Rab31/rs9965664在评估川崎病患者免疫球蛋白耐药中的应用的制作方法

rab31/rs9965664在评估川崎病患者免疫球蛋白耐药中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及rab31/rs9965664在评估川崎病患者免疫球蛋白耐药中的应用。


背景技术：

2.川崎病(kd)是一种主要影响婴幼儿的全身性急性血管炎。高剂量静脉注射免疫球蛋白(ivig)是kd患者降低炎症反应和冠状动脉瘤(caa)发生风险的一线治疗方案。不幸的是，10-20％的患者对该治疗方案没有反应，这类病人被定义为对ivig治疗抵抗。此外，许多研究发现rab31在多种人类疾病中调节先天免疫反应。然而，rab31基因的单核苷酸多态性(snp)是否与kd患者ivig治疗抵抗相关的研究还未有报道。
3.川崎病(kd)是一种急性发热性系统性血管炎，临床医生通常根据一些体征和症状 (高热、黏膜炎症和颈部淋巴结病)进行诊断，最早由川崎富作医生发现。kd可以导致多器官多组织失调，尤其是中小型血管，以冠状动脉为甚。在未接受治疗的患者中，冠状动脉瘤的发生率约为25％，kd是发达国家获得性心脏病的主要病因。多个国家报告了儿童多系统炎症综合征(misc)。患者的临床特征与kd 相似(即非化脓性结膜炎、多形性皮疹、黏膜改变和四肢肿胀)。寻找有效的临床治疗kd的方法已成为当务之急。
4.静脉注射免疫球蛋白(ivig)是从数千名捐赠者的血浆中提纯的产物，并广泛用于多种自身免疫性和炎症性疾病，如免疫性血小板减少症(itp)和kd。目前，大剂量ivig 治疗方案仍然是kd患者的一线治疗方法，因为ivig治疗可以减少持续炎症的发生和冠状动脉瘤(caa)形成导致猝死的风险。不幸的是，10-20％的患者对该治疗方案没有反应，并最终发展为ivig抵抗。ivig抵抗患者相较于ivig敏感患者发生川崎病休克综合征(kdss)或kd巨噬细胞活化综合征(kd-mas)等危及生命的并发症的风险增加。因此，了解ivig的作用机制对kd的临床治疗至关重要。
5.人rabs(大脑ras相关蛋白)属于小gtpases的ras家族，有60多个家族成员。rabs 的功能依赖于其在gtp开启形态和gdp关闭形态之间的分子转换，以及对细胞胞吞和胞吐过程中特殊膜转运的调控。rab31也是rabs超家族的一个重要亚群，主要位于高尔基复合体和起源于高尔基体的细胞器膜中。除了膜转运功能，rab31还通过招募 tbc1d2b来调控外泌体的异质性生物发生。此外，也有文献报道rab31也对先天免疫至关重要。yeo等发现rab31在吞噬早期pi(4,5)p2到pi(3,4,5)p3转化过程中招募信号适配器appl2，随后通过pi3k信号通路调节巨噬细胞fcγ受体(fcγr)介导的吞噬作用。
6.巨噬细胞吞噬作用对炎症反应和自身免疫反应至关重要，可以清除病原体和组织碎片。更有趣的是，ivig在免疫性血小板减少和溶血性贫血中的作用机制是通过与脾脏和肝脏巨噬细胞fcγrs竞争结合来阻止自身抗体介导的血细胞被吞噬。提示rab31调节巨噬细胞相关的吞噬作用可能是ivig作用的关键，而rab31在kd或ivig中作用研究至今仍为空白。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供rab31/rs9965664在评估川崎病患者免疫球蛋白耐药中的应用。
8.本发明所采取的技术方案是：
9.本发明的第一方面，提供检测rab31表达量的物质在制备川崎病免疫球蛋白耐药评估产品中的应用。
10.在本发明的一些实施方式中，所述rab31表达量在川崎病免疫球蛋白耐药中表达降低。
11.在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、试纸、基因芯片或蛋白质芯片。
12.在本发明的一些实施方式中，所述物质包括通过免疫印迹法、免疫组化法和免疫共沉淀法、酶联免疫吸附法、胶体金、质谱法等方法检测rab31表达量的物质。
13.在本发明的一些实施方式中，所述物质包括检测rab31表达量的试剂、仪器、软件和/或模块。
14.本发明的第二方面，提供检测rs9965664多态性或基因型的物质在制备川崎病免疫球蛋白耐药评估的产品中的应用。
15.在本发明的一些实施方式中，所述rs9965664的aa/ga基因型的存在标志着发生川崎病免疫球蛋白耐药风险增高，敏感性降低，易于发生治疗抵抗。
16.在本发明的一些实施方式中，所述rs9965664的aa/ga基因型的男性患者和/或小于60月龄的患者更容易川崎病免疫球蛋白耐药风险增高，敏感性降低，易于发生治疗抵抗发生。
17.在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、试纸、基因芯片或蛋白质芯片。
18.在本发明的一些实施方式中，所述检测rs9965664的物质包括通过taqman探针法、 snapshot法、hrm法、mass array法、illumina beadxpress法检测rs9965664多态性或基因型的物质。
19.在本发明的一些实施方式中，所述物质包括检测rs9965664多态性或基因型的试剂、仪器、软件和/或模块。
20.在本发明的一些实施方式中，所述物质包括：引物、探针。
21.本发明的第三方面，提供一种非诊断目的的检测川崎病免疫球蛋白耐药的方法，通过川崎病患者rab31表达量和/或rs9965664多态性或基因型。
22.在本发明的一些实施方式中，所述rab31表达量在川崎病免疫球蛋白耐药中表达降低，当其表达量低于正常人，则标志发生川崎病免疫球蛋白耐药风险增高。
23.在本发明的一些实施方式中，所述rs9965664的aa/ga基因型的存在标志着发生川崎病免疫球蛋白耐药风险增高，敏感性降低，易于发生治疗抵抗。
24.本发明的第四方面，提供一种筛选治疗川崎病免疫球蛋白耐药的方法，通过检测给药前后川崎病患者rab31表达量和/或rs9965664多态性或基因型。
25.本发明的有益效果是：
26.本发明通过研究发现携带rab31/rs9965664aa/ga基因型的kd患者与携带gg基因
型的kd患者相比，更容易发生ivig耐药，ivig治疗抵抗风险显著增加，差异具有统计学意义，因此可以通过检测rab31/rs9965664基因型来评估ivig耐药。此外，本发明还发现携带rs9965664a等位基因的kd患者单核细胞中rab31蛋白表达水平普遍较低，而ivig治疗抵抗组中病人单核细胞中rab31蛋白表达水平较ivig敏感组显著降低，与前述结果一致，因此也可以通过检测rab31表达量来评估ivig耐药风险；有利于川崎病患者的后续治疗，具有较高的应用价值。而且机制研究表明rab31可能通过 nlrp3和p38信号通路调控川崎病人ivig治疗的应答反应。
附图说明
27.图1为rab31通过nlrp3/p38信号通路调控川崎ivig治疗的应答。
28.图1(a)川崎ivig敏感组病人pbmc中rab31的表达与磷酸化p38表达的负相关；图1(b)川崎ivig抵抗组病人pbmc中rab31的表达与磷酸化p38表达的正相关；图1(c)nlrp3、rab31、磷酸化p38等蛋白在ivig抵抗和ivig敏感组中蛋白表达示意图；图1(d)nlrp3、rab31、磷酸化p38等蛋白在ivig抵抗和ivig敏感组中表达水平统计图；图1(e)rab31在携带不同基因型川崎病人pbmc表达示意图 (mutation是aa基因型，wildtype是gg基因型)；图1(f)rab31在携带不同基因型川崎病人pbmc表达水平统计图。
具体实施方式
29.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
30.材料和方法
31.1、样本信息
32.2014年1月至2021年12月，一共从广州市妇女儿童医疗中心招募了1024例kd 患者。并且通过回顾医院数据库和心脏中心超声图数据库信息，确认了所有参与kd患者的诊断和治疗方案的准确性。
33.2、川崎病的临床诊断
34.所有kd患者都是由儿科医生根据美国心脏协会的标准诊断的。
35.3、ivig治疗应答
36.ivig治疗应答判定标准为：在最初发热11天内，第一次使用ivig(2g/kg)治疗后，患者仍然出现持续或反复发热(温度》＝38.0℃，腋下或口腔体温)超过36小时，总体时间少于7天的患者判定为ivig抵抗。
37.4、基因分型和dna提取
38.采集kd患者外周血。使用tianamp血液dna试剂盒(dp318,tiangen biotech, beijing)提取基因组dna，并按照制造商的说明书进行操作。rs9965664特异性荧光等位基因探针购自abi公司(thermo fisher scientific,united states)。使用abi-q6序列检测系统(thermo fisher scientific)对384孔板进行pcr。
39.采用taqman snp基因分型法(货号：4351379，thermofisher公司)对snp进行分型。
实验室技术人员对样本信息是盲目的，包括重复样本的相关具体信息。随机选择两组样本的10％重复基因分型结果。符合率为100％。
40.5、免疫印迹
41.利用含pmsf(beyotime)的细胞裂解液从细胞中提取pbmc总蛋白。样品经12.5％ sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到pvdf膜上。膜在含5％牛血清白蛋白的pbs中封闭后，与rab31一抗(1:1000；16182-1-ap,proteintech)，nlrp3抗体(1:1000；15101,cellsignaling technology)，p-p38抗体(1:1000；arg51850,arigo)，或β-actin抗体(1:500；380624, zen bioscience)4℃过夜，然后用过氧化物酶联二抗(抗兔igg,hrp联抗，1:500；7074s， cst)或抗小鼠igg,hrp链接抗体，1:2000；7076s，cst)在室温下放置1小时。然后用x 射线胶片对信号进行检测。所有图像用imagej进行分析。
42.6、统计方法
43.采用sas软件(9.4版；sas研究所，加里，北卡罗来纳州)。采用pearson卡方检验评估ivig敏感病例与ivig抵抗病例人口学变量分布及基因型频率的差异。通过logistic 回归分析计算比值比(odds ratio,ors)和95％可信区间(confidence interval,ci)，以衡量 rab31/rs9965664多态性与kd患者ivig抵抗风险之间的相关性。用graphpad prism 8 绘制相对蛋白表达倍数变化统计图。p值《0.05为有统计学意义。
44.实验结果
45.1、纳入分析的kd病人临床特征
46.本研究共纳入1024例kd患者(表1)。
47.表1 kd病人ivig治疗抵抗组和敏感组的特点分布
[0048][0049]
表1显示了817例ivig治疗敏感kd患者和207例ivig治疗抵抗kd患者的特征分布。ivig抵抗群体比例为20.2％，与既往研究一致。ivig敏感组平均年龄为25.68
ꢀ±
20.65个月(范围1～131个月)，ivig抵抗组平均年龄为27.69
±
22.68个月(范围2～132 个月)。对ivig治疗敏感的kd患者中62.55％为男性，对ivig治疗抵抗的kd患者中男性比例为67.63％。女性占比分别为37.45％和32.37％。ivig敏感组与抵抗组在年龄 (p＝0.189)、性别(p＝
0.172)上无显著差异。
[0050]
2、rab31/rs9965664多态性与ivig抗性的相关性分析
[0051]
rab31/rs9965664多态性在kd ivig治疗抵抗组和敏感组的基因型频率分布见表2。为探讨rab31/rs9965664多态性与ivig治疗抵抗风险的相关性，采用χ2检验分析。发现rab31/rs9965664多态性与ivig抵抗风险增加显著相关(ga vs gg:调整后or＝1.45, 95％可信区间(ci)＝1.05-2.00,p＝0.025；aa vs gg:调整后or＝2.46,95％置信区间(ci) ＝1.41-4.30,p＝0.002；aa/ga vs.gg:调整后or＝1.57,95％ci＝1.16-2.14,p＝0.004；aa vs. ga/gg:调整后or＝2.09,95％置信区间(ci)＝1.22-3.57,p＝0.007)。结果提示携带aa/ga 基因型患者发生ivig治疗抵抗的风险显著高于携带gg基因型的患者，提示该snp对 ivig治疗具有抵抗作用。
[0052]
表2 rab31/rs9965664多态性在kd ivig治疗抵抗组和敏感组的基因型频率分布
[0053][0054]
3、分层分析
[0055]
进一步分析了rab31/rs9965664多态性与按年龄和性别划分的ivig治疗应答的特定亚组风险效应的相关性(表3)。与携带rs9965664/gg基因型的kd患者相比，携带 rs4594236aa/ga基因型的男性患者更易发生ivig治疗抵抗(校正or＝1.86,95％ ci＝1.27-2.71,p＝0.001)，尤其是年龄小于60月龄的患者(校正or＝1.56,95％ci＝1.13-2.15, p＝0.006)。
[0056]
表3
[0057][0058]
4、rab31在ivig抵抗的kd病人单核细胞中表达降低
[0059]
为了探明rab31在kd患者ivig治疗应答中的作用，对10例kd单核细胞进行了免疫印迹实验(5例ivig敏感，5例ivig抵抗)。结果显示，与ivig治疗敏感组相比， ivig耐药组的rab31蛋白表达明显降低(图1)。
[0060]
rab31的rs9965664位点位于18条染色体内含子区域，众所周知内含子可以通过多种方式影响许多基因的表达。为了验证rs9965664是否会影响rab31蛋白表达，测量了不同基因型rs996566患者单核细胞中rab31蛋白表达水平，结果显示携带rs9965664 a等位基因的患者单核细胞中rab31蛋白表达水平较低，与临床ivig治疗结果相关性一致(图1)。申请人还探索了rab31可能的下游通路，在ivig耐药组nlrp3明显增加。 ivig敏感组与ivig抵抗组磷酸化p38水平无差异，而rab31蛋白水平与p-p38水平在 ivig抵抗组呈负相关，在ivig敏感组呈正相关。综上所述，rs9965664a等位基因kd 患者的rab31蛋白表达水平较低，rab31可能通过nlrp3和p38信号通路抑制ivig治疗的应答。
[0061]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。