一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法

1.本发明涉及艾绒鉴定领域，特别是一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法。


背景技术：

2.艾灸疗法历史悠久，应用广泛，艾灸疗法的主要材料为艾绒，艾绒是由艾叶加工而成。近年来，随着艾灸养生的普及，艾产业蓬勃发展，但对合格艾绒的性状认识却仍停留在古人描述水平。性状鉴别对于鉴别者专业技能和经验要求较高，即便是一般的从业人员也难以做到熟练掌握和准确鉴别。显微鉴别具有简便、准确的特点，然而，自1977版至2020版的中国药典艾叶的显微鉴别特征都未能完善和提高，其最大问题在于艾绒存在两种非腺毛：t形非腺毛和（顶细胞极长的）单列性非腺毛。在此情况下，有将劣质棉花、各种植物纤维甚至合成纤维等经过加工掺入艾绒，使艾绒质量受到影响，直接影响疗效。中国药典对灸用艾绒国家标准进行了分级，然而对于艾绒显微鉴定存在一定的问题，这无疑对艾绒的显微鉴定带来了困难。
3.根据研究显示，艾叶的非腺毛都为t形非腺毛，不存在现行2020版中国药典所述的单列性非腺毛；高精度艾绒的主要成分是顶细胞细长而弯曲的t形非腺毛，在加工成艾绒的过程中，随着反复的粉碎和过筛，t形非腺毛柄的完整性不断降低甚至脱落，然而，目前在艾绒显微鉴定方面，通常采用的是对艾绒水合氯醛透化后进行显微观察，艾绒中t形非腺毛大多相互缠结成乱团状，在普通光学显微镜下难以看清t形非腺毛柄的存在情况（图1）。
4.研究发现，用刀片从艾叶上刮下来的t形非腺毛特有的柄或脱落痕因有角质化现象，以及柄细胞中存在一些次生代谢产物，这些都能够自发荧光（图2），强度大大高于顶细胞的自发荧光，这对于鉴定艾绒的真伪有重要的价值。然而，目前艾绒显微鉴定均采用水合氯醛处理后才进行显微观察，由于水合氯醛的影响，导致即使使用荧光显微镜也无法看到这一荧光特征；另一方面，由于现在的艾绒一般采用机械加工，在反复粉碎的过程中，受高温的影响也使得t形非腺毛顶细胞和柄部的荧光依次消退，无法在荧光显微镜下清晰看到t形非腺毛的结构特征（图3）。因此如何对艾绒采用一定的方法进行处理后，恢复并增强其荧光特征，从而在荧光显微镜下能清晰看到艾绒特有的t形非腺毛的荧光显微特征，籍此来对艾绒的真伪做出鉴定有着非常重要的实用价值。


技术实现要素：

5.针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法，可有效解决艾绒真假鉴定问题。
6.为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法，包括以下步骤：（1）样品称取：称取5—10mg的艾绒做样品；（2）甲醛溶液处理：在样品中加入体积浓度10%—20%的甲醛溶液3—5ml，室温下，
浸渍处理1-2min；（3）漂洗：从甲醛溶液中取出艾绒，置入培养皿中，用蒸馏水漂洗10—20s；（4）2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理：将漂洗后的艾绒从培养皿中转入称量瓶中，在称量瓶中加入质量浓度0.5%—1%的 2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂3—5ml，室温下，浸渍处理1-5min；（5）显微观察：取2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理后的艾绒3-5mg，置于载玻片上展开，在艾绒上滴加体积浓度20%的甘油0.02-0.05ml，盖上盖玻片，在荧光显微镜紫外光激发下观察，根据显微特征判断艾绒真伪，若观察到t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕，则为真艾绒，反之则为假艾绒。
7.本发明方法简单，操作方便，机械加工后的真艾绒在甲醛和2-苯硼酸2-氨基乙酯的作用下，顶细胞重新恢复了荧光，柄部细胞也得到了加强。可以清晰的看到艾绒中的t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕，而假艾绒则不存在t形非腺毛特有的柄或脱落痕。有效解决了艾绒真伪的鉴别，确保了治疗和疗效，经济和社会效益巨大。
附图说明
8.图1是为本发明普通显微镜明场下的艾绒显微图。
9.图2是为本发明艾叶刀片刮下来的t形非腺毛自发荧光显微图（紫外光激发）。
10.图3是为本发明机械加工后艾绒t形非腺毛显微图（荧光消退）。
11.图4是为本发明实验组中真艾绒经处理后t形非腺毛恢复荧光显微图。
12.图5是为本发明对照组中假艾绒样品1经处理后明场下观察显微图。
13.图6是为本发明对照组中假艾绒样品1经处理后紫外光下观察显微图（与图5同一视野）。
14.图7是为本发明对照组中假艾绒样品2经处理后明场下观察显微图。
15.图8是为本发明对照组中假艾绒样品2经处理后紫外光下观察显微图（与图7同一视野）。
具体实施方式
16.以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
17.实施例1一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法，包括以下步骤：（1）样品称取：称取5mg的艾绒做样品；（2）甲醛溶液处理：在样品中加入体积浓度20%的甲醛溶液3ml，室温下，浸渍处理2min；（3）漂洗：从甲醛溶液中取出艾绒，置入培养皿中，用蒸馏水漂洗10s；（4）2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理：将漂洗后的艾绒从培养皿中转入称量瓶中，在称量瓶中加入质量浓度1%的 2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂3ml，室温下，浸渍处理5min；（5）显微观察：取2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理后的艾绒3mg，置于载玻片上展开，在艾绒上滴加体积浓度20%的甘油0.02ml，盖上盖玻片，在荧光显微镜紫外光激发下观察，根据显微特征判断艾绒真伪，若观察到t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕，则为真艾绒，
反之则为假艾绒。
18.实施例2一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法，包括以下步骤：（1）样品称取：称取10mg的艾绒做样品；（2）甲醛溶液处理：在样品中加入体积浓度10%的甲醛溶液5ml，室温下，浸渍处理1min；（3）漂洗：从甲醛溶液中取出艾绒，置入培养皿中，用蒸馏水漂洗20s；（4）2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理：将漂洗后的艾绒从培养皿中转入称量瓶中，在称量瓶中加入质量浓度0.5%的 2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂5ml，室温下，浸渍处理1min；（5）显微观察：取2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理后的艾绒5mg，置于载玻片上展开，在艾绒上滴加体积浓度20%的甘油0.05ml，盖上盖玻片，在荧光显微镜紫外光激发下观察，根据显微特征判断艾绒真伪，若观察到t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕，则为真艾绒，反之则为假艾绒。
19.实施例3一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法，包括以下步骤：（1）样品称取：称取7mg的艾绒做样品；（2）甲醛溶液处理：在样品中加入体积浓度15%的甲醛溶液4ml，室温下，浸渍处理2min；（3）漂洗：从甲醛溶液中取出艾绒，置入培养皿中，用蒸馏水漂洗15s；（4）2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理：将漂洗后的艾绒从培养皿中转入称量瓶中，在称量瓶中加入质量浓度0.8%的 2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂4ml，室温下，浸渍处理3min；（5）显微观察：取2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理后的艾绒4mg，置于载玻片上展开，在艾绒上滴加体积浓度20%的甘油0.03ml，盖上盖玻片，在荧光显微镜紫外光激发下观察，根据显微特征判断艾绒真伪，若观察到t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕，则为真艾绒，反之则为假艾绒。
20.实施例4一种基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法，包括以下步骤：（1）样品称取：称取9mg的艾绒做样品；（2）甲醛溶液处理：在样品中加入体积浓度12%的甲醛溶液5ml，室温下，浸渍处理2min；（3）漂洗：从甲醛溶液中取出艾绒，置入培养皿中，用蒸馏水漂洗18s；（4）2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理：将漂洗后的艾绒从培养皿中转入称量瓶中，在称量瓶中加入质量浓度0.6%的 2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂3ml，室温下，浸渍处理2min；（5）显微观察：取2-苯硼酸2-氨基乙酯试剂处理后的艾绒5mg，置于载玻片上展开，在艾绒上滴加体积浓度20%的甘油0.05ml，盖上盖玻片，在荧光显微镜紫外光激发下观察，根据显微特征判断艾绒真伪，若观察到t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕，则为真艾绒，反之则为假艾绒。
21.本发明基于非腺毛荧光显微特征的艾绒真伪鉴定方法，具有鉴定准确的优点，经实验鉴定效果好，将真艾绒作为实验组，设置2组假艾绒样品作为对照组，对实验组的真艾
绒和对照组的假艾绒均以实施例3的处理方法为例进行同样的处理，经荧光显微镜紫外光下观察，如图4所示，实验组中的真艾绒试剂处理后t形非腺毛恢复荧光，可以清晰看到艾绒中的t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕。而对照组的样品1（如图5、6）和样品2（如图7、8）则不存在t形非腺毛特有的柄或脱落痕。
22.本发明在以实施例3的处理方法进行实验的同时，还以实施例1、2、4的处理方法对真艾绒和假艾绒进行了实验处理，均取得了相同和相近似的结果，这里不再一一列举，表明本发明效果好，疗效稳定可靠。
23.由上述可知，机械加工后的真艾绒在甲醛和2-苯硼酸2-氨基乙酯的作用下，顶细胞重新恢复了荧光，柄部细胞也得到了加强。可以清晰的看到艾绒中的t形非腺毛有长度不等的柄或脱落痕（图4），而假艾绒例如劣质棉花、各种植物纤维和合成纤维不存在t形非腺毛特有的柄或脱落痕。本方法对于掺入艾渣的劣质艾绒，掺入各种植物纤维的伪品艾绒进行鉴别都有很好的效果，对于艾绒真伪鉴别有重要的实用价值。经实验和实地应用，准确率达99%以上，有效解决了艾绒真伪的鉴别，确保了治疗和疗效，经济和社会效益巨大。