低，几丁质检测法只能定性，染色法在面粉中应用较多，但也存在一定的误差。
4.鉴于此，如何获得一种能够准确、快速、便捷的评判大曲中曲虫活跃度的方法，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本技术提供一种基于1-十五烯物质含量评判大曲曲虫活跃度的方法。
6.本技术提供一种基于1-十五烯物质含量评判大曲曲虫活跃度的方法，采用如下的技术方案：
7.一种基于1-十五烯物质含量评判大曲曲虫活跃度的方法，包括以下步骤：
8.(1)称取大曲样品，向所述大曲样品中加入提取溶剂浸提，得到浸提液；将所述浸提液送入气相色谱质谱联用仪检测1-十五烯含量；
9.(2)根据所述步骤(1)检测的所述1-十五烯含量评判大曲曲虫活跃度。
10.优选的，所述步骤(2)中，所述根据所述步骤(1)检测的所述1-十五烯含量评判大曲曲虫活跃度包括：
11.当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫不活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫不活跃期，所述大曲曲虫不活跃期所属区间为小于等于1.84mg/g；
12.当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫一般活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫一般活跃期，所述大曲曲虫一般活跃期所属区间为大于1.84mg/g，小于等于2.84mg/g；
13.当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫较活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫较活跃期，所述大曲曲虫较活跃期所属区间为大于2.84mg/g，小于等于3.84mg/g；
14.当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫非常活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫非常活跃期，所述大曲曲虫非常活跃期所属区间为大于3.84mg/g，小于等于6.00mg/g；
15.其中所述大曲曲虫不活跃期所属区间、大曲曲虫一般活跃期所属区间、大曲曲虫较活跃期所属区间以及大曲曲虫较活跃期所属区间由以下方法获得：
16.按照所述步骤(1)检测含有不同曲虫虫卵数的大曲中的1-十五烯含量，将所述1-十五烯含量与相应的曲虫虫卵数建立线性关系；
17.根据所述大曲曲虫虫卵数将大曲曲虫活跃度分为四个等级；
18.获得对应于所述四个等级的所述1-十五烯含量的所属区间；
19.优选的，所述四个等级为：大曲曲虫不活跃期、大曲曲虫一般活跃期、大曲曲虫较活跃期、大曲曲虫非常活跃期。
20.优选的，所述大曲曲虫不活跃期的虫卵数量为小于等于4000个/g；所述大曲曲虫一般活跃期的虫卵数量为大于4000个/g且小于等于8000个/g；所述大曲曲虫较活跃期的虫卵数量为大于8000个/g且小于等于12000个/g；所述大曲曲虫非常活跃期的虫卵数量为大于12000个/g。
21.优选的，所述步骤(1)中，所述称取大曲样品的质量为1～3g；
22.优选的，所述步骤(1)中，所述称取大曲样品的质量为1g。
23.优选的，所述步骤(1)中，所述提取溶剂为乙醚、乙酸乙酯、戊烷、正己烷中的一种或几种混合。
24.优选的，所述步骤(1)中，所述提取溶剂为正己烷，所述大曲样品的质量与所述正己烷的体积之比为1：(2～4)；
25.优选的，所述大曲样品的质量与所述正己烷的体积之比为1：2。
26.优选的，所述步骤(1)中，向所述大曲样品中加入提取溶剂浸提，得到浸提液包括：向所述大曲样品中加入提取溶剂，先涡旋振荡1～3min，再在功率为120w的超声仪中超声20min，取上清液得到浸提液。
27.优选的，所述步骤(1)中，将所述浸提液送入气相色谱质谱联用仪检测1-十五烯含量包括：将所述浸提液经过0.22μm滤膜过滤后再送入气相色谱质谱联用仪检测1-十五烯含量。
28.优选的，所述步骤(1)中，所述气相色谱参数设置为：色谱柱为hp-5(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，进样口温度为240～260℃，载气为氦气，载气流速为1～3ml/min，采用不分流进样；
29.程序升温为：初始温度为40℃，保持1～2min，再以4～6℃/min升温至130℃，保持0min，再以25～35℃/min升温至230℃，保持0min；
30.优选的，所述步骤(1)中，所述气相色谱参数设置为：色谱柱为hp-5(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，进样口温度为250℃，载气为氦气，载气流速为1ml/min，采用不分流进样；
31.程序升温为：初始温度为40℃，保持1min，再以5℃/min升温至130℃，保持0min，再以30℃/min升温至230℃，保持0min。
32.优选的，所述步骤(1)中，所述质谱参数设置为：离子源温度为225～235℃，四级杆温度为145～155℃，ei源为70ev，采集模式为全扫描，质量范围为35～500amu，溶剂延迟
3.2min；
33.优选的，所述步骤(1)中，所述质谱参数设置为：离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，ei源为70ev，采集模式为全扫描，质量范围为35～500amu，溶剂延迟3.2min。
34.本技术具有以下有益技术效果：
35.(1)本技术通过检测获得的大曲样品中1-十五烯的含量，判断大曲样品的曲虫活跃度，从而对大曲的质量进行评价，能够大幅缩短检测大曲样品曲虫活跃度的时间；
36.(2)本技术通过提取溶剂使大曲样品中的1-十五烯溶于提取溶剂中，再使用气相色谱质谱联用仪准确检测大曲中的1-十五烯物质含量，能够更加准确的评判大曲样品的曲虫活跃度，提高了大曲样品曲虫活跃度的准确度。
附图说明
37.图1是本技术中1-十五烯含量与虫卵个数的线性曲线图；
38.图2是实施例2中不同提取溶剂的峰面积对比图；
39.图3是实施例3中不同大曲样品和正己烷质量体积比的峰面积对比图；
40.图4是实施例4中不同超声功率和超声时间的峰面积对比图；
41.图5是实施例5中采用hp-5色谱柱检测的总离子流图；
42.图6是实施例5中采用db-wax ui色谱柱检测的总离子流图。
具体实施方式
43.大曲曲虫活跃度分析可用于评价大曲质量，同时也是工作人员进行相应防虫措施的重要依据。在曲虫活跃度分析上，可根据曲虫数量多少进行评判，曲虫数量高低在粮食行业中主要通过清数虫体或虫卵数量来反映，但观察清数虫体数量耗时长，且极容易出现系统误差。现有技术中常用的虫卵检测方法较多，包括浮选法、几丁质法、染色法等，其中用浮选法检测率较低，几丁质检测法只能定性，染色法在面粉中应用较多，但也存在一定的误差。发明人在研究中发现，大曲曲虫中主要为赤拟谷盗，而赤拟谷盗的分泌物为1-十五烯，采用气相色谱质谱联用仪检测大曲中1-十五烯的含量，通过前处理和仪器参数的条件优化，实现了对大曲中1-十五烯含量的准确定量分析。同时发现了大曲中1-十五烯含量与大曲曲虫活跃度之间存在线性关系，从而建立了一种基于1-十五烯物质含量评判大曲曲虫活跃度的方法。
44.以下结合实施例对本技术作进一步说明。
45.试剂：1-十五烯标准品(纯度≥99％)，购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；正丁醇(分析纯)、乙醚(分析纯)，购于国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)、乙醇(色谱纯)、正己烷(色谱纯)，购于美国tedia公司；乙酸乙酯(色谱纯)，购于德国merck公司。
46.仪器：气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)，型号为7890b gc-5977b ms，购于美国安捷伦公司；db-waxui毛细管色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)、hp-5毛细管色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，购于美国安捷伦公司；branson 3210超声波清洗仪，功率120w购于美国bransonic公司；cpx8800h-c超声清洗仪，功率280w，购于美国bransonic公司。
47.实施例1
48.(1)称取大曲样品，向所述大曲样品中加入提取溶剂浸提，得到浸提液；将所述浸
提液送入气相色谱质谱联用仪检测1-十五烯含量。
49.称取1g大曲样品于带刻度的5ml离心管中，向离心管中加入正己烷，大曲样品的质量与正己烷的体积之比具体选择为1:2，即正己烷的体积为2ml。涡旋振荡1min，然后在功率为120w的超声仪中超声20min，取上清液得到浸提液，将浸提液经过0.22μm滤膜过滤后送入气相色谱质谱联用仪进行检测。
50.气相色谱参数具体设置为：色谱柱为hp-5(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，进样口温度为250℃，载气为氦气，载气流速为1ml/min，采用不分流进样；
51.程序升温具体选择为：初始温度为40℃，保持1min，再以5℃/min升温至130℃，保持0min，再以30℃/min升温至230℃，保持0min。
52.质谱参数具体设置为：离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，ei源为70ev，采集模式为全扫描，质量范围为35～500amu，溶剂延迟3.2min。
53.标准溶液的配制：将1-十五烯标准品溶于正己烷中配置成浓度梯度为0.128mg/l、0.256mg/l、0.513mg/l、1.026mg/l、2.051mg/l、4.103mg/l的标准溶液，按上述方法对不同浓度的标准溶液进行测定。以1-十五烯峰面积为纵坐标(y)，标准溶液的浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。以信噪比s/n等于3为标准，计算本实施中检测1-十五烯的检测限(lod)，以信噪比s/n等于10为标准，计算本实施中检测1-十五烯的定量限(loq)，结果见表1。
54.表1 标准曲线参数信息
[0055][0056]
如表1所示，标准曲线的相关系数r2＞0.99，表明在该浓度梯度内，1-十五烯峰面积与标准溶液浓度之间呈现出良好的线性关系，标准曲线能够用于1-十五烯的定量分析。
[0057]
检测方法评价
[0058]
以相对标准偏差(rsd)检验本技术大曲中1-十五烯检测方法的精密度，以加标回收率验证本技术大曲中1-十五烯检测方法的准确度。
[0059]
加标回收率计算方法为：按照上述步骤取3个大曲样品，分别在3个大曲样品中加入定量的1-十五烯；另取3个大曲样品，不加入1-十五烯，作为对比样品。按照上述检测步骤分别检测加入定量的1-十五烯的大曲样品和对比样品。根据检测结果计算加标回收率。
[0060]
日内相对标准偏差计算方法为：取3个大曲样品，分别将3个大曲样品按照上述步骤得到浸提液，将浸提液经过0.22μm滤膜过滤后送入气相色谱质谱联用仪进行检测，根据检测结果计算日内标准偏差。
[0061]
日间相对标准偏差计算方法为：取3个大曲样品，分别将3个大曲样品按照上述步骤得到浸提液，将浸提液经过0.22μm滤膜过滤后在4℃下保存一天，再送入气相色谱质谱联用仪进行检测，根据检测结果计算日间标准偏差。检测结果如表2所示。
[0062]
表2 准确度和精密度数据
[0063][0064]
从表2可以看出，本技术中1-十五烯的加标回收率平均值为100.34％，表明本技术检测大曲中1-十五烯的方法的准确度很高，检测结果可靠，能够对大曲中1-十五烯进行准确定量，从而能够更加准确可靠的评判大曲曲虫活跃度。日内相对标准偏差为2.98％，日间相对标准偏差为6.43％，表明本技术检测大曲中1-十五烯的方法稳定性好，误差较小。
[0065]
(2)根据上述步骤(1)检测的1-十五烯含量评判大曲曲虫活跃度。
[0066]
按照上述步骤(1)检测含有不同曲虫虫卵数的大曲中的1-十五烯含量，将1-十五烯含量与相应的曲虫虫卵数建立线性关系；
[0067]
根据大曲曲虫虫卵数将大曲曲虫活跃度分为四个等级；
[0068]
获得对应于四个等级的1-十五烯含量的所属区间；
[0069]
大曲曲虫活跃度四个等级为：大曲曲虫不活跃期、大曲曲虫一般活跃期、大曲曲虫较活跃期、大曲曲虫非常活跃期。
[0070]
具体的，按照上述步骤(1)检测不同大曲曲虫活跃度的大曲，从中发现1-十五烯含量与大曲中虫卵数量呈显著正相关，以此确定1-十五烯物质可作为评价曲虫活跃度的特征性指标。应用spss软件对不同曲虫虫卵数的大曲中1-十五烯含量数据进行统计分析，以大曲中1-十五烯含量为纵坐标(y)，以大曲中虫卵个数为横坐标(x)，建立线性关系，线性曲线图如图1所示，皮尔逊相关系数为0.967，呈现良好的线性关系。
[0071]
大曲曲虫不活跃期的虫卵数量为小于等于4000个/g；大曲曲虫一般活跃期的虫卵数量为大于4000个/g且小于等于8000个/g；大曲曲虫较活跃期的虫卵数量为大于8000个/g且小于等于12000个/g；大曲曲虫非常活跃期的虫卵数量为大于12000个/g。
[0072]
当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫不活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫不活跃期，所述大曲曲虫不活跃期所属区间为小于等于1.84mg/g；
[0073]
当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫一般活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫一般活跃期，所述大曲曲虫一般活跃期所属区间为大于1.84mg/g，小于等于2.84mg/g；
[0074]
当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫较活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫较活跃期，所述大曲曲虫较活跃期所属区间为大于2.84mg/g，小于等于3.84mg/g；
[0075]
当测得的所述1-十五烯含量在大曲曲虫非常活跃期所属区间时，所述大曲曲虫活跃度判定为大曲曲虫非常活跃期，所述大曲曲虫非常活跃期所属区间为大于3.84mg/g，小于等于6.00mg/g。
[0076]
在以1-十五烯含量作为评价曲虫活跃度的特征性指标时，需要对大曲中的1-十五烯含量进行准确可靠的检测，检测的1-十五烯含量才能用以准确评判大曲曲虫活跃度。才能够根据大曲曲虫活跃度对大曲质量进行评价，以及采取相应的防虫措施。
[0077]
评判方法验证
[0078]
随机选取两份不同大曲样品，按照上述方法测定大曲样品中1-十五烯含量，根据1-十五烯含量判定大曲样品的曲虫活跃度。再人工清数大曲样品中曲虫虫卵个数，根据虫卵个数判定大曲样品的曲虫活跃度，比较二者的评判结果，数据结果如表3所示。
[0079]
表3 大曲样品活跃度验证对比数据
[0080][0081]
从表3可以看出，样品1按照1-十五烯含量判定的大曲曲虫活跃度为大曲曲虫不活跃期，而按照清数虫卵数的判定结果也为大曲曲虫不活跃期。样品2按照1-十五烯含量判定的大曲曲虫活跃度为大曲曲虫非常活跃期，而按照清数虫卵数的判定结果也为大曲曲虫非常活跃期。从中可以看出，采用1-十五烯含量评判大曲活跃度的准确率与清数大曲虫卵的准确率一致，本技术利用大曲中1-十五烯含量评判大曲活跃度的的方法具有较高的准确率。
[0082]
传统的数虫法和染色法需要2名以上的工作人员协同作业，且需要3～8h才能对大曲曲虫活跃度进行评判，还容易出现因人为失误引起的误差。本技术大曲曲虫活跃度评判方法仅需一名工作人员，在1h以内即可完成对大曲样品的曲虫活跃度评判，本技术能够大幅提升工作效率，缩短评判时间；同时还能减小误差，提升评判曲虫活跃度的准确性。
[0083]
实施例2探究不同提取溶剂对检测结果的影响
[0084]
本实施例为探究不同提取溶剂对检测结果的影响，不同提取溶剂包括：乙醇(vol为53％)、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、戊烷、正己烷。分别采用不同提取溶剂对大曲中1-十五烯进行浸提，其余检测步骤与实施例1相同。不同提取溶剂的峰面积对比图如图2所示。从图2可以看出，采用乙醇(vol为53％)和正丁醇作为提取溶剂时，无法检测到大曲中的1-十五烯。采用乙醚、乙酸乙酯和戊烷作为提取溶剂时，1-十五烯的峰面积较低，采用正己烷作为提取溶剂时，1-十五烯的峰面积最高，这表明采用正己烷作为提取溶剂对大曲中1-十五烯的提取效果最好。
[0085]
实施例3探究不同大曲样品和正己烷质量体积比对检测结果的影响
[0086]
本实施例为探究不同大曲样品和正己烷质量体积比对检测结果的影响，不同大曲样品和正己烷质量体积比包括：1:2、1:4、1:5、1:10，即正己烷的质量分别为2ml、4ml、5ml、10ml。分别按照不同大曲样品和正己烷质量体积比对大曲中的1-十五烯进行检测，其余检测步骤与实施例1相同。不同大曲样品和正己烷质量体积比的峰面积曲线图如图3所示，单位体积峰面积(即g/ml下的峰面积)柱状图如图3所示。从图3曲线图可以看出，随着大曲样品和正己烷质量体积比增加，1-十五烯浓度被稀释，1-十五烯的峰面积逐渐降低。从柱状图可以看出，大曲样品和正己烷质量体积比为1:4和1:10时，1-十五烯单位体积峰面积最高，这表明大曲样品和正己烷质量体积比为1:4或1:10时，对大曲样品中的1-十五烯提取效果最好。因大曲中目标化合物的含量较低，为提高检出限、定量的准确性、方法的经济性与环
保性，选择大曲样品和正己烷质量体积比为1:2作为最优选择。
[0087]
实施例4探究不同超声功率和超声时间对检测结果的影响
[0088]
本实施例为探究不同超声功率和超声时间对检测结果的影响，采用120w超声仪分别对大曲样品超声5min、10min、15min、20min、30min，检测不同超声时间下大曲中1-十五烯含量。采用280w超声仪分别对大曲样品超声5min、10min、15min、20min、30min，检测不同超声时间下大曲中1-十五烯含量。两种不同超声功率的超声仪分别对大曲样品超声5min、10min、15min、20min、30min的检测结果如图4所示，从图中可以看出，采用280w超声仪在不同超声时间条件下，1-十五烯的峰面积没有明显变化，但是采用120w超声仪超声20min时1-十五烯的峰面积明显高于其他超声时间的峰面积。这表明通过使用不同功率的超声仪以及调节超声时间，能够显著增加大曲中1-十五烯的检测效果，使检测结果更加准确。
[0089]
实施例5探究不同色谱柱对检测结果的影响
[0090]
本实施例为探究不同色谱柱对检测结果的影响，不同色谱柱包括：非极性柱(hp-5)和极性柱(db-wax ui)，二者的色谱柱参数均为30m
×
0.25mm
×
0.25μm。采用hp-5色谱柱检测的总离子流图如图5所示。采用db-wax ui色谱柱检测的总离子流图如图6所示。结合图5和图6可以看出，采用hp-5色谱柱和db-wax ui色谱柱都能够对1-十五烯实现较好的分离，但是采用hp-5色谱柱时，1-十五烯的响应更高，且杂峰更少，对大曲中1-十五烯的检测效果更好。
[0091]
本技术通过在检测大曲中1-十五烯时，对各种实验条件以及参数的优化，从而建立了一种准确度更高，检测效果更好的大曲中1-十五烯的检测方法，采用该方法对大曲中1-十五烯的含量进行检测，再通过大曲中1-十五烯的含量评判大曲活跃度，能够更加准确的评判大曲样品的曲虫活跃度，同时能够大幅缩短检测大曲样品曲虫活跃度的时间。
[0092]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。