一种3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的分析方法与流程

1.本发明涉及3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸分析检测技术领域，具体涉及一种3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的分析方法。


背景技术：

2.多替诺雷是一种新型选择性尿酸盐转运蛋白抑制剂，用于治疗部分高尿酸血症和痛风的。该药是一种尿酸盐重吸收抑制剂，可以靶向抑制尿酸盐重吸收转运子活性。通过选择性抑制肾脏中尿酸重吸收的转运蛋白，抑制尿酸重吸收并降低血液中的尿酸水平。
3.多替诺雷主要经以下步骤进行合成。
[0004][0005]
其中3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸是制备多替诺雷的早期中间产物，对该中间产物的杂质控制直接影响多替诺雷成品的质量。制备3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的过程中由于反应物未完全反应或产生其它副反应产物，从而会在产物3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸中混入4-甲氧基苯甲酸、3-氯-4-甲氧基苯甲酸等杂质。其中，杂质4-甲氧基苯甲酸和3-氯-4-甲氧基苯甲酸均和中间产物3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸结构较相似，尤其是杂质3-氯-4-甲氧基苯甲酸，与中间产物只少了一个氯，液相分离较困难，目前用于3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸及其相关杂质的液相分析方法尚未见报道。为实现对中间产物3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的杂质控制以及多替诺雷成品的质量控制，对中间产物3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸及其杂质的分析尤为重要，因此亟需一种可有效分离、分析中间产物3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸及其相关杂质的分析方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题是提供一种3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的分析方法，本发明采用一种对酸性、碱性、中性化合物均具有良好选择性的色谱柱，在特定的色谱条件下，可以有效分离3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸以及包含4-甲氧基苯甲酸和3-氯-4-甲氧基苯甲酸等多种杂质，该方法操作简单、分析时间短，可高效定性、定量分析3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸及多种杂质。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
[0008]
本发明提供了一种3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的分析方法，所述分析方法为高效液相色谱分析方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的固定相填料色谱柱，对3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸及其杂质的供试品溶液进行梯度洗脱；
[0009]
所述流动相包括流动相a和流动相b；其中，流动相a为0.01～0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液，ph为2.0～6.8；流动相b为甲醇和/或乙腈；
[0010]
以流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱按时间分段设定为：
[0011]
0至20分钟，流动相a为60％～80％体积份，流动相b为20％～40％体积份；
[0012]
大于20分钟至25分钟，流动相a为40％～50％体积份，流动相b为50％～60％体积份；
[0013]
大于25分钟至35分钟，流动相a为15％～30％体积份，流动相b为70％～85％体积份；
[0014]
大于35分钟至45分钟，流动相a为60％～80％体积份，流动相b为20％～40％体积份。
[0015]
进一步地，所述杂质包含4-甲氧基苯甲酸和/或3-氯-4-甲氧基苯甲酸。
[0016]
进一步地，所述固定相填料色谱柱为kromasil，250mm
×
4.6mm，5μm，十八烷基硅烷键合硅胶，可分离4种杂质，所述杂质包含4-甲氧基苯甲酸、3-氯-4-甲氧基苯甲酸。
[0017]
进一步地，所述固定相填料色谱柱的填充剂优选为末尾封端的十八烷基硅烷键合硅胶。
[0018]
进一步地，当所述固定相填料色谱柱为agilent，250mm
×
4.6mm，4μm，末尾封端的十八烷基硅烷键合硅胶，可分离5种杂质，所述杂质包含4-甲氧基苯甲酸、3-氯-4-甲氧基苯甲酸。
[0019]
进一步地，所述磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢钠、磷酸钠、磷酸钾中的一种或多种。
[0020]
进一步地，所述流动a的ph优选为2。
[0021]
进一步地，所述流动相b优选为甲醇。
[0022]
进一步地，进样体积为10μl～50μl；所述流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
[0023]
进一步地，所述分析方法的测试波长为190～400nm。
[0024]
进一步地，所述测试波长优选为240nm。
[0025]
进一步地，所述固定相填料色谱柱的柱温为30～45℃。
[0026]
进一步地，以流动相的总体积为100％计，所述梯度洗脱按时间分段优选设为：
[0027]
0至20分钟，流动相a为70％体积份，流动相b为30％体积份；
[0028]
大于20分钟至25分钟，流动相a为45％体积份，流动相b为55％体积份；
[0029]
大于25分钟至35分钟，流动相a为20％体积份，流动相b为80％体积份；
[0030]
大于35分钟至45分钟，流动相a为70％体积份，流动相b为30％体积份。
[0031]
进一步地，采用甲醇和/或乙腈溶解样品得到供试品溶液，所述供试品溶液中3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的浓度为0.1～0.5mg/ml。
[0032]
进一步地，所述供试品溶液采用的溶剂优选甲醇。
[0033]
进一步地，所述分析方法还包括以下步骤：
[0034]
(1)将3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸和各杂质配制系统适用性溶液，采用权利要求1
～9任一项所述分析方法进行检测，得到系统适用性曲线，曲线中出现的各吸收峰分别对应3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸和各杂质；
[0035]
(2)取待测的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸样品制备成供试品溶液，采用步骤(1)相同的分析方法进行检测，得到供试品的分析曲线，并与步骤(1)中系统适用性曲线进行对照，判断待测的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸样品吸收峰对应的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸以及杂质种类。
[0036]
进一步地，通过步骤(1)、(2)对待测的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸样品进行定性分析。
[0037]
进一步地，所述分析方法还包括以下步骤：
[0038]
a.分别配制不同浓度的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸以及各杂质的标准溶液，采用权利要求1～9任一项所述分析方法对各标准溶液进行检测并计算其峰面积，绘制3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸以及各杂质的峰面积-浓度标准曲线；
[0039]
b.将待测的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸样品制备成供试品溶液，采用步骤a相同的分析方法进行检测并计算各峰的峰面积，根据步骤a中所述的标准曲线计算出所述待测的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸样品中各成分浓度，并计算出各成分的含量。
[0040]
进一步地，通过步骤a、b对待测的3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸样品进行定量分析。
[0041]
本发明的有益效果在于：
[0042]
本发明提供了一种3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸分析方法，可以将3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸以及4-甲氧基苯甲酸、3-氯-4-甲氧基苯甲酸等杂质一次性分开检出，该方法操作简单且分析时间短，检测效率高，可实现对3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸及多种杂质的定性、定量分析，从而实现对3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的杂质控制，同时可用于多替诺雷制备过程中间产物的杂质控制，进而达到药品质量控制的目的。
附图说明
[0043]
图1为实施例2中供试品3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸紫外图；
[0044]
图2为实施例2中杂质4-甲氧基苯甲酸紫外图；
[0045]
图3为实施例2中杂质3-氯-4-甲氧基苯甲酸紫外图；
[0046]
图4为实施例3中流动相ph为6.8对应的色谱图；
[0047]
图5为实施例3中流动相ph为4.5对应的色谱图；
[0048]
图6为实施例3中流动相ph为2对应的色谱图；
[0049]
图7为实施例4中采用色谱柱1检测供试品3，5-二氯-4-甲氧基苯甲的色谱图；
[0050]
图8为实施例4中采用色谱柱1检测杂质4-甲氧基苯甲酸的色谱图；
[0051]
图9为实施例4中采用色谱柱1检测杂质3-氯-4-甲氧基苯甲酸的色谱图；
[0052]
图10为实施例4中采用色谱柱2检测供试品3，5-二氯-4-甲氧基苯甲的色谱图；
[0053]
图11为实施例4中采用色谱柱2检测杂质4-甲氧基苯甲酸的色谱图；
[0054]
图12为实施例4中采用色谱柱2检测杂质3-氯-4-甲氧基苯甲酸的色谱图；
[0055]
图13为实施例4采用色谱柱2检测混样的色谱图。
具体实施方式
[0056]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0057]
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0058]
实施例1稀释液的选择
[0059]
选取主成分3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸和杂质4-甲氧基苯甲酸和杂质3-氯-4-甲氧基苯甲酸，分别用乙腈和甲醇溶解稀释，配制成浓度为0.25mg/ml的溶液，其中各样品在甲醇中均较易溶解，在等量乙腈溶剂中需超声后勉强溶解，优选甲醇为稀释液。
[0060]
实施例2检测波长的选择
[0061]
取供试品3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸以及3-氯-4-甲氧基苯甲酸，分别用甲醇溶解稀释，配制成浓度为0.01mg/ml的溶液，用紫外分光光度计(岛津uv2450型)在190～400nm对各样品进行连续扫描，结果如图1～3所示：
[0062]
图1为供试品3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸的紫外图，由图可知，供试品在214.4nm有最大吸收但基线噪音大，在240.4nm处的吸收较好且基线稳定。
[0063]
图2为杂质4-甲氧基苯甲酸紫外图，由图可知，杂质4-甲氧基苯甲酸在210.2nm处有最大吸收但基线噪音大，在252.4nm处附近的吸收较好且基线稳定。
[0064]
图3为杂质3-氯-4-甲氧基苯甲酸紫外图，由图可知，杂质4-甲氧基苯甲酸在253.4nm处有最大吸收且基线稳定。
[0065]
综合上述不同物质对紫外波长的吸收情况，240nm处杂质4-甲氧基苯甲酸、3-氯-4-甲氧基苯甲酸对波长的吸收与供试品相当，故选择有关物质测定的检测波长为240nm。
[0066]
实施例3流动相a的ph值的选择
[0067]
供试品溶液的配制：取3份供试品3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸分别用甲醇溶解稀释，配制成浓度为0.2mg/ml的溶液；
[0068]
色谱条件：agilent 1260高效液相色谱仪，c18(250
×
4.6mm)，以0.01mol/l的磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾2.28g，加水1000ml，用磷酸调节ph至2.0～6.8)为流动相a，甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长240nm，流速1.0ml/min，进样体积为10μl；梯度洗脱程序如表1所示：
[0069]
表1梯度洗脱程序
[0070]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07030204555252080302080357030457030
[0071]
不同ph流动相a的配制：分别配制ph为2.0、4.5、6.8的磷酸盐缓冲液，根据上述色
谱条件对供试品进行检测，检测结果如图4～6所示，ph偏高时主峰峰型变差，理论板数低于2000；当ph为2.0，主峰理论板数超过5000，对称性良好。不同ph流动相a对应的主成分的理论板数如表2所示：
[0072]
表2不同ph流动相a对应的主成分的理论板数
[0073]
试验序号流动相a的ph主成分理论板数16.818424.5126332.032409
[0074]
根据上述不同ph流动相a检测结果可知，采用ph为2.0的流动相a，对应主成分的理论板数远高于ph为4.5、6.8的流动相a，优选ph为2.0的流动相a。
[0075]
实施例4色谱柱的选择
[0076]
样品溶液的配制：取供试品、4-甲氧基苯甲酸和3-氯-4-甲氧基苯甲酸各3份，其中分别各取两份用甲醇溶解稀释，配制成浓度为0.2mg/ml的样品溶液，将剩余各一份样品混合，加入甲醇溶解稀释，配制成各样品浓度为0.1mg/ml的混样溶液。
[0077]
色谱条件：采用实施例3中ph为2的流动相a的色谱条件，分别选用不同厂家的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行检测，色谱柱信息如下表3所示：
[0078]
表3不同色谱柱的信息
[0079][0080]
采用不同色谱柱检测供试品、4-甲氧基苯甲酸、3-氯-4-甲氧基苯甲酸的结果分别如图7～12所示，采用色谱柱1、2均能将杂质4-甲氧基苯甲酸和杂质3-氯-4-甲氧基苯甲酸与主成分3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸进行有效分离，其中色谱柱1可分离供试品的杂质个数为4个(如图7所示)，色谱柱2可分离供试品的杂质个数为5个(如图10所示)。
[0081]
采用色谱柱2对上述混样溶液进行分析测试，结果如图13所示，混样中各成分被有效分离，且各成分对应峰的峰型对称、半峰宽小，与单一成分峰位置均可对应。
[0082]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。