南方稻田土壤N2O产生机制的研究方法及控制策略

南方稻田土壤n2o产生机制的研究方法及控制策略
技术领域
1.本发明属于稻田生态系统温室气体减排技术领域，具体为南方稻田土壤n2o产生机制的研究方法。


背景技术：

2.n2o是第三大温室气体，也是最大的臭氧消耗物质，其在大气中的存在时间长达120年。 1990-2010年期间，全球人为n2o净排放量增加了33％。稻田覆盖了全球1.65亿公顷的面积，占全球农业土地面积的3％，然而稻田n2o排放量却占全球农业n2o排放量的11％。为了节约用水以及增加稻田土壤通气性，稻田常采用干湿交替的灌溉管理方式，引发大量的n2o排放，因此，减少稻田土壤n2o排放对于缓解温室效应以及臭氧损耗具有重要意义。
3.土壤中n2o产生分为生物过程与非生物过程，其中生物过程包含硝化细菌硝化过程 (nn)、硝化细菌反硝化过程(nd)、与硝化过程耦合的反硝化过程(ncd)和异养反硝化过程(hd)。前三种过程以氨氮为底物，统称为氨氧化过程(aops)。然而以往的研究没有对氨氧化过程进行具体划分，对n2o产生过程没有明确的区分与量化。耕作、根系生长导致剖面o2分布有差异，以及nh
4+
在土壤剖面上分布的差异，使得不同深度产生n2o的程度和机制不尽相同。区分稻田剖面上不同时期微生物产生n2o过程从而制定合理的减排方案，是减少稻田n2o产生的有利方式。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种稻田土壤n2o产生机制的研究方法，进而通过机制提出一种 n2o减排方案，以解决稻田土壤n2o产生机制不明确导致n2o减排方式不确定的问题。
5.为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
6.本发明通过采集稻田不同时期不同深度的土壤，研究稻田土壤n2o产生机制，包括如下步骤：
7.s01、采集不同时期稻田土壤分层样品，进行理化性质测定；
8.s02、研究稻田土壤n2o产生速率；
9.s03、研究稻田土壤各个n2o产生过程贡献率；
10.s04、根据数据计算与统计分析得到影响n2o产生过程的关键影响因素。
11.优选的，稻田不同时期为夏季休耕期、水稻种植期、冬季休耕期。选取不同时期的土壤有利于增加研究机制的覆盖度。
12.优选的，稻田剖面土壤采集分为0-5cm、5-10cm、10-20cm、20-30cm、30-40cm、40
‑ꢀ
60cm。通过研究不同深度的n2o产生机制，使结果更全面。表层土壤是微生物活跃区域，为了得到更详尽的机制结果，因此表层土壤采样划分更为详细。
13.优选的，步骤s01种所述测定的土壤理化性质包括铵态氮(nh
4+-n)、硝态氮(no
3— n)、含水率、ph、总有机质(tom)、总碳(tc)、总氮(tn)、总磷(tp)。
14.所述步骤s02的研究方法包括如下步骤：
15.(1)称取5g混匀过筛后的新鲜稻田土壤至50ml密封血清瓶中，排出瓶中空气并置换入氩气，根据测定的土壤o2含量计算出需要加入瓶中的o2体积，并置换出等体积的氩气；
16.(2)处理i为空白对照组，处理ii加入7mol/l的zncl2，每个处理均加入(nh4)2so4和 kno3至终浓度均为50mg n/kg，每个处理设置三个平行；
17.(3)样品在原位温度条件下恒温培养，并于0、4、8、12、24、48、72小时使用气密针从瓶中取出25ml顶空气体转移至真空labco瓶(labco limited,lampeter,uk)中，使用气相色谱测定气体样品的n2o浓度；
18.(4)用n2o气体浓度与时间进行线性拟合，直线斜率即为稻田土壤n2o产生速率，其中处理i为总n2o产生速率，包括生物n2o产生速率与非生物n2o产生速率，处理ii为非生物n2o产生速率，处理i的速率减去处理ii的速率可以得到生物过程产生n2o速率。
19.所述步骤s03区分n2o产生过程包括如下步骤：
20.(1)称取5g混匀过筛后的新鲜土壤至50ml密封血清瓶中，排出瓶中空气并置换入氩气，根据测定的土壤o2含量计算出需要加入瓶中的o2体积，并置换出等体积的氩气。
21.(2)处理i添加1.0％原子百分超的
18
o-h2o，处理ii添加1.0％原子百分超的
18
o-nh4no3，处理iii加入10.0％原子百分超的
15
n-nano3，处理iv加入10.0％原子百分超的
15
n-(nh4)2so4, 处理v为空白对照，所有处理均需加入(nh4)2so4与kno3至终浓度为50mg n/kg。每个处理设置三个平行。
22.(3)原位温度培养4天后，用气密针从每个瓶中取出25ml顶空气体移至真空labco瓶中，利用同位素比质谱仪对n2o气体中
18
o/
16
o以及
15
n/
14
n比值进行测定，前四个处理的比值测定结果需减去空白对照比值后进行后续计算。
23.(4)将培养结束后的样品用2mol/l的kcl浸提，并测定其中的
15
nh
4+
和
15
no
3-的丰度值。
24.(5)通过计算得到n2o产生过程贡献率。
25.本发明的有益效果是：
26.1.稻田土壤n2o产生主要来自于耕作层土壤，主要由微生物过程产生，且种植中的n2o产生速率最大。
27.2.稻田土壤生物n2o主要由异养反硝化过程产生，其次为硝化细菌反硝化过程。其中异养反硝化过程对于n2o贡献率在夏季休耕期小于水稻种植期小于冬季休耕期，随着种植过程增加。
28.3.nh
4+-n与氨氧化过程贡献率呈现正相关关系，是驱动稻田土壤生物产n2o过程变化的主要驱动因素。
29.4.提出一种在水稻种植时期减少施加氮肥量，减少氨氧化过程对于n2o产生贡献率，之后通过控制反硝化过程n2o排放，进而使稻田土壤n2o排放量显著减少的方案。
附图说明
30.图1为本发明结构示意图；
31.图2为不同时期土壤剖面生物与非生物n2o产生速率；
32.图3为不同n2o产生过程贡献率。
具体实施方式
33.实施例：
34.稻田土壤样品采集包括如下步骤：用直径为5cm的土钻，分别按0-5cm、5-10cm、10
‑ꢀ
20cm、20-30cm、30-40cm、40-60cm采集分层土壤，每层土壤三个平行。取样后去除石砾、植物残体等，并充分混匀过孔径2mm的筛子，取一部分进行理化性质的测定，另外一部分分放入4℃冷库，以备后续培养使用。理化性质测定包括如下步骤：nh
4+-n与no
3-‑
n按照 5：1的水土比例用2mol/l的kcl溶液进行浸提，室温下250rpm震荡1h后，用滤膜过滤，滤液用skalar连续流动分析仪测定；采用玻璃电极测定土壤ph，体积比为1:2.5(土壤:水)；土壤含水率测定于105℃烘干至恒重；土壤总有机质测定采用550℃烧失法；土壤总碳、总氮、总磷使用元素分析仪测定。
35.稻田土壤n2o产生速率测定：
36.(1)称取5g混匀过筛后的新鲜稻田土壤至50ml密封血清瓶中，排出瓶中空气并置换入氩气，根据测定的土壤o2含量计算出需要加入瓶中的o2体积，并置换出等体积的氩气；
37.(2)处理i为空白对照组，处理ii加入7mol/l的zncl2，每个处理均加入(nh4)2so4和 kno3至终浓度均为50mg n/kg，每个处理设置三个平行；
38.(3)样品在原位温度条件下恒温培养，并于0、4、8、12、24、48、72小时使用气密针从瓶中取出25ml顶空气体移至真空labco瓶中，使用气相色谱测定气体样品的n2o浓度；
39.(4)用n2o气体浓度与时间进行线性拟合，直线斜率即为稻田土壤n2o产生速率，其中处理i为总n2o产生速率，包括生物n2o产生速率与非生物n2o产生速率，处理ii为非生物n2o产生速率，处理i的速率减去处理ii的速率可以得到生物过程产生n2o速率。结果如图2所示。
40.结果分析：不同时期土壤剖面生物与非生物n2o产生速率如图2所示。不同时期不同深度稻田土壤非生物产生n2o速率均高于生物过程产生n2o速率，其中生物过程占比为91.0
–
98.5％。在三个时期中，种植中稻田n2o产生速率最高。在剖面上，土壤表层(0-5cm)n2o 产生速率最高，并随着深度而下降，耕作层(0-20cm)土壤产生的n2o占整个剖面的90.0％以上。因此控制稻田土壤n2o应集中于管理耕作层生物n2o的产生。
41.稻田土壤n2o各产生途径贡献率的测定：
42.(1)根据上一步n2o产生速率测定结果可知稻田土壤n2o主要由耕作层部分产生，因此n2o各产生途径的测定针对耕作层土壤。称取5g混匀过筛后的耕作层新鲜土壤至50ml 密封血清瓶中，排出瓶中空气并置换入氩气，根据测定的土壤o2含量计算出需要加入瓶中的o2体积，并置换出等体积的氩气；
43.(2)tr1添加1.0％原子百分超的
18
o-h2o，tr2添加1.0％原子百分超的
18
o-nh4no3， tr3加入10.0％原子百分超的
15
n-nano3，tr4加入10.0％原子百分超的
15
n-(nh4)2so4,处理 v为空白对照，所有处理均需加入(nh4)2so4与kno3至终浓度为50mg n/kg。每个处理设置三个平行；
44.(3)原位温度培养4天后，用气密针从每个瓶中取出25ml顶空气体移至真空labco瓶中，利用同位素比质谱仪对n2o气体中
18
o/
16
o以及
15
n/
14
n比值进行测定，前四个处理的比值测定结果需减去空白对照比值后进行后续计算；
45.(4)将培养结束后的样品用2mol/l的kcl浸提，将tr4浸提液分别按照如下步骤进
行nh
4+
→
n2和no
3-→
n2的转化，并通过测定
15
n-n2得到
15
nh
4+
和
15
no
3-的丰度值；
46.nh
4+
→
n2：将一定浓度的次溴酸钠溶液(nabro)加入到浸提液与nh
4+
反应，反应方程式为：
[0047][0048]
反应一段时间使得浸提液中的nh
4+
全部转化为n2，将n2保存待测；
[0049]
no
3-→
n2：加入适量碱性海绵镉，将浸提液中的no
3-全部转化为no
2-，而后加入氨基磺酸(nh2so3h)，使no
2-全部转化为n2，反应方程式如下：
[0050][0051]
待no
2-全部转化为n2后，保存n2待测；
[0052]
将得到的n2待测样品上机，于同位素比质谱仪进行测定。
[0053]
(5)n2o产生过程贡献率计算过程如下：
[0054]
氨氧化过程n2o
aops
与反硝化过程n2o
hd
对n2o产生的贡献率为，
[0055][0056][0057]
n2o
(aops)
＝n2o
nn
+n2o
nd
+n2o
ncd
[0058]
其中，n2o
nn
、n2o
nd
、n2o
ncd
为nn、nd、ncd过程对于n2o产生的贡献率，％。
[0059]
ncd过程对n2o产生的最大贡献率根据4处理进行计算，
[0060]
如果则
[0061]
如果则
[0062][0063]
其中，为tr4培养后富集的的
15
n的原子百分超，％；
[0064]
为tr4培养后富集的的
15
n的原子百分超，％。
[0065][0066]
其中，aoi为tr1中o原子的实际摄入量(o原子从h2o进入到n2o)的百分值；
[0067]
18
o(n2o
(tr1)
)为tr1样品的n2o的
18
o原子百分超，％；
[0068]
18
o(h2o
(tr1)
)为tr1培养后富集的h2o的
18
o原子百分超，％。
[0069]
o原子实际交换率(o原子在h2o和反硝化过程中氮氧化合物中的交换)根据tr2和 tr3进行计算，
[0070]
x
err
＝100-err
[0071][0072]
其中，err为h2o和no
3-的o原子交换率的百分值；
[0073]
18
o(n2o
(tr2)
)为tr2样品的n2o的
18
o原子百分超，％；
[0074]
18
n(n2o
(tr3)
)为tr3样品的n2o的
15
n原子百分超，％；
[0075]
为tr2样品添加的no-3
的
18
o原子百分超，％；
[0076]
为tr3样品添加的no-3
的
15
n原子百分超，％；
[0077]
toi表示o原子从h2o到n2o的理论值，根据以下假设分别计算nn、nd和ncd对 n2o的贡献率。
[0078]
假设i：
[0079][0080]
如果aoi≤toi1，则
[0081][0082]
如果aoi》toi，则
[0083][0084][0085][0086]
假设ii：
[0087]
toi2＝n2o
hd
×
x
err
+n2o
(aops)
×
0.5
[0088]
如果aoi≥toi2，则
[0089][0090]
如果aoi《toi2，则
[0091][0092][0093]
结果如图3所示。
[0094]
得到不同n2o产生途径的贡献率后，将其与土壤理化性质做皮尔逊相关性分析得到影响 n2o产生途径的关键影响因素，相关性分析结果如下表所示。
[0095][0096]
结果分析：如图3所示在不同的时期，异养反硝化过程对n2o产生贡献率为53.4
–
96.6％，主导n2o产生。异养反硝化过程贡献率随着水稻的种植增加，也即夏季休耕期贡献率小于水稻种植期小于冬季休耕期。与之相反，氨氧化过程贡献率随着水稻种植降低，也即夏季休耕期贡献率大于水稻种植期大于冬季休耕期。在氨氧化过程中，硝化细菌反硝化过程起主导作用，占氨氧化过程贡献率的50％以上。
[0097]
n2o产生过程贡献率与理化性质的相关性分析表明nh
4+-n与氨氧化过程贡献率呈现正相关，与异养反硝化过程显著负相关，结合稻田施加氮肥主要为尿素，可以得到nh
4+-n是驱动氨氧化过程增加的主要因素。因此驱动n2o产生过程变化的主要因素是氮肥施加量，氮肥增加促使氨氧化过程贡献率增加，反之异养反硝化贡献率减少。
[0098]
本发明中利用zncl2区分非生物和生物过程产生的n2o；采用培养法测定n2o产生速率；同时结合稳定同位素示踪技术量化区分不同途径对n2o产生的相对贡献；结合土壤理化性质，评价驱动n2o产生的影响因素。多种技术手段结合应用，从多角度揭示了稻田土壤n2o产生机制。根据稻田n2o产生主要来自于耕作层生物过程，由异养反硝化过程主导，其贡献率随氮肥施加量增加而降低，因此我们基于研究结果提出一种减少氮肥施加量后，异养反硝化贡献率增加，进而通过添加反硝化抑制剂减少异养反硝化产生n2o从而控制稻田土壤n2o产生的方案。
[0099]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言、可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求极其同物限定。