果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的提取及检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的提取及检测方法。


背景技术：

2.现有技术中公开的药剂类型以及给药方式众多，其中，对于某些丧失整片吞服能力的病患而言，某些难溶性的片剂药物并不能很好地被服用，为了顺利给药，这种情况下通常是将片剂药物压碎成粉，再将其与苹果酱等流体状的果酱混合后进行服用。其中，利伐沙班片是拜尔医药开发的一种新药，商品名：拜瑞妥主要用于髋关节或膝关节置换术后预防静脉血栓形成；治疗成人深静脉血栓形成，降低急性深静脉血栓复发和肺栓塞的风险。在给药选择上，由于这类病症的其中部分病人丧失了整片吞服的能力，因此，需要采用将利伐沙班片压碎与苹果酱等果酱混合后进行服用的给药方式。
3.利伐沙班为利伐沙班片中的主成分，为保证利伐沙班片粉与果酱混合过程中主成分服药剂量的准确性，需对利伐沙班片粉及果酱混合物中的主成分进行提取测定。现有公开的测定利伐沙班片中利伐沙班含量的常规方法为：采用乙腈或甲醇及其水溶液作为稀释剂溶解和提取利伐沙班片粉中利伐沙班，制备供试品溶液，再采用高效液相色谱法测定利伐沙班含量。
4.上述公开的稀释剂可以实现利伐沙班片中利伐沙班的提取；但对于采用果酱和利伐沙班片粉混合物进行服用的这类特殊给药方式而言，该常规采用的稀释剂并不适于果酱和利伐沙班片粉混合物中利伐沙班提取，原因在于果酱比较粘稠，完全将利伐沙班片粉包裹，阻碍了乙腈或甲醇及其水溶液对利伐沙班的溶解和提取，并且存在果酱与溶液分层现象，进而导致无法准确测定利伐沙班成分含量。


技术实现要素：

5.因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中果酱和利伐沙班片粉等难溶性药物的混合物中利伐沙班提取不完全的缺陷，从而提供解决上述问题的果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的提取方法。
6.本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中利伐沙班等难溶性药物提取不完全而导致果酱中利伐沙班含量测定不准确的缺陷，从而提供解决上述问题的果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的检测方法。
7.本技术的技术方案：
8.一种果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的提取方法，包括以下步骤：向果酱和难溶性药物混合物中加入稀释剂获得提取体系；所述稀释剂为体积比为1：1～1：5的乙腈和乙醇的混合溶液。
9.所述难溶性药物为利伐沙班片粉。
10.所述利伐沙班片粉在提取体系中的浓度为0.01mg/ml～0.03mg/ml，所述稀释剂与
提取体系的体积比至少为240：500。
11.还包括向果酱和难溶性药物混合物中加水荡洗的步骤；优选的，所述荡洗的步骤设置在添加稀释剂之前。
12.还包括超声的步骤；优选的，所述稀释剂分一次或多次加入，超声步骤设置在初次加入稀释剂之后；更优选的，超声频率为40khz，超声功率为500w，功率调节范围80％～100％，超声时间为5～30分钟。
13.还包括定容的步骤；优选的，所述定容的步骤设置在超声之后，定容时加入水和/或稀释剂。
14.提取体系至少含有利伐沙班片粉等难溶性药物、果酱和稀释剂，当含有加水荡洗和/或加水定容的步骤时，提取体系则含有利伐沙班片粉等难溶性药物、果酱、稀释剂和水。
15.还包括对所述提取体系离心得到上清液的步骤；优选的，所述离心步骤设置在定容之后，离心转速为12000～15000r/min，离心时间5～15min。
16.一种果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的检测方法，采用所述的一种果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的提取方法得到提取体系，作为供试品溶液的原料，进行高效液相色谱检测，获取难溶性药物的含量。
17.高效液相色谱检测的过程为：配置利伐沙班片的供试品溶液和对照品溶液，采用高效液相色谱仪分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测分析；
18.所述高效液相色谱检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为0.01mol/l磷酸溶液与乙腈的混合溶液，柱温为40～50℃，流速为0.4～0.6ml/min。
19.至少满足以下一个条件：
20.所述色谱柱为c18柱；优选的，所述色谱柱为agilent xdb-c18或waters beh c18；
21.所述高效液相色谱仪的检测波长为250nm；
22.所述供试品溶液和对照品溶液的进样量为1～3μl。
23.本发明技术方案，具有如下优点：
24.本技术的一种果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物提取方法，在对果酱和难溶性药物混合物稀释过程中加入特定比例的稀释剂[乙腈：乙醇为1：1～1：5v/v]，第一方面，特定比例的稀释剂能够使果酱中的果胶变成絮状析出，降低果酱对难溶性药物的包裹作用，减少果胶对难溶性药物的组分干扰，溶液流动性好；第二方面，特定比例的稀释剂对难溶性药物溶解效果更好，可达到对混合物中难溶性药物的完全提取；第三方面，特定比例的稀释剂提取的难溶性药物提取液用高效液相色谱检测时满足色谱出峰要求，主成分检测准确可靠，极大地提高了果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物检测准确率。
[0025]
利伐沙班片粉在提取体系中的浓度为0.01mg/ml～0.03mg/ml，同时稀释剂与提取体系的体积比至少为240：500，以通过足量的稀释剂充分絮凝果胶、排除干扰以及充分提取主成分利伐沙班。
[0026]
还包括向提取体系中加水荡洗的步骤，优选的，所述荡洗的步骤设置在添加稀释剂之前，先用水稀释，既能将容器中的混合物充分的转移到量瓶中，同时模拟人正常进食时，将混有利伐沙班片粉的果酱通过水顺利送服至肠胃道。
[0027]
优选的，还包括对提取体系超声的步骤，优选的，超声步骤设置在初次添加稀释剂
之后，以使主成分提取完全、快速；优选的，超声频率为40khz，超声功率为500w，功率调节范围80％～100％，超声时间为5-30分钟。
[0028]
还包括定容的步骤，优选的，在超声之后加入水和/或稀释剂定容，保证定容更准确，且在满足稀释剂最低加入量情况下，得到适宜高效液相色谱检测的利伐沙班提取体系。
[0029]
还包括在定容后对提取体系离心以将絮状物与提取液分离得到上清液的步骤，优选的，离心转速为12000～15000r/min，离心时间5～15min。
[0030]
本发明的一种果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物的检测方法，采用上述提取方法获得提取体系，并作为供试品溶液的原料，进行高效液相色谱检测，难溶性药物主成分含量检测准确可靠，极大地提高了果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物检测准确率。
[0031]
优选的，高效液相色谱检测的过程为：配置利伐沙班片的供试品溶液和对照品溶液，采用高效液相色谱仪分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测分析；所述高效液相色谱检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为0.01mol/l磷酸溶液与乙腈的混合溶液，柱温为40～50℃，流速为0.4～0.6ml/min。该色谱条件的选择，使得检测到的利伐沙班含量与实际含量无明显差异(≤2.0％)，精度高。
[0032]
所述色谱柱为c18柱；优选的，所述色谱柱为agilent xdb-c18或waters beh c18。实现了以反相色谱方法，将利伐沙班主成分与各干扰物进行有效分离，便于定量准确。
[0033]
所述高效液相色谱仪的检测波长为250nm，该波长为利伐沙班的最大吸收波长，利于检测灵敏度及准确性。
[0034]
所述供试品溶液和对照品溶液的进样量为1～3μl，适合超高效液相色谱柱的耐受量。
附图说明
[0035]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0036]
图1是实施例2的供试品溶液色谱图；
[0037]
图2是对比例4的供试品溶液的局部色谱图；
[0038]
图3a是方法学验证对照品溶液色谱图；图3b是方法学验证辅料空白溶液色谱图；图3c是方法学验证供试品溶液色谱图；
[0039]
图4是方法学验证线性色谱图；
[0040]
a：0.010mg/ml；b：0.015mg/ml；c：0.020mg/ml；d：0.025mg/ml；e：0.030mg/ml；
[0041]
图5是方法学验证准确度色谱图；
[0042]
a：辅料空白样品；b～d：3个低浓度样品，浓度为0.01mg/ml(相当于检测浓度的50％)；e～g：3个中浓度样品，浓度为0.02mg/ml(相当于检测浓度100％)；h～j：3个高浓度样品，浓度为0.03mg/ml(相当于检测浓度150％)；
[0043]
图6是方法学验证进样精密度色谱图；
[0044]
同一对照品溶液连续进样a:第一针；b：第二针；c：第三针；d：第四针；e:第五针；f：第六针；
[0045]
图7是方法学验证重复性试验色谱图；
[0046]
a～f：一份对照品连续进样6次，g、h：另一份对照品连续进样2次，i～n：6份供试品溶液；
[0047]
图8是方法学验证对照品溶液稳定性色谱图；
[0048]
同一份对照品溶液在室温a：0小时；b：1小时c：2小时；d：4小时；e：6小时；f：8小时；g：10小时；h：12小时进样；
[0049]
图9是方法学验证供试品溶液稳定性色谱图；
[0050]
同一份供试品溶液在室温a：0小时；b：1小时c：2小时；d：4小时；e：6小时；f：8小时；g：10小时；h：12小时进样。
具体实施方式
[0051]
实施例1
[0052]
试剂：乙腈，色谱纯，浓度为99.8％；乙醇，分析纯，浓度95％～100％；苹果酱：信息见表1。利伐沙班片：主成分含量为10mg/片，每片重均约为90mg。利伐沙班片有主成分利伐沙班含量为10mg/片、15mg/片、20mg/片三个规格，每片重均约为90mg。三种规格利伐沙班片粉混合果酱均可以为70ml(约80g)。因此，对于果酱与利伐沙班片粉混合进行服用的这类特殊给药方式而言，通常利伐沙班片粉与果酱的质量比为9：8000，利伐沙班主成分：果酱质量比为1：8000～1：4000。
[0053]
果酱和利伐沙班片粉混合物中利伐沙班的检测方法，包括如下步骤：
[0054]
步骤一、提取果酱和利伐沙班片粉混合物中利伐沙班
[0055]
(1)制备利伐沙班片粉和苹果酱混合物：取适宜容器1只，称取苹果酱80g(约70ml)置容器中，取利伐沙班片(10mg规格)1片，置不锈钢研钵中压碎或研磨，完全转移至已称取的苹果酱上，取不锈钢勺充分搅拌，将利伐沙班片粉和苹果酱充分混合，得到利伐沙班片粉和苹果酱的混合物。
[0056]
(2)制备供试品溶液：将全部利伐沙班片粉和苹果酱的混合物转移至500ml量瓶中，取65ml水充分荡洗容器，将溶液收集于同一500ml量瓶中，用65ml水再重复荡洗1次，收集在同一500ml量瓶中。在此量瓶中加入稀释剂1(乙腈：乙醇＝1：1v/v)约200ml，超声15min，继续用稀释剂1稀释至刻度，定容，摇匀，得到的利伐沙班在提取体系中的浓度为0.02mg/ml。取量瓶中混合液体适量，置1.5ml离心管中，15000rpm离心10min，取上清液作为供试品溶液。
[0057]
稀释剂1总量约为300ml，乙腈与乙醇体积比1：1。
[0058]
表1.实验中使用的果酱信息
[0059]
[0060]
(3)制备对照品溶液：取对照品约10mg，精密称定，置500ml量瓶中，分别加乙腈和乙醇各100ml，超声15min，加水200ml，用乙醇稀释至刻度，摇匀，得到0.02mg/ml的利伐沙班对照品溶液。
[0061]
步骤二、高效液相色谱法检测果酱中利伐沙班含量
[0062]
分别吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱仪，读取数据。
[0063]
高效液相色谱仪色谱条件：
[0064]
色谱柱：c18，2.1mm
×
50mm，1.7μm；
[0065]
流动相：0.01mol/l磷酸溶液-乙腈(75:25v/v)；
[0066]
0.01mol/l的磷酸溶液配制方法：取85％磷酸11.5g或6.7ml，用水稀释至10.0l，测定ph值；
[0067]
进样量：1μl，流速：0.5ml/min；
[0068]
柱温：45℃；
[0069]
检测波长：uv 250nm。
[0070]
实施例2
[0071]
本实施例与实施例1不同在于稀释剂的比例，其它参数和步骤均相同。本实施例中稀释剂2为乙腈：乙醇＝(1：2v/v)，稀释剂2加入过程为：先加100ml乙腈+100ml乙醇，超声振摇处理后用100ml乙醇定容。
[0072]
测试谱图见图2。
[0073]
实施例3
[0074]
本实施例与实施例1不同在于稀释剂的比例，其它参数和步骤均相同。本实施例中稀释剂3为乙腈：乙醇＝(1：5v/v)，稀释剂加入过程为：先加50ml乙腈和100ml乙醇，超声振摇处理后用150ml乙醇定容。
[0075]
实施例4
[0076]
本实施例与实施例2不同在于稀释剂2的加入量以及水加入量，其它参数和步骤均相同。本实施例中稀释剂2(乙腈：95％乙醇＝1：2v/v)约240ml，超声15min，用水稀释至刻度，摇匀。
[0077]
实施例5
[0078]
本实施例与实施例2不同在于水和稀释剂2加入的顺序，本实施例中将利伐沙班片粉和苹果酱的混合物转移至500ml量瓶中，取65ml水充分荡洗容器，将溶液收集于同一500ml量瓶中。在此量瓶中加入稀释剂2(乙腈：乙醇＝1：2v/v)约300ml，超声15min，用水稀释至刻度，摇匀。
[0079]
对比例1
[0080]
本对比例与实施例1不同在于稀释剂的比例，本对比例中稀释剂4为乙腈：水＝(2：1v/v)。稀释剂加入过程为：先加100ml乙腈+100ml水，超声振摇处理后用100ml乙腈定容。
[0081]
对比例2
[0082]
本对比例与实施例1不同在于稀释剂的组分，本对比例中的稀释剂5全部为乙腈。稀释剂5加入过程为：先加200ml乙腈，超声振摇处理后用乙腈定容，乙腈总量约300ml。
[0083]
对比例3
[0084]
本对比例与实施例1不同在于稀释剂的组分，本对比例中的稀释剂6为(乙腈：乙醇
＝2：1v/v)。稀释剂6加入过程为：100ml乙腈+100ml乙醇，超声振摇处理后用100ml乙腈定容。
[0085]
对比例4
[0086]
本对比例与实施例1不同在于稀释剂的组分，本对比例中的稀释剂7全部为乙醇。稀释剂加入过程为：先加200ml乙醇，超声振摇处理后，用乙醇定容，乙醇总量约为300ml。
[0087]
结果对比
[0088]
实施例1～5以及对比例1～4的测定结果见表2。
[0089]
对比例1有果胶等粘稠状物质，在容量瓶中呈分层现象，利伐沙班片粉混合在粘稠状物质中，无法提取完全。对比例1证明稀释剂使用66.6％的乙腈水溶液，有分层现象，利伐沙班无法从果酱中脱离，只能检测到62.97％的主成分。
[0090]
对比例2有果胶等粘稠状物质，在容量瓶中呈分层现象，有部分利伐沙班片粉混合在粘稠状物质中，无法提取完全。对比例2证明稀释剂完全使用乙腈无法完全提取利伐沙班，仍有分层现象，只能检测到82.82％的主成分。
[0091]
对比例3果胶等粘稠状物质较少，无明显分层现象，但提取仍不完全。对比例3证明稀释剂使用乙腈联合添加少量乙醇，可以提高主成分的提取效果，检出率为93.57％。
[0092]
对比例4无明显分层现象，溶液流动相好，有絮状物析出，但与液相色谱条件流动相存在溶剂效应，色谱峰峰形较差，影响测定准确性和色谱柱使用寿命，如图2所示。对比例4证明完全使用乙醇，可以达到果酱中果胶絮状析出，但色谱峰峰形较差，不利于液相色谱检测。
[0093]
实施例1～5无明显分层现象，量瓶中混合物流动相好，内容物有絮状物析出，主成分提取完全。利伐沙班达到98％以上的检出率，检测准确率高。
[0094]
因此，从表2可以看出，当稀释剂中乙腈:乙醇(1：1～1：5v/v)且稀释剂总体积为240ml及以上，体系总体积500ml时，可以使果胶等粘稠物析出，减少对主成分的干扰，同时，可以充分提取利伐沙班，并满足色谱出峰要求，最终达到主成分使用剂量检测准确可靠。
[0095]
表2.苹果酱撒拌利伐沙班片粉试验实施例和对比例比较
[0096]
[0097][0098]
方法重复性
[0099]
采用实施例2的方法同时对苏州中化及拜尔医药的利伐沙班片进行了相同的苹果酱撒拌试验检测，测量结果如下：
[0100]
表3.仿制制剂与参比制剂测试含量比较
[0101][0102]
备注：含量在5％以内，均判为无明显差异。
[0103]
从表3结果可知，两种样品各取6份进行苹果酱撒拌试验，检测到的含量基本一致，并与样品实际含量无明显差异(≤2.0％)，说明两种样品在苹果酱中均能被提取完全，并准确测定。
[0104]
方法学验证数据
[0105]
方法学验证包括对本技术的果酱和利伐沙班片粉混合物中利伐沙班的检测方法进行专属性、线性和范围、准确度(回收率)、精密度以及溶液稳定性试验。
[0106]
其中专属性试验为：分别对对照品溶液、辅料空白溶液和供试品溶液进行高效液相色谱测试。线性和范围试验为：分别对0.010mg/ml、0.015mg/ml、0.020mg/ml、0.025mg/ml和0.030mg/ml的利伐沙班供试品溶液进行进行高效液相色谱测试，并绘制标准曲线以得到相关系数。
[0107]
准确度(回收率)为分别对辅料空白样品以及3个低浓度样品，浓度为0.01mg/ml(相当于检测浓度的50％)、3个中浓度样品，浓度为0.02mg/ml(相当于检测浓度100％)、3个高浓度样品，浓度为0.03mg/ml(相当于检测浓度150％)进行高效液相色谱测试，计算三个
浓度回收率值和平均回收率。
[0108]
精密度试验包括连续进样6针对照品溶液，计算利伐沙班峰面积和保留时间rsd，以及将6份相同样品进行高效液相色谱测试，计算含量相对标准偏差。
[0109]
溶液稳定性试验为：分别对对照品和供试品溶液室温放置12h内的0、1、2、4、6、8、10和12小时时间节点处进样，测试稳定性。
[0110]
表4.苹果酱和利伐沙班片粉混合物中利伐沙班的检测方法学验证结果
[0111][0112][0113]
从表4可知，本技术的一种果酱和难溶性药物混合物中难溶性药物检测方法的专属性良好、利伐沙班在浓度0.01～0.03mg/ml的范围内线性良好、准确度良好、精密度良好、稳定性良好。
[0114]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。