一种可提高荧光放大效应的标记方法及其在生物毒素检测中的应用与流程

1.本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种可提高荧光放大效应的标记方法及其在生物毒素检测中的应用。


背景技术：

2.针对于现有的免疫学类快速检测技术，检测食品中的真菌毒素有如下几种方法：酶联免疫快速检测试剂盒、胶体金快速检测卡、化学发光快速检测试剂盒和荧光免疫层析快速检测卡。其中酶联免疫试剂盒每种试剂盒只能检测一种真菌毒素，其使用时对操作人员要求较高，且需要使用酶标仪与电脑软件进行计算，不利于现场的快速检测。胶体金快速检测卡可以实现同一产品同时检测多种真菌毒素，但因其检测结果需用肉眼观察，其检测灵敏度无法达到国家对食品中真菌毒素残留限量的要求。化学发光快速检测试剂盒也可以实现同一产品同时检测多种真菌毒素，但需要使用专门的化学发光检测仪，其仪器设备昂贵，维护成本比较高，不利于现场的快速检测。荧光免疫层析快速检测卡也可以实现同一产品同时检测多种真菌毒素，其检测的形式与胶体金检测类似，需要成本不高，为现有快速检测食品中真菌毒素残留较为主流的方案，但因技术平台受限于免疫原材料的性能，不能完全满足对食品中真菌毒素检测的要求。
3.因此，有必要提供一种新的可提高荧光放大效应的标记方法及其在生物毒素检测中的应用解决上述技术问题。


技术实现要素：

4.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种可提高荧光放大效应的标记方法及其在生物毒素检测中的应用，主要是从荧光微球的放大效应出发，增强整个反应体系中的信号放大因素，同时优化各工艺配方，提高整个反应体系敏感度，以达到提升检测灵敏度的目的。
5.本发明提出的可提高荧光放大效应的标记方法，包括以下步骤：
6.s1：双重荧光微球的制备：
7.s1.1：进行黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体的羧基位点封闭；
8.s1.2：对已封闭的黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体的氨基位点进行偶联；
9.s1.3：将已偶联的黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体进行活化；
10.s1.4：将已活化的黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体与磁性荧光微球偶联；
11.s1.5：对偶联后的磁性荧光微球进行封闭；
12.s1.6：对放大信号磁性荧光微球进行标记；
13.s1.7：取s1.5中已标记封闭磁性荧光微球一部分与s1.6中已标记封闭的磁性荧光
0.5％、pva 0.5-1％、pvp k30 0.2-0.5％、tx-100 0.1-0.3％。
34.优选的，s5中，s5.1中所用到的样品稀释液为0.05m pbs，ph＝6.6，含0.1-0.2％酪蛋白、0.05-0.1％ova、0.01-0.03％pc 300、0.001-0.005％抗坏血酸、0.002-0.005％peg 4000。
35.优选的，s5中，s5.2中将反应好的卡条放入荧光读数仪中读取结果。
36.本发明还提供，一种可提高荧光放大效应的标记方法及其在生物毒素检测中的应用。
37.本发明的有益效果：
38.①
通过提供新的标记方法，可大幅度提升荧光标记信号放大的能力，使用本标记方法在产品应用上能够提高产品的灵敏度、检测限的能力，提升检测速度；抗体标记时通过使用peg加长链，避免多级荧光物资偶联时阻碍抗原抗体的结合位点。
39.②
通过对结合垫、样品垫、样品稀释液的处理配方的开发，达到在检测食品样品时，减少样品基质的干扰带来的检测差异。
附图说明
40.图1本发明提供的可提高荧光放大效应的标记方法所制备的双重荧光微球-抗体偶联物的示意图；图2为本发明提供的可提高荧光放大效应的标记方法中所制备的检测卡条的示意图。
具体实施方式
41.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
42.实施例
43.本实施例中提出了可提高荧光放大效应的标记方法包括以下步骤：
44.s1：双重荧光微球的制备：
45.s1.1：进行黄曲霉毒素b1(afb1)、呕吐毒素(don)、玉米赤霉烯酮(zen)抗体的羧基位点封闭，用0.1m pbs(ph＝7.6)将黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体稀释至0.2mg/ml，取0.5ml稀释后的抗体至离心管中，依次加入60μlml 0.1m edc、30μl 0.1m nhs、0.1ml 1.0m氨水，并调节混合液的ph至7.5-8.0。室温条件下，在摇床上轻微震荡混匀反应30min后，以0.1m pbs(ph＝7.2)为洗脱液，用分子量5kd的超滤离心管离心洗脱，除去上清液，重复洗脱3次后，用0.01m pbs定容至0.5ml；
46.s1.2：对已封闭的黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体的氨基位点进行偶联，取s1.1中已封闭的抗体0.5ml，加入0.1ml 0.2m nhs-peg-cooh(分子量1-5k)，室温条件下，在摇床上轻微震荡混匀反应60min，以0.01m pbs(ph＝7.2)为洗脱液，用分子量15kd的超滤离心管离心洗脱，除去上清液，重复洗脱3次后，用0.01m pbs定容至0.5ml
47.s1.3：将已偶联的黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体进行活化，取s1.2中已偶联的抗体0.5ml至离心管中，依次加入40μl 0.1m edc、20μl 0.1m nhs，室温条件下，在摇床上轻微震荡混匀反应30min，以0.01m pbs(ph＝7.2)为洗脱液，用分子量5kd的超滤离心管离心洗脱，除上去清液，用0.01m pbs定容至0.1ml；
48.s1.4：将已活化的黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮抗体与磁性荧光微球偶
联，取磁性时间分辨荧光微球(粒径200～500nm，激发波长350～370nm，吸收波长610～630nm，微球表面游离基团为氨基)40μl，加入0.36ml 0.1m mes(ph＝6.0)，手动摇晃1min，4℃条件下12000r/min离心15min，弃去上清液，加入0.4ml 0.02m mes溶液(ph＝6.5)，超声混匀1min，加入s1.3中已活化的抗体0.1ml，室温条件下，在摇床上轻微震荡混匀反应30min，将偶联后的离心管放置在磁力架上，静置5min，除去上清液后，再加入0.4ml 0.02m mes溶液(ph＝6.5)，超声混匀1min，将离心管放置在磁力架上，静置5min，除去全部液体，重复2次后，加入0.5ml 0.02m mes溶液(ph＝6.5)，超声分散1min，备用；
49.s1.5：对偶联后的磁性荧光微球进行封闭，取s1.4中igg偶联后的磁性荧光微球0.5ml，加入0.15ml 0.1m nhs-生物素，室温条件下，在摇床上轻微震荡混匀反应60min，将偶联后的离心管放置在磁力架上，静置5min，除去全部液体后，加入0.4ml 0.02m mes溶液(ph＝6.5)，超声混匀1min，将离心管放置在磁力架上，静置5min，除去全部液体，重复此步骤2次，加入0.5ml 0.02m mes溶液(ph＝6.5)，超声分散1min；
50.s1.6：对放大信号磁性荧光微球进行标记，取聚苯乙烯时间分辨荧光微球(粒径10～30nm，激发波长350～370nm，吸收波长610～630nm，微球表面游离基团为羧基)0.1ml，加入0.9ml 0.1m mes(ph＝6.0)，手动摇晃1min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入1.0ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，依次加入0.2ml 0.1m edc、0.1ml 0.1m nhs，室温条件下，在摇床上轻微震荡混匀反应30min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入1ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入1ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，加入2mg/ml的链霉亲和素0.5ml，室温条件下在摇床上轻微震荡混匀反应30min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入1ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，加入0.1ml 10％bsa，室温条件下在摇床上轻微震荡混匀反应60min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入1ml 0.02m mes(ph＝6.5)，超声分散1min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入1ml 0.02m mes(ph＝6.5)，超声分散1min；
51.s1.7：取s1.5中已标记封闭磁性荧光微球0.5ml与s1.6中已标记封闭的磁性荧光微球1ml混合，室温条件下，在摇床上轻微震荡混匀反应60min，将偶联后的离心管放置在磁力架上，静置5min，除去全部液体，将离心管取下磁力架。加入0.5ml 0.01m mes溶液(ph＝6.5)，超声混匀1min，将离心管放置在磁力架上，静置5min，除去全部液体，重复此步骤2次。加入0.2ml保存溶液(0.01m tris-hcl溶液，ph 7.6，含0.1-1％bsa、2-10％海藻糖、2-10％蔗糖、0.2-2％甘露醇、0.01-0.1％pvp k15、0.03-0.1％tw-20、0.02-0.05％卡松)，超声分散1min；
52.s1.8：进行质控线荧光微球的标记，取聚苯乙烯时间分辨荧光微球(粒径100～200nm，激发波长350～370nm，吸收波长610～630nm，微球表面游离基团为羧基)0.05ml，加入0.45ml 0.1m mes(ph＝6.0)，手动摇晃1min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入0.5ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，依次加入0.05ml 0.1m edc、0.025ml 0.1m nhs，室温条件下在摇床上轻微震荡混匀反应30min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入0.5ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入0.5ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，加入2mg/ml的兔抗鸡igy抗体0.25ml，室温条件下在摇床上轻微震荡混匀反应30min，4℃条件下15000r/min
离心20min，弃去上清液。加入0.5ml 0.1m mes(ph＝6.0)，超声分散1min，加入0.1ml 10％bsa，室温条件下在摇床上轻微震荡混匀反应60min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入0.2ml 0.02m mes(ph＝6.5)，超声分散1min，4℃条件下15000r/min离心20min，弃去上清液。加入0.2ml保存溶液(0.01m tris-hcl溶液，ph＝7.6，含0.1-1％bsa、2-10％海藻糖、2-10％蔗糖、0.2-2％甘露醇、0.01-0.1％pvp k15、0.03-0.1％tw-20、0.02-0.05％卡松)，超声分散1min；
53.s1.9：进行标记抗体终浓度选择，afb1终浓度范围为0.05-0.2mg/ml；zen终浓度范围为0.1-0.3mg/ml；don终浓度范围为0.02-0.08mg/ml，兔抗鸡igy终浓度范围为0.2-0.5mg/ml。afb1、zen、don抗体全部为小鼠单克隆抗体；
54.s1.10：进行荧光信号结合垫的喷涂，将标记完的afb1、zen、don、兔抗鸡igy的荧光微球保存液按体积比7:5:10:2混合，已0.8μl/cm的喷涂量喷镀在处理好的结合垫上。放45℃鼓风干燥箱中烘烤48h后密封；
55.s2：制备硝酸纤维素膜：
56.s2.1：制备包被液，用包被缓冲液0.05m pbs(ph＝7.4)将鸡鸡igy抗体稀释至0.5-1.0mg/ml；用包被缓冲液0.01m pbs(ph7.2，含2-5％海藻糖、5-8％甲醇、0.5-2％蔗糖、0.01-0.05％pc300)将afb1-bsa稀释至0.1mg/ml-0.3mg/ml；用包被缓冲液0.01m pbs(ph7.2，含2-5％海藻糖、5-8％甲醇、0.5-2％蔗糖、0.01-0.05％pc300)将zen-bsa稀释至0.2mg/ml-0.5mg/ml；用包被缓冲液0.01m pbs(ph7.2，含2-5％海藻糖、5-8％甲醇、0.5-2％蔗糖、0.01-0.05％pc300)将zen-bsa稀释至0.2mg/ml-0.5mg/ml；
57.s2.1：喷膜划线，将赛多利斯140膜裁切成30cm的小段，揭开pvc底板上中间的胶纸，将裁切后的膜粘贴在底板上，放到多点划膜机上将2.2.2.1的液体同时包被在硝酸纤维素膜上。划线浓度为0.8μl/cm，并置于放45℃鼓风干燥箱中烘烤24h后密封。
58.s3：进行结合垫与样品垫的制备：
59.s3.1：将样品垫处理液倒在pp材质的塑料盘中，将玻璃纤维(8975或8955等)放在盘中浸泡5min，取出玻璃纤维，抹干净表面残余的液体，放50℃的鼓风干燥箱中烘烤72h。
60.s3.2：将结合垫处理液倒在pp材质的塑料盘中，将玻璃纤维(8975或8955等)放在盘中浸泡5min，取出玻璃纤维，抹干净表面残余的液体，放50℃的鼓风干燥箱中烘烤72h。
61.s4：进行检测卡的组装：
62.s4.1：将喷镀好的结合垫裁成宽0.8cm，长30cm的小条，将处理好样品垫裁成宽1.6cm，长30cm的小条，将吸水纸裁切成宽1.6cm，长30cm的小条。撕开nc膜检测线下端的胶，贴上结合垫，结合垫压nc膜下端0.2cm处，将样品垫贴在结合垫下方，低端与pvc底板齐平；撕开nc膜质控线上端的胶，贴上吸水纸，吸水纸压nc膜上端0.2cm处；
63.s4.2：将贴好的大板用裁切机裁成4mm宽的试纸条，将裁切后的试纸条放入塑料卡壳的下盖中，盖上塑料卡壳的上盖，用压卡机压紧。装入铝箔袋，并在铝箔袋中放入干燥剂，用热塑封口机封口，制得检测卡条；
64.s5：样本处理与检测：
65.s5.1：称取10g干燥的食品样品于50ml的离心管中，加入25ml的70％甲醇-水，剧烈涡旋震荡10min，室温4000r/min离心10min，取上清液100μl，加300μl样品稀释液混匀后，即为待测液；
66.s5.2：取s5.1中的待测液100μl加入到s4.2中组好的检测卡条中，室温条件下反应15min，之后可读取结果，取s5.1中的待测液100μl加入到s4.2组好的卡条中，室温条件下反应15min，放入荧光读数仪中读取结果，afb1的最低检测浓度为0.02μg/kg，zen的最低检测浓度为2μg/kg，don最低检测浓度为10μg/kg。且afb1的检测范围达0.02μg/kg～200μg/kg；zen的检测范围达2μg/kg～20000μg/kg；afb1的检测范围达10μg/kg～100000μg/kg。
67.s3中，s3.1中所用到的样品垫处理液的总量为1l，含十二水磷酸氢二钠4.55g、二水磷酸二氢钠4.22g、氯化钠6.04g、酪蛋白0.5-2％、pc 300 0.03-0.05％、bsa 0.5-1％、羟丙基-β-环糊1-5％、pvp k40 0.3-1％、吐温-20 0.1-0.5％、l-赖氨酸0.01-0.04％；s3中，s3.2中所用到结合垫处理液的总量为1l，含十二水磷酸氢二钠5.37g、二水磷酸二氢钠3.9g、氯化钠9g、甘氨酸0.1-0.3％、pc 300 0.03-0.05％、bsa 0.1-0.5％、pva 0.5-1％、pvp k30 0.2-0.5％、tx-100 0.1-0.3％；s5中，s5.1中所用到的样品稀释液为0.05m pbs，ph＝6.6，含0.1-0.2％酪蛋白、0.05-0.1％ova、0.01-0.03％pc 300、0.001-0.005％抗坏血酸、0.002-0.005％peg 4000。
68.本实施例中，s1.1步骤的目的是将抗体上的羧基位点进行封闭，其目的是为了在s1.3将抗体结合物活化时不活化抗体本身的羧基位点，让抗体不能直接使用羧基偶联在微球上，与现有技术不同的是现有的标记方法未对抗体上的羧基进行封闭，有存在自身交联的可能性，降低批间的稳定性，使用5kd(能透过小分子，截留大分子蛋白)的超滤离心管是将未反应的edc、nhs、氨水等除去，现有技术多用普通离心(去除不彻底，易聚沉)、透析(时间过长，对蛋白活性损失较大)、纯化柱纯化(需要装填料、对使用者要求较高、纯化时间比超滤离心管长)等方法去除多余物资，使用超滤离心管是最快捷方便的；
69.s1.2步骤的目的是将封闭羧基位点的抗体上的氨基连上nhs-peg-cooh(分子量1k-5k)，然后再用nhs-peg-cooh上的羧基和微球上的氨基链接，使用nhs-peg-cooh的目的是使抗体和微球呈现一定的空间间隙，使后续微球上偶联放大信号微球的时候不会遮蔽掉抗体与抗原结合的活性位点，现有技术一般是直接将抗体偶联在微球上，没有增加加长链，有可能阻碍抗体与抗原结合的特异性，使用15kd离心管离心的原因同上。
70.s1.3步骤的目的是将偶联了nhs-peg-cooh的抗体上的nhs-peg-cooh基团的羧基活化，以便于其能偶联到氨基微球上去.
71.s1.4步骤的目的是将活化后的抗体偶联在磁性荧光微球上，粒径选择200nm-500nm是因为此大小的微球能提供比较好的比表面积，能偶联足够的抗体和放大性荧光微球；粒径过小放大效应不够，粒径过大容易产生聚沉，使用磁性荧光微球的原因是便于后续的分离作用，现有技术主要为离心。
72.s1.5步骤的目的是将磁性荧光微球上为结合的氨基位点封闭，并预留出能与荧光放大信号微球偶联的生物素基团，使用为nhs-生物素，其为小分子物资，能更多的和微球上的氨基基团结合，可以更多的结合信号放大用的荧光微球。
73.s1.6步骤的目的是将链霉亲和素标记的用于放大荧光效应的微球上，因链霉亲和素和生物素的高亲和力，能非常容易的将放大信号用的荧光微球连接在磁性荧光微球上。
74.s1.7步骤的目的是将s1.6中用于放大荧光信号的微球偶联在s1.5的磁性荧光微球上，制备出本专利最重要的双重荧光信号放大微球，使用链霉亲和素-生物素系统能最大限度的保证偶联的效率，且使用的条件温和，能最大限度的保存抗体的活性
75.s1.8步骤的质控线的荧光微球的标记使用单独的系统，其目的是制备较为稳定的c线参比系统，因本方法中使用t线的荧光强度与c线的荧光强度的比值制备拟合曲线，如单独使用t线荧光信号强度做拟合曲线，会因样品加样量、反应温度、反应时间等因素的影响造成信号强度差异较大，不利于检测结果的稳定性。
76.本实施例只详细写明了两层荧光标记的具体方法，实际本方案可适用于多重荧光标记，如另用抗bsa小鼠单抗标记荧光微球，再与s1.7的双重荧光微球因特异性相连，再用磁分离方法进行分离，可得到三重荧光标记微球。依此类推。
77.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。