一种同时检测两种真菌毒素的上转换纸基适配体传感器

1.本发明涉及一种同时检测两种真菌毒素的上转换纸基适配体传感器，尤其是一种同时可视化检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素a的双色上转换纸基适配体传感器，属于荧光纸基生物传感领域。


背景技术：

2.玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)是两种经常在玉米、小麦等农产品中同时存在的真菌毒素。其中，zen可导致动物雌激素水平紊乱，从而损伤生殖系统，而ota具有较强的致畸、致癌、致突变和免疫抑制等毒害作用。食品安全国家标准gb 2761-2017中明确规定谷物及其食品中zen及ota的最高残留限量分别为60μg/kg和5μg/kg。有研究表明，受zen和ota同时污染的谷物可对人类和动物产生协同和加合的毒理学效应，从而导致更高的安全风险。因此，开发一种可同时检测食品中zen和ota的方法具有重要的实践意义。
3.目前，传统的方法比如高效液相色谱(hplc)和液相色谱-串联质谱(lc-ms)已被用于真菌毒素的多重检测。尽管它们具有较高的灵敏度和准确性，但，相对耗时，依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作，也无法实现现场快速检测。
4.近年来，随着生物识别分子及纳米材料的不断发展，基于各种信号的生物传感方法不断被开发用于真菌毒素的多重检测。然而这些方法仍面临操作步骤繁琐、信号获取依赖庞大的设备等问题。例如，cn 108927079 a披露了真菌毒素通量检测用上转换磁性编码微球及其制备方法，其使用昂贵的抗体作为识别分子，且试剂和样品消耗量大、反应过程多、操作步骤繁琐、检测时间较长，需要使用价格昂贵、大型的荧光显微镜获取信号。
5.纸基传感器作为一种受欢迎的现场即时诊断工具，具有样品消耗量少、制作成本低和操作方便等特点，已经与各种信号结合并成功应用于生化分析、医学诊断、环境监测和食品安全分析等领域。jiang等人结合基于纳米金的比色竞争免疫分析开发了一种纸基分析装置，用于检测食品和饲料中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。其中，荧光纸基传感器是以荧光为输出信号的纸基分析技术。
6.但目前，尚未有基于荧光纸基传感器用于同时检测多个真菌毒素的报道，特别是基于多色上转换纳米材料为荧光标记。ye等人利用量子点包覆的介孔二氧化硅纳米颗粒(qds/msn)和氧化石墨烯开发了一种荧光纸基设备用于同时检测三种癌细胞。但，所用量子点为单色量子点，利用荧光分光光度计进行定量，无法实现现场快速检测。与荧光染料和量子点等相比，上转换纳米材料具有光稳定性好、抗光漂白及无自发荧光干扰等优点，在复杂食品基质中具有应用优势，可提高检测灵敏度。cn 105675563 a披露了一种快速定量检测可卡因的上转换荧光纸基分析设备，但该方法使用单色上转换、需要分别将上转换纳米材料和适配体共价连接固定在滤纸上，且上样和检测均在一个区域，无法实现对多个靶标的同时检测。


技术实现要素：

7.本发明提供用于同时检测玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的双色上转换纸基适配体传感器，以双色上转换纳米粒子为荧光标记，以cu-tcpp纳米片为淬灭剂，包括以下组成部分：检测区1、检测区2、样品区，所述检测区1有apt1-gucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针，用于响应zen浓度变化；所述检测区2有apt2-bucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针，用于响应ota浓度变化；所述样品区用于滴加待测样品；所述用于同时检测玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的双色上转换纸基适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)制备适配体修饰双色上转换纳米粒子apt1-gucnps和apt2-bucnps：
9.①
制备双色上转换纳米粒子核心nayf4:yb,er和nayf4:yb,tm，并包覆外壳以得到核壳型双色上转换纳米粒子gucnps和bucnps；
10.具体的，
11.称取ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ercl3·
6h2o或tmcl3·
6h2o，然后加入油酸(oa)和十八烯(1-ode)，在n2气氛保护下搅拌均匀，加热保温；自然冷却后，逐滴加入含naoh和nh4f的甲醇混合溶液，逐渐升温反应，反应结束后，待冷却至室温，加入乙醇进行沉淀，再用环己烷-乙醇混合物洗涤沉淀3次，然后将沉淀重分散于环己烷；
12.称取ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ndcl3·
6h2o，加入oa和1-ode，在n2气氛保护下搅拌均匀，加热保温；冷却至室温后，将上述得到的nayf4:yb,er或nayf4:yb,tm环己烷分散液逐滴加入，加热至100℃保持20min，冷却至室温后，逐滴加入含有naoh和nh4f的甲醇混合溶液，逐渐升温反应，反应结束后，待冷却至室温，加入乙醇进行沉淀，再用环己烷-乙醇混合物洗涤沉淀3次，然后将沉淀重分散于环己烷；
13.②
用聚乙烯亚胺修饰gucnps和bucnps得到pei-gucnps和pei-bucnps
14.将
①
中得到的gucnps和bucnps分别超声分散于dmso，逐滴加入溶于dmso的pei溶液，然后加热，冷却至室温后用超纯水清洗得到pei-gucnps和pei-bucnps；
15.③
制备apt1-gucnps和apt2-bucnps
16.取sulfo-smcc与pei-gucnps或pei-bucnps混合，避光孵育，清洗并重新分散于hepes缓冲液，然后加入zen适配体(apt1)或ota适配体(apt2)后，混匀过夜孵育，收集并用超纯水清洗后，即可得到apt1-gucnps或apt2-bucnps；
17.(2)淬灭剂cu-tcpp纳米片的制备：
18.称取cu(no3)2·
3h2o和pvp，加入三氟乙酸和dmf-乙醇混合液，搅拌溶解得到混合物1；将tcpp溶解于dmf-乙醇混合液，将其逐滴加入到混合物1中，超声后80℃水浴，离心、收集沉淀并用乙醇清洗；
19.(3)疏水纸基的制备：
20.将打印有图案的滤纸经200℃加热1h以构建疏水载体，自然冷却后，得到疏水纸基；
21.(4)双色上转换纸基适配体传感器的制备：
22.将apt1-gucnps和apt2-bucnps分别与淬灭剂cu-tcpp纳米片孵育，从而分别得到apt1-gucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针和apt2-bucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针；
23.往疏水纸基的检测区1和检测区2分别加入apt1-gucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针和apt2-bucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针，室温自然干燥后即可。
24.在本发明的一种实施方式中，双色上转换纸基适配体传感器的制备方法包括以下步骤：
25.(1)适配体修饰双色上转换纳米粒子apt1-gucnps和apt2-bucnps的制备：
26.①
制备双色上转换纳米粒子核心nayf4:yb,er和nayf4:yb,tm，并包覆外壳以得到核壳型双色上转换纳米粒子gucnps和bucnps；
27.具体的，
28.s1：称取ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ercl3·
6h2o或tmcl3·
6h2o加入到三口烧瓶中，然后加入油酸oa和十八烯1-ode，在n2气氛保护下搅拌均匀，并加热至160℃保持～60min；自然冷却后，逐滴加入含naoh和nh4f的甲醇混合溶液，反应40min后继续升温至70℃保持30min，再升温至110℃保持40min，最后加热至300～310℃并保持～1.5h；待冷却至室温后，加入乙醇沉淀材料，再用环己烷-乙醇混合物洗涤3次，重分散于环己烷得到nayf4:yb,er或nayf4:yb,tm环己烷分散液；
29.s2：称取ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ndcl3·
6h2o加入到三口烧瓶中，加入oa和1-ode，在n2气氛保护下搅拌均匀，然后加热到160℃保持60min；冷却至室温后，将s1中得到的nayf4:yb,er或nayf4:yb,tm环己烷分散液逐滴加入，加热至100℃保持20min，冷却至室温后，逐滴加入含有naoh和nh4f的甲醇混合溶液，后续步骤同s1；
30.②
用聚乙烯亚胺修饰gucnps和bucnps得到pei-gucnps和pei-bucnps
31.具体的，
32.将50mg核壳结构的gucnps或bucnps超声分散于25ml dmso，逐滴加入30mg/ml溶于dmso的pei溶液，然后95℃加热回流，冷却至室温后用超纯水清洗3次；
33.③
用适配体修饰pei-gucnps和pei-bucnps以得到apt1-gucnps和apt2-bucnps
34.具体的，
35.取200μl 2mg/ml的sulfo-smcc与800μl含有1mg pei-gucnps或pei-bucnps的hepes缓冲液均匀混合，25℃避光孵育2h后，收集清洗3次并重新分散于1ml hepes缓冲液，然后加入1～2nmol zen适配体(apt1)或ota适配体(apt2)后，混匀过夜孵育，收集并用超纯水清洗3次后，即可得到apt1-gucnps和apt2-bucnps；
36.(2)淬灭剂cu-tcpp纳米片的制备：
37.称取3.6mg cu(no3)2·
3h2o和10.0mg pvp加入到20ml带盖玻璃小瓶，加入10μl三氟乙酸和12ml dmf-乙醇(3:1，v:v)混合液，搅拌溶解得到混合物1；称取4.0mg tcpp溶解于4ml dmf-乙醇混合液，将其逐滴加入到混合物1，超声10min后80℃水浴3h，离心收集用乙醇清洗2次即可；
38.(3)疏水纸基的制备：
39.用powerpoint绘制图案后通过激光打印机打印在滤纸上，之后经200℃加热1h以构建疏水载体，自然冷却后，干燥保存备用；
40.(4)双色上转换纸基适配体传感器的制备：
41.往疏水纸基的检测区1和检测区2分别加入1～2μl提前孵育组装好的apt1-gucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针和apt2-bucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针，室温自然干燥后即可。
42.本发明提供同时检测玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的方法，是利用所
述用于同时检测玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的双色上转换纸基适配体传感器，待测样品与双色上转换纸基适配体传感器接触后，经激光照射发出荧光，通过智能便携设备(例如手机)采集荧光图片，同时用智能便携设备的颜色识别软件分析其rgb信号，利用rgb信号的值来实现对两种真菌毒素(zen和ota)的同时可视化检测。
43.所述同时检测玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的方法，主要包括以下步骤：
44.(1)制作标准工作曲线
45.向双色上转换纸基适配体传感器的样品区分别加入3.0～3.5μl含不同浓度zen和ota的混合溶液，孵育30～40min后，用808nm激光照射检测区，并用智能手机拍摄荧光图片，随后用颜色识别软件提取图片rgb通道值，最后分别以检测区1绿色荧光图片的g通道相对值(δg)和检测区2蓝色荧光图片的b通道相对值(δb)与zen和ota浓度的对数值绘制标准工作曲线。
46.(2)处理待测样品
47.准确称取10.0g待测样品(例如市售玉米粉样品)，加入25ml甲醇/水(7:3，v/v)混合溶液，混匀后分别加入不同浓度的don标准溶液，充分混匀并剧烈振荡提取10min，接着通过滤纸过滤收集滤液，待测；
48.(3)检测
49.检测步骤与(1)相同，最终得到zen和ota对应的δg和δb值大小；
50.(4)计算玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)含量或浓度
51.将(3)中得到的δg和δb值代入到(1)中建立的标准工作曲线方程，从而计算得到样品中zen和ota的浓度。
52.[有益效果]
[0053]
本发明通过将多色上转换荧光分析与便携式纸基智能传感技术相结合，有望为在复杂食品基质中多种真菌毒素的同时快速检测提供有力的工具。
[0054]
本发明具有试剂消耗量小、检测成本低、灵敏度高和效率高等优点，在复杂食品基质多种真菌毒素的同时快速检测中具有巨大应用潜力。
[0055]
利用上转换发光的多色可调性，只需更换激活离子即可获得不同颜色发光的上转换纳米粒子，相互之间无光谱串扰。相比于单色荧光标记的多重检测，用多色上转换荧光分别标记不同的分析物，并进一步结合多通道纸基分析，可以很容易实现对多种真菌毒素的高分辨率多色荧光可视化同时检测。然而，基于多色上转换的多通道(即单上样区-多检测区)纸基传感器多个检测区之间的距离将对较远，仅用一个近红外激光源难以实现同时激发多个位置的荧光信号。本发明为了解决这一难题，采用双近红外激光源同时激发两个检测区，实现了基于多色上转换发光的双通道纸基传感器同时检测两种真菌毒素。
附图说明
[0056]
图1为双色上转换纸基适配体传感器的构建及检测原理图。
[0057]
图2为(a)nayf4:yb,er核心、(b)核壳gucnps、(d)nayf4:yb,tm核心和(e)核壳bucnps的tem图片以及(c)核壳gucnps和(f)核壳bucnps的hr-tem图片。
[0058]
图3为核壳gucnps和核壳bucnps的xrd光谱和ft-ir图谱。
[0059]
图4为两种pei-ucnps和apt-ucnps的紫外可见吸收光谱，适配体初始溶液和反应上清的紫外可见吸收光谱，两种pei-ucnps和apt-ucnps的zeta电位。
[0060]
图5为cu-tcpp纳米片的表征结果：(a)tem图片、(b)xrd图谱、(c)紫外可见吸收光谱、(d)ft-ir光谱。
[0061]
图6为加入不同浓度zen和ota时纸基传感器的荧光图像以及荧光图像的δg值和δb值与zen和ota浓度对数之间的标准曲线。
[0062]
图7为特异性分析。
具体实施方式
[0063]
本方法的具体原理如下：
[0064]
如图1所示，首先，将预先组装好的apt1-gucnps/cu-tcpp纳米片复合物溶液和apt2-bucnps/cu-tcpp纳米片复合物溶液分别滴加到纸基检测区1和检测区2，以构建双色上转换纸基传感器。此时由于tcpp配体中含有共轭π-电子系统，cu-tcpp纳米片可通过π-π相互作用与apt1-gucnps和apt2-bucnps靠近，从而通过荧光共振能量转移使得上转换荧光被淬灭。当向样品区加入含有zen和ota的混合溶液时，两种真菌毒素会随着溶液在纸基上的毛细管力而迁移到两端检测区，并与各自适配体优先结合。此时适配体由于形成特定的三维结构而使得两种apt-ucnps与cu-tcpp纳米片之间的相互作用减弱，导致cu-tcpp纳米片远离，绿色和蓝色上转换荧光得以恢复。利用智能手机对检测区的荧光进行拍摄，然后用安装的颜色识别软件分析荧光图片的rgb通道值，并将其与毒素浓度相关联，从而实现对zen和ota的同时可视化检测。
[0065]
实施例1用于同时检测玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的双色上转换纸基适配体传感器的制备及表征
[0066]
(1)制备适配体修饰的双色上转换纳米粒子apt1-gucnps和apt2-bucnps：
[0067]
①
核壳型双色上转换纳米粒子gucnps和bucnps的制备
[0068]
采用高温热解法制备808nm激发的绿色上转换纳米粒子(gucnps)和蓝色上转换纳米粒子(bucnps)：
[0069]
以gucnps的制备为例，取总摩尔量为2mmol的ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ercl3·
6h2o加入到250ml三口烧瓶中，然后加入12ml oa和30ml 1-ode，在n2气氛保护及磁力搅拌下，将混合溶液于160℃加热60min直至形成澄清透明的亮黄色溶液，自然冷却至室温后，逐滴缓慢加入20ml含有0.2g naoh和0.2964g nh4f的甲醇溶液，搅拌反应40min后(此时形成白色浑浊的油酸中间体)，继续升温至70℃保持30min以除去甲醇，再升温至110℃保持40min进一步除去甲醇和多余的水分，最后加热至310℃并保持1.5h。冷却至室温后，加入15ml乙醇沉淀材料，9000r/min离心10min收集，用环己烷-乙醇混合物(1:4，v/v)超声洗涤3次后重分散于10ml环己烷中备用。
[0070]
然后，以上述制备得到的nayf4:18％yb,2％er为种子，通过外延生长法制备nayf4:18％yb,2％er@nayf4:10％yb,10％nd，具体步骤如下：取总摩尔量为2mmol的ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ndcl3·
6h2o加入到三口烧瓶中，然后依次加入12ml oa和30ml 1-ode，在n2气氛保护及磁力搅拌下，加热到160℃保持60min直至形成澄清透明的亮黄色溶液。冷却至室温后，将nayf4:yb,er核心逐滴缓慢加入，加热至100℃保持20min以除去环己烷，冷却至室
温后，逐滴缓慢加入20ml含有0.2g naoh和0.2964g nh4f的甲醇溶液，后续步骤同上。
[0071]
bucnps的制备方法与gucnps相同，只需在第一步中将18％ybcl3·
6h2o和2％ercl3·
6h2o换成30％ybcl3·
6h2o和0.5％tmcl3·
6h2o。
[0072]
②
用聚乙烯亚胺修饰gucnps和bucnps以得到pei-gucnps和pei-bucnps
[0073]
向100ml圆底烧瓶中加入50mg核壳oa-ucnps和25ml dmso，超声分散均匀后，在不断搅拌状态下，向上述溶液中逐滴缓慢加入5ml含有150mg pei的dmso溶液，然后升温至95℃，加热回流直至溶液变为淡黄色。冷却至室温后，将制备得到的pei修饰的上转换纳米粒子(pei-ucnps)离心收集，再用超纯水清洗3次，最后重分散于hepes缓冲液(10mm，ph 7.2)，4℃保存备用。
[0074]
③
用适配体修饰pei-gucnps和pei-bucnps以得到apt1-gucnps和apt2-bucnps zen适配体(apt1)序列为：sh-tca tct atc tat ggt aca tta cta tct gta atg tga tat g，ota适配体(apt2)序列为：sh-gat cgg gtg tgg gtg gcg taa agg gag cat cgg aca。
[0075]
取200μl 2mg/ml的sulfo-smcc(溶于hepes缓冲液)与800μl含有1mg pei-gucnps或pei-bucnps的hepes缓冲液均匀混合，25℃避光孵育2h后，9000r/min离心10min收集，再用hepes缓冲液清洗3次以确保去除多余的sulfo-smcc，然后将材料重新分散于1ml hepes缓冲液，加入2nmol zen适配体(apt1)或ota适配体(apt2)后，振荡分散混匀，25℃过夜孵育，最后通过离心收集并用超纯水清洗3次后，将得到的apt1修饰的gucnps(apt1-gucnps)和apt2修饰的bucnps(apt2-bucnps)重新分散备用。
[0076]
(2)淬灭剂cu-tcpp纳米片的制备方法如下：
[0077]
称取3.6mg cu(no3)2·
3h2o(0.015mmol)和10.0mg pvp加入到20ml带盖的玻璃小瓶中，然后加入10μl三氟乙酸(1.0m)和12ml dmf-乙醇(3:1，v:v)混合液，充分搅拌溶解。接着称取4.0mg tcpp(0.005mmol)溶解于4ml dmf-乙醇(3:1，v:v)混合液，在保持搅拌过程中将其逐滴加入到上述溶液中。将所得混合反应液超声10min，置于水浴锅中80℃加热3h。最后，将得到的红色纳米片溶液通过8000r/min离心10min收集，用乙醇清洗2次后，重分散于10ml乙醇中。
[0078]
(3)疏水纸基的制备方法如下：
[0079]
首先在电脑上用microsoft powerpoint 2021绘制图案，然后用激光打印机将图案打印在英国whatman 1号滤纸(用固体胶固定在a4纸表面)上。将印有图案的滤纸从a4纸表面取下后，置于高温烘箱中200℃加热1h，使碳粉充满滤纸厚度从而构建疏水载体。自然冷却后，将得到的疏水纸基置于干燥环境中保存备用。
[0080]
(4)双色上转换纸基适配体传感器的制备：
[0081]
将apt1-gucnps和apt2-bucnps分别与淬灭剂cu-tcpp纳米片孵育，从而分别得到apt1-gucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针和apt2-bucnps/cu-tcpp纳米片复合物探针；
[0082]
往上述制备好的疏水纸基的检测区1和检测区2分别加入1μl提前孵育组装好的apt1-gucnps/cu-tcpp纳米片复合物溶液和apt2-bucnps/cu-tcpp纳米片复合物溶液，经室温自然干燥后，即可得到一种即用型双色上转换纸基适配体传感器。
[0083]
(5)性能表征
[0084]
①
双色上转换纳米粒子的制备与改性表征
[0085]
利用tem、xrd、ft-ir对双色上转换纳米粒子的结构和化学组成进行表征(图2和图
3)。tem图片显示两种核壳ucnps在环己烷中均具有良好的分散性，形貌呈六方形结构。nayf4:yb,er核心和nayf4:yb,tm核心的粒径大小分别为大约54nm和50nm，核壳gucnps和核壳bucnps的粒径分别增至大约73nm和65nm，证明nayf4:yb,nd外壳层的包裹成功。xrd图谱表明两种核壳ucnps及其核心ucnps的衍射峰位置与β-nayf4标准卡片(jcpds no.28-1192)一致，说明它们均为纯六方相晶型。gucnps和bucnps的高分辨tem图像显示它们(100)面对应的晶格条纹间距为0.52nm，进一步表明它们具有纯六方相晶型。通过ft-ir光谱分析pei修饰前后ucnps的化学基团。两种核壳ucnps及其核心在2928cm-1
和2857cm-1
处有两个吸收峰，分别来自油酸配体中-ch
2-的不对称和对称伸缩振动，而在1573cm-1
和1455cm-1
处的两个吸收峰与羧酸阴离子(coo-)的不对称和对称伸缩振动有关。经pei改性后，两种ucnps在大约3450cm-1
和1640cm-1
处出现明显的吸收峰，分别对应于-nh2伸缩和剪刀弯曲振动。以上结果表明pei在两种核壳ucnps表面成功修饰。
[0086]
②
双色上转换纳米粒子的适配体功能化表征
[0087]
利用紫外可见吸收光谱和zeta电位对适配体的修饰过程进行表征。如图4所示，两种pei-ucnps在260nm处没有明显的吸收峰，经过适配体偶联后，在260nm附近出现了一个明显的吸收峰；与此同时，与相同浓度的适配体初始溶液相比，反应上清液在260nm处的吸光度显著降低。此外，pei-gucnps和pei-bucnps的电位分别为+35.5mv和+36.1mv，连接适配体后分别变成了-16.5mv和-16.0mv。以上结果说明zen适配体和ota适配体分别与gucnps和bucnps成功偶联。
[0088]
③
cu-tcpp纳米片的制备表征
[0089]
利用tem对cu-tcpp纳米片的表面形貌进行表征。tem图片清晰地显示cu-tcpp纳米片具有超薄片状结构，横向尺寸为几微米(图5a)。利用xrd表征cu-tcpp纳米片的晶体结构。cu-tcpp纳米片与块状cu-tcpp mofs具有相同的特征衍射峰，其中(110)、(210)和(004)处的特征峰证明了cu-tcpp纳米片的晶体结构(图5b)。采用紫外可见吸收光谱分析了cu-tcpp纳米片的光学性质(图5c)。tcpp配体位于416nm处的特征峰属于卟啉环的soret峰，而cu-tcpp纳米片中的soret峰轻微红移到434nm，表明cu
2+
成功地将卟啉环金属化。如图5d所示，cu-tcpp纳米片与块状cu-tcpp的ft-ir光谱基本一致。但块状cu-tcpp位于1290cm-1
的c＝n的拉伸振动较弱，而cu-tcpp纳米片的c＝n的拉伸振动较强，表明pvp吸附在cu-tcpp纳米片表面。pvp和tcpp配体均含有c＝o键，但由于pvp与tcpp配体中位于1660cm-1
的c＝o拉伸振动重叠，因此很难观察到pvp附着在cu-tcpp纳米片表面时c＝o的位移。以上结果证明了二维cu-tcpp纳米片的成功制备。
[0090]
实施例2同时检测玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的双色上转换纸基适配体传感器的检测性能
[0091]
采用实施例1制备双色上转换纸基适配体传感器，在样品区加入不同浓度zen和ota混合溶液后，在808nm光激发下，用智能手机获得相应荧光图片。如图6a和6b所示，随着zen和ota浓度的不断增加，荧光图片的绿色荧光和蓝色荧光逐渐恢复。然后用智能手机中安装的颜色识别软件提取荧光图片的rgb值，分别以绿色荧光图片的g通道相对值δg(δg＝g-g0，g和g0分别代表加入不同浓度zen和不加zen时荧光图片的g通道值大小)和蓝色荧光图片的b通道相对值δb(δb＝b-b0，b和b0分别代表加入不同浓度ota和不加ota时荧光图片的b通道值大小)与zen和ota浓度值的对数绘制标准曲线。当zen浓度在0.5ng/ml～100ng/
ml的范围内时，δg与zen浓度的对数之间拥有良好的线性关系，标准曲线方程为δg＝58.90x+37.44(r2＝0.9980)，检测限为0.44ng/ml(3σ/k，n＝11)(图6c)。此外，当ota浓度在0.1ng/ml～50ng/ml范围内时，δb与ota浓度的对数之间线性关系良好，标准曲线方程为δb＝53.45x+63.78(r2＝0.9862)，检测限为0.098ng/ml(图6d)。
[0092]
与之前报道的一些同时检测zen和ota的方法相比，本发明方法具有相当的灵敏度和线性范围。分别利用5个独立制备的纸基传感器检测50ng/ml zen和ota，得到的rsd值分别为4.11％和5.35％，说明本方法具有良好的重现性。
[0093]
为了考察本方法的特异性，又检测了谷物中可能存在的其它几种常见的真菌毒素，比如afb1、don、fb1和t-2。如图7所示，这4种干扰真菌毒素引起纸基荧光图片的δg和δb值较小。相比之下，zen和ota则可以分别引起明显的δg和δb值升高，表明本发明构建的双色纸基传感器具有良好的特异性，这主要得益于适配体对靶标分子的高特异性和亲和力。为了排除两个靶标之间的相互干扰对检测结果准确性产生影响，我们也对本发明方法同时检测zen和ota的交叉反应性进行了评估，这对于多靶标同时检测体系的构建至关重要。如图7所示，当向样品区只加入zen时，只有δg值明显升高；当只加入ota时，只有δb值明显升高；只有当加入zen和ota的混合溶液时，δg和δb值才同时升高，且与单靶标时的大小一致，说明本方法同时检测zen和ota时不会发生交叉反应。
[0094]
为了评估本方法用于同时检测实际样品中zen和ota的可行性和准确性，又进行了玉米粉样品检测及加标回收测试。首先用本方法和elisa试剂盒测定了玉米粉中两种真菌毒素的本底值，结果均无法检测到。然后，向市售玉米粉中添加不同浓度的zen和ota标准溶液进行加标回收测试。结果本方法测得的玉米粉中zen和ota的加标回收率分别为94.5％～103.7％和92.2％～106.8％(rsd值小于7％)，且与商品化elisa试剂盒的检测结果一致，说明本方法可用于同时检测实际样品中zen和ota的含量。
[0095]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。