一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用

1.本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用。


背景技术：

2.酚类化合物是生态环境中一类重要的毒害性有机污染物。环境中的酚类化合物来源广泛，主要包括工业废水和生活污水的排放、以及有机磷农药的降解，严重威胁生态安全和人类健康，亟需加强酚类污染物的监测预警及其强化治理。
3.传统上针对酚类化合物的分析检测手段主要是色谱和质谱技术，难以用来实现低成本、高通量的实时在线监测。生物电化学传感器可以很好地解决特殊污染物的实时在线检测难题。但是，目前的生物电化学传感器在技术上多通过蛋白涂覆加电子媒介导电的原理将污染物浓度转化为可检测电流，面临着检测灵敏度低、功能酶失活快、抗干扰能力差、定量可靠性一般等问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用。
5.为了构建有技术经济价值的新型生物电化学酚类传感器，本发明选择胆红素氧化酶(bod，下同，来源于漆斑菌属)作为酚的电化学受体，利用纳米金和基础蛋白在bod和电极基底之间设计实现了独特的单分子界面，进一步改进酶电极的活性和稳定性，构建了基于“纳米金-基础蛋白-bod”体系的单分子酶电化学酚类传感器。
6.本发明的技术思路是：通过电化学方法在导电、惰性的固体分析电极表面沉积金纳米颗粒；然后借助带巯基的羧酸或胺类化合物在金纳米颗粒表面修饰自组装单层；借助自组装单层以共价连接的方式将基础蛋白固定到金纳米颗粒表面，在电极表面得到单分子层的基础蛋白；将胆红素氧化酶共价连接到基础蛋白上，即制作成为单分子酶电化学酚类传感器。通过在电极表面和酶之间引入基础蛋白可以很好的改进酶电极的活性和稳定性，在适当电位下氧化酚类化合物产生特异性电流信号，作为对水样中酚类化合物定性和定量的依据。
7.因此，本发明的第一个目的是提供新型单分子酶电化学酚类传感器，所述的传感器包括电极基底，以及在电极基底表面上依次组装的金纳米颗粒层、基础蛋白和胆红素氧化酶，所述的基础蛋白通过带巯基的羧酸或胺类化合物以共价连接方式结合到金纳米颗粒表面上，所述的胆红素氧化酶以共价连接方式结合到基础蛋白上。
8.优选的，所述的电极基底的材质为金、铂、玻碳或者石墨。
9.优选的，所述的基础蛋白为导电蛋白或非导电蛋白。
10.优选的，所述的导电蛋白为多血红素细胞色素c或铁硫蛋白；所得的非导电蛋白为牛血清蛋白。
11.本发明的第二个目的是提供一种制备上述的新型单分子酶电化学酚类传感器的方法，包括以下步骤：在导电、惰性的固体分析电极表面上沉积金纳米颗粒；然后借助带巯基的羧酸或胺类化合物在金纳米颗粒表面上修饰自组装单层；借助自组装单层以共价连接的方式将基础蛋白固定到金纳米颗粒表面上，在电极表面得到单分子层的基础蛋白；将胆红素氧化酶共价连接到基础蛋白上，即制得单分子酶电化学酚类传感器。
12.优选的，所述的新型单分子酶电化学酚类传感器的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)在三电极电化学体系中，以导电、惰性的固体分析电极为工作电极、铂丝为对电极、银/氯化银为参比电极，将电极共同浸没于含有氯金酸的电沉积液中，以循环伏安法将氯金酸根还原，使金纳米颗粒沉积在工作电极表面上；
14.(2)将沉积金纳米颗粒的工作电极浸没在羧基化修饰液中6～48h，得到表面羧基化的纳米金颗粒电极；
15.(3)将表面羧基化的纳米金颗粒电极用edc-nhs溶液进行处理，经水漂洗后，浸泡于基础蛋白溶液中，使基础蛋白共价固定到金纳米颗粒表面上，再用edc-nhs溶液进行处理，经水漂洗后，浸泡于胆红素氧化酶溶液中，制得单分子酶电化学传感器。
16.优选的，步骤(1)中，所述的导电、惰性的固体分析电极的材质为金、铂、玻碳或者石墨。
17.优选的，步骤(1)中，所述的电沉积液的组成为：1mm氯金酸，50mm硫酸钠，0.5m硫酸，溶剂为水；所述的循环伏安法的电势范围是-1.4v～+0.6v，扫描速率是10～200mv/s，扫描循环数是5～20。
18.优选的，步骤(2)中，所述的羧基化修饰液的组成为：β-巯基乙醇9mm，巯基乙酸1mm，溶剂为水。
19.优选的，步骤(3)中，所述的edc-nhs溶液的组成为：0.1m edc，0.5m sulfo-nhs，0.1m吗啉乙磺酸，溶剂为水。
20.优选的，步骤(3)中，所述的基础蛋白为多血红素细胞色素c、铁硫蛋白或牛血清蛋白；所述的基础蛋白溶液的浓度为1μm，所述的胆红素氧化酶溶液的浓度为740u bod/ml pbs缓冲液。
21.本发明的第三个目的是提供上述的新型单分子酶电化学酚类传感器在检测酚类污染物中的应用。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.本发明利用胆红素氧化酶作为酚类受体，将其氧化酚类化合物时产生的法拉第电流作为传感的基础，在电极和胆红素氧化酶之间构建电子传递通道，并借助纳米金颗粒和基础蛋白将胆红素氧化酶高效组装在电极表面，从而构建成为单分子酶电化学酚类传感器。与传统的酶电化学传感器相比，本发明在酚类污染物的检测上具有高检测灵敏度、高定量准确性以及高酶活稳定性的技术优势，可实现对酚类污染物的实时在线定性定量检测，具有较高的经济和技术价值。
附图说明
24.图1为“纳米金-ccta-bod”电极示意图。
25.图2为“纳米金-bod”和“纳米金-ccta-bod”体系传感2,4-二氯苯酚的循环伏安图。
26.图3为2,4-二氯苯酚浓度与传感器测试电流的拟合线性图。
27.图4为多次扫描过程中，缺少ccta的传感器(“纳米金-bod”)和添加ccta的传感器(“纳米金-ccta-bod”)对2,4-二氯苯酚的响应信号变化。
28.图5为多次扫描过程中，添加bsa的传感器(“纳米金-bsa-bod”)对2,4-二氯苯酚的响应信号变化。
具体实施方式
29.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
30.实施例1
31.1、单分子酶电化学酚类传感器(“纳米金-ccta-bod”电极)的制备
32.(1)纳米金修饰电极的制备
33.本案例中以金盘电极作为基底，使用前依次用1μm和50nm的氧化铝粉末进行湿法抛光，待电极表面打磨至平整光亮时，用乙醇和纯水先后各超声清洗三次。组装常规三电极电解体系，以抛光、清洗后的金盘电极作为工作电极、铂丝作为对电极、银/氯化银作为参比电极共同浸没于含有氯金酸的电沉积液(1mm氯金酸，50mm硫酸钠，0.5m硫酸，溶剂为水)中，连接电化学工作站。在剧烈搅拌下扫描循环伏安(电势范围是-1.4v～+0.6v，扫描速率是50mv/s，扫描循环次数10次)，将氯金酸根还原，使金纳米沉积颗粒在电极表面上，结果显示：电极表面由光滑、金黄色转变为磨砂状、紫红色，证明了致密的纳米金层的形成。
34.(2)纳米金颗粒的羧基化
35.将步骤(1)所得的沉积金纳米颗粒的工作电极用纯水漂洗，风干后浸泡于羧基化修饰液(β-巯基乙醇9mm，巯基乙酸1mm，溶剂为水)中18h，取出后重新用水漂洗，得到表面羧基化的纳米金颗粒电极。
36.(3)多血红素细胞色素c的表达获取
37.本案例中使用来自奥奈达希瓦氏细菌(shewanella oneidensis)mr-1的多血红素细胞色素c—ccta作为电极中的基础蛋白。为了提取该蛋白，将ccta(genbank:aan55755.1)的dna重组到质粒pbad202/d-topo(购自thermofisher，由实验室传代培养保存环状质粒于大肠杆菌中)并在n端添加6
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his标签，然后重新转入该细菌中。使用lb培养基活化该重组菌株至对数生长期中段，加入l-阿拉伯糖(1mm)进行常规诱导表达。诱导表达10h后，收集细菌菌体并通过超声破碎法裂解菌体细胞。超速离心收集上清液，然后使其通过镍亲和树脂，按常规方法清洗该树脂并使用咪唑从树脂上洗脱ccta蛋白。使用超滤杯进行缓冲替换，使蛋白溶解于pbs缓冲(20mm nah2po4，80mm na2hpo4，ph 7.4，溶剂为水)中，得到浓度为1μm的ccta蛋白溶液。
38.(4)ccta共价组装到金纳米颗粒表面
39.将步骤(2)所得的表面羧基化的纳米金颗粒电极浸泡于edc-nhs溶液(含0.1m edc，0.5m sulfo-nhs，0.1m吗啉乙磺酸，ph 6.0，溶剂为水)中1h，然后取出并用纯水漂洗，风干。转移浸泡于浓度为1μm的ccta蛋白溶液中1h，使导电蛋白ccta共价固定到金纳米颗粒表面上。
40.(5)bod共价组装到ccta表面
41.用纯水轻柔漂洗步骤(4)所得的电极表面，然后再次浸泡于edc-nhs溶液中1h，取
出并用纯水漂洗。转移浸泡于bod溶液(740u bod/ml pbs缓冲液)中1h，然后轻柔漂洗电极，即得到“纳米金-ccta-bod”电极(图1)。
[0042]“纳米金-bod”电极的制备步骤与“纳米金-ccta-bod”电极相似，具体为：将步骤(1)所得的沉积金纳米颗粒的电极用纯水漂洗，浸泡于edc-nhs溶液中1h，取出并用纯水漂洗。转移浸泡于bod溶液(740u bod/ml pbs缓冲液)中1h，然后轻柔漂洗电极，即得到“纳米金-bod”电极。
[0043]
2、对2,4-二氯苯酚的电化学传感
[0044]
以2,4-二氯苯酚为代表性分析物，在电化学工作站控制下的三电极电解体系中进行电化学传感测试。以上述制得的“纳米金-bod”或“纳米金-ccta-bod”电极作为工作电极，以铂丝电极作为对电极，以饱和银/氯化银电极作为参比电极进行实验。使用的电解液为加入50mm nacl作为支持电解质的pbs，加入浓度为2mm的2,4-二氯苯酚。通过循环伏安扫描的方法(电势范围是-0.6v～+0.8v，扫描速率是10mv/s，扫描循环次数为2次)进行2,4-二氯苯酚氧化还原测试。
[0045]
对2,4-二氯苯酚进行还原-氧化转化的循环伏安图(图2)中，在高电位区(+0.575v)观测到明显的氧化峰，作为其被bod氧化的特征信号。这一结果证明，本发明所设计的“纳米金-ccta-bod”电极对2,4-二氯苯酚具有传感能力。
[0046]
3、2,4-二氯苯酚浓度的标准曲线
[0047]
在步骤2的体系中，分别对工作浓度为20μm，50μm，100μm，150μm，200μm，400μm，600μm，800μm，1mm，1.5mm，2mm的2,4-二氯苯酚溶液扫描循环伏安。记录每一次循环伏安在+0.575v位置处峰电流值，建立浓度-峰电流的线性回归方程，如图3所示。结果表明，2,4-二氯苯酚溶液浓度与峰电流具有好的相关性，符合浓度定量的要求。
[0048]
4、细胞色素c对传感器稳定性的作用
[0049]
在含有2mm 2,4-二氯苯酚的电解液中，分别以“纳米金-bod”、“纳米金-ccta-bod”电极为工作电极，在三电极体系中进行多次传感测试，以2,4-二氯苯酚的特征氧化峰电流信号的变化来反映传感器活性的变化(如图4)。缺少辅助蛋白ccta的传感器“纳米金-bod”的氧化峰峰值电流信号在多轮测试中逐渐下降失活，添加辅助蛋白ccta的传感器“纳米金-ccta-bod”明显改进了bod的活性与稳定性。
[0050]
经过实例测试，本发明中针对酚类污染物的单分子酶电化学酚类传感器具有高灵敏度、高酶活稳定性的优势，适合对酚类污染物的在线工业检测和环境监测，具有较高的经济和技术价值。
[0051]
实施例2
[0052]
1、单分子酶电化学酚类传感器(“纳米金-bsa-bod”电极)的制备
[0053]
本案例中“纳米金-牛血清蛋白(bsa)-bod”电极的制备步骤同实施例1，不同之处在于，“纳米金-bsa-bod”电极中的基础蛋白为非导电蛋白bsa。
[0054]
2、对2,4-二氯苯酚的电化学传感
[0055]
在含有2mm 2,4-二氯苯酚的电解液中测试“纳米金-bsa-bod”电极的稳定性，在三电极体系中进行多次传感测试，以2,4-二氯苯酚的特征氧化峰电流信号的变化来反映传感器活性的变化，具体步骤同实施例1，结果如图5所示。从图5可知，添加基础蛋白bsa的传感器“纳米金-bsa-bod”同样明显改进了bod的活性与稳定性。
[0056]
经过上述实例测试，本发明中针对酚类污染物的单分子酶电化学酚类传感器可以很好的改进酶电极的活性及稳定性，有效延长了酶电极的使用寿命，使酶电极具有更好的重现性，具备长时间监测的能力，使酶电极具有较高的经济和技术价值。
[0057]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。