黄曲霉毒素分离电离元件及其制备方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及分析领域，具体地，黄曲霉毒素分离电离元件及其制备方法和试剂盒，更具体地，涉及制备黄曲霉毒素分离电离元件的方法，及其制备的黄曲霉毒素分离电离元件，检测黄曲霉毒素含量的方法，检测黄曲霉毒素的试剂盒及其用途。


背景技术：

2.真菌毒素污染是危害食品安全的重要因素之一，据联合国粮农组织估算，全球每年约有四分之一的谷物受到真菌毒素的污染。真菌毒素种类繁多，其中黄曲霉毒素是迄今发现毒性最强的一类真菌毒素。黄曲霉毒素(aflatoxins，afs)主要是由黄曲霉(aspergillus flavus)、寄生曲霉(a.niger)和集峰曲霉(a.fumigatus)产生的结构和理化性质相似的次级代谢物。迄今为止已经发现的afs种类达20多种。其中食品中常见的主要有黄曲霉毒素b1 (aflatoxin b1，afb1)、黄曲霉毒素b2(aflatoxin b2，afb2)、黄曲霉毒素g1(aflatoxing1，afg1)、黄曲霉毒素g2(aflatoxin g2，afg2)、黄曲霉毒素m1(aflatoxin m1，afm1) 和黄曲霉毒素m2(aflatoxin m2，afm2)。食品在生长、生产、加工、储运过程中，由于气候、储运环境、运输条件等方面的异常，容易滋生真菌，产生有毒有害的黄曲霉毒素。我国食品安全国家标准gb2761-2017规定了黄曲霉毒素b1与黄曲霉毒素m1在不同食品类别中的限量，其中乳及乳制品中黄曲霉毒素m1的限量为0.5μg/kg，我国标准尚未涉及到总量要求，但考虑到黄曲霉毒素的极强毒副作用及其蓄积效应，建立测定食品中多种痕量黄曲霉毒素残留灵敏快速且廉价的分析方法至关重要。
3.目前已有的检测方法有薄层分析法、酶联免疫吸附法、毛细管电泳法、高效液相色谱法，液相色谱-质谱联用法等，其中，液相色谱-质谱联用方法由于低检出限，高灵敏度、高精密度，成为目前广泛应用的检测方式。然而，由于食品基质比较复杂，而且黄曲霉毒素的残留通常为痕量残留，所以对前处理技术要求较高，常见的超临界流体萃取、加速溶剂萃取、固相萃取、免疫亲和层析等前处理方法，步骤相对繁琐，可能造成目标物的损失，导致定量不准。
4.由此，检测黄曲霉毒素含量的方法有待改进。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种黄曲霉毒素分离电离元件及其制备方法和试剂盒，该分离电离元件可用于食品中黄曲霉毒素萃取，并可作为离子源元件用于敞开式质谱检测。该元件可同时实现黄曲霉毒素的萃取和直接质谱检测，萃取方法简单，质谱检测速度快，灵敏度高。
6.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备黄曲霉毒素分离电离元件的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
7.将1,3,5-三(4-氨苯基)苯溶解于四氢呋喃中，以便得到第一溶解液；将1,3,5-三甲酰基间苯三酚溶解于四氢呋喃中，以便得到第二溶解液；将所述第二溶解液加入所述第
一溶解液，再加乙酸，进行聚合反应，以便得到有机聚合物；将基底进行打磨和清洗，以便得到预处理后的基底；以及将所述预处理后的基底浸入硅酮胶溶液后取出，插入所述有机聚合物中，取出后进行干燥老化处理，以便获得所述黄曲霉毒素分离电离元件。
8.根据本发明实施例的制备黄曲霉毒素分离电离元件的方法，在基底表面制备形成有机聚合物，该聚合物具有比表面积大、选择性好的优点，能实现对黄曲霉毒素特异性萃取，吸附量大，萃取方法简单，并且该分离电离元件可以作为基底直接用于敞开式固体基底电喷雾质谱检测，无须色谱分离过程，大大提高检测速度。
9.另外，根据本发明上述实施例的制备黄曲霉毒素分离电离元件的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
10.根据本发明的实施例，所述第一溶解液中，1,3,5-三(4-氨苯基)苯(tapb)与四氢呋喃(thf)的比例为100mg：15-25ml。
11.根据本发明的实施例，所述第二溶解液中，1,3,5-三甲酰基间苯三酚(tp)与四氢呋喃的比例为60mg：6-10ml。
12.根据本发明的实施例，所述聚合反应是在55-65℃，140-160rpm/min震荡条件下进行的，时间为5-7小时。
13.根据本发明的实施例，所述基底为圆锥形木棒，且所述基底的尖端直径小于300μm。
14.根据本发明的实施例，所述干燥老化处理的温度为55-65℃，时间为3-5小时。
15.根据本发明的实施例，所述硅酮胶溶液为中性硅酮密封胶：苯按体积比1:0.8-1.2形成的混合溶液。
16.根据本发明的实施例，所述基底为圆锥形木棒，且所述基底的尖端直径小于300μm。
17.根据本发明的另一方面，本发明提供了一种黄曲霉毒素分离电离元件。根据本发明的实施例，所述黄曲霉毒素分离电离元件是利用前述的方法制备得到的。由此，本发明实施例的黄曲霉毒素分离电离元件的基底表面具有有机聚合物层，该聚合物具有比表面积大、选择性好的优点，能实现对黄曲霉毒素特异性萃取，吸附量大，萃取方法简单，并且该分离电离元件可以作为基底直接用于敞开式固体基底电喷雾质谱检测，无须色谱分离过程，大大提高检测速度。
18.根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测黄曲霉毒素含量的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对待测样品进行提取处理，以便得到提取液；利用前述的黄曲霉毒素分离电离元件对所述提取液中的黄曲霉毒素进行萃取处理，以便得到富集黄曲霉毒素的分离电离元件；以及对所述富集黄曲霉毒素的分离电离元件进行分析处理，以便得到所述待测样品中黄曲霉毒素进行定性/定量检测结果。
19.根据本发明实施例的检测黄曲霉毒素含量的方法，利用前述的黄曲霉毒素分离电离元件对待测样本中的黄曲霉毒素进行萃取处理，萃取的特异性高，吸附量大，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且，该方法操作方便，简单快速，检测的回收率、重现性、灵敏性和准确性高。
20.根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将待测样品和乙腈和氯化钠混合，以便得到样品混合液；将样品混合液涡旋震荡3-8min，在4℃条件下以8000-12000r/min的速度
离心 5-15min，以便得到上清液；以及将所述上清液进行蒸发浓缩后，加水复溶，得到所述提取液。
21.根据本发明的实施例，所述萃取处理的萃取时间为15-30min，优选地，为20min。
22.根据本发明的实施例，所述洗脱处理的洗脱剂为乙腈，洗脱时间为4-10min，优选地，为6min。
23.根据本发明的实施例，所述分析处理的方法是利用高效液相色谱-串联质谱检测进行的。
24.根据本发明的实施例，所述高效液相色谱-串联质谱的分析检测中的色谱条件为：色谱柱：xbridge c18，规格：2.1mm
×
100mm，粒径：3.5μm；进样量：5μl；柱温：30℃；流速：0.35μl/min；流动相：a：乙腈/甲醇(v：v，1:1)溶液，b：0.1％甲酸水；梯度洗脱条件为：0-1min，97％b；1-2min，(97％-90％)b；2-5min，(90％-88％)b；5-7min，(88％-1％) b；7-9min，1％b；9-11.1min，(1％-97％)b；11.1-12min，97％b。
25.根据本发明的实施例，所述高效液相色谱-串联质谱的分析检测中的质谱条件为：扫描方式：esi
+
；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：4500v；雾化气压力：35bar；辅助气压力：10bar；离子源温度：550℃；驻留时间：100ms。
26.根据本发明的实施例，所述分析处理的方法是利用敞开式固体基底电喷雾质谱检测进行的。
27.根据本发明的实施例，所述敞开式固体基底电喷雾质谱检测包括：将所述已富集待测化合物的分离电离元件固定在质谱进样口前端，通过施加高压电和喷雾溶剂，使待测物质离子化并进入质谱进行分析检测。
28.根据本发明的实施例，施加于黄曲霉毒素分离电离元件上的高压电电压为：2.5-5kv；喷雾溶剂为：含(0-1)％乙酸的甲醇溶液，利用可控微流泵以5μl/min的速度持续提供。
29.根据本发明的实施例，所述黄曲霉毒素为选自黄曲霉毒素b1(afb1)、黄曲霉毒素b2 (afb2)、黄曲霉毒素g1(afg1)、黄曲霉毒素g2(afg2)、黄曲霉毒素m1(afm1) 和黄曲霉毒素m2(afm2)中的至少一种。
30.根据本发明的实施例，所述待测样品为牛奶或奶制品。
31.根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测黄曲霉毒素的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的黄曲霉毒素分离电离元件。由此，本发明实施例的试剂盒利用前述的黄曲霉毒素分离电离元件对待测样品中的黄曲霉毒素进行萃取和富集，吸附特异性高，吸附量大，从而提高试剂盒对黄曲霉毒素检测的灵敏度和准确度，尤其适应复杂基质的黄曲霉毒素的检测。
32.根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：提取剂：乙腈和氯化钠；微孔滤膜；以及标准溶液：黄曲霉毒素混合标准溶液。
33.根据本发明的实施例，所述黄曲霉毒素为选自黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、黄曲霉毒素m1和黄曲霉毒素m2中的至少一种。
34.根据本发明的另一方面，本发明提供了前述的试剂盒用于检测牛奶或奶制品中黄曲霉毒素含量的用途。由于牛奶和奶制品作为动物源性食品可能存在黄曲霉毒素的残留，本发明实施例的试剂盒尤其适用于牛奶和奶制品的检测，检测的准确率和灵敏度高。
35.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变
得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
36.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
37.图1显示了根据本发明的一个实施例的黄曲霉毒素分离电离元件的扫描电镜图结果示意图；
38.图2显示了根据本发明一个实施例的不同洗脱条件对检测结果的影响的示意图，其中， a为萃取时间、b为洗脱溶剂类型、c为洗脱溶剂酸碱性、d为洗脱时间；
39.图3显示了根据本发明一个实施例的黄曲霉毒素分离电离元件的重复使用能力的结果示意图；
40.图4显示了根据本发明一个实施例的黄曲霉毒素分离电离元件用于敞开式质谱检测的示意图，其中，a为黄曲霉毒素分离电离元件、b为高压电源、c为可控微流泵、d为质谱仪。
具体实施方式
41.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
42.在本发明的描述中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
43.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
44.1、黄曲霉毒素分离电离元件及其制备方法
45.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备黄曲霉毒素分离电离元件的方法。根据本发明实施例的制备黄曲霉毒素分离电离元件的方法，通过在基底表面制备形成有机聚合物，实现对黄曲霉毒素高选择性萃取，特异性高，吸附量大，萃取方法简单。
46.为了便于理解制备黄曲霉毒素分离电离元件的方法，参考图4，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：
47.s100反应溶液制备
48.根据本发明的实施例，将1,3,5-三(4-氨苯基)苯(tapb)溶解于四氢呋喃(thf)中，得到第一溶解液；将1,3,5-三甲酰基间苯三酚(tp)溶解于四氢呋喃(thf)中，得到第二溶解液。
49.根据本发明的实施例，1,3,5-三(4-氨苯基)苯(tapb)与四氢呋喃(thf)的比例为 100mg：15-25ml。
50.根据本发明的实施例，所述溶解的条件为超声溶解20min。由此，tapb和thf充分溶解接触，有利于提高后续有机聚合物的得率。
51.根据本发明的实施例，1,3,5-三甲酰基间苯三酚(tp)与四氢呋喃(thf)的比例为60mg： 6-10ml，优选地，为60mg：8ml。由此，该浓度条件下形成的有机聚合物结构稳定，产率相对较高。
52.根据本发明的实施例，所述溶解处理的条件为超声溶解2min。由此，促进tp快速溶解。
53.s200聚合反应
54.根据本发明的实施例，将所述第二溶解液加入所述第一溶解液，再加乙酸，进行聚合反应，以便得到有机聚合物。
55.根据本发明的实施例，所述聚合反应是在55-65℃，140-160rpm/min震荡条件下进行的，时间为5-7小时。由此，反应的速率快，时间短，有机聚合物的得率高。
56.根据本发明的实施例，将1,3,5-三甲酰基间苯三酚的四氢呋喃溶液加入上述第一溶解溶液中，边摇晃边加入，再加乙酸，于磁力搅拌器上继续反应。由此,将1,3,5-三甲酰基间苯三酚的四氢呋喃溶液加入上述第一溶解液，有利于tp与tapb充分接触。
57.根据本发明的实施例，基于100mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯(tapb)，乙酸的加入量为0.5-1.5ml，优选地，为1ml。由此，催化效果好，反应速率快。
58.s300基底包覆
59.根据本发明的实施例，将基底浸入硅酮胶溶液后，插入所述有机聚合物中，取出后进行干燥老化处理，以便获得所述黄曲霉毒素分离电离元件。
60.根据本发明的实施例，所述基底为圆锥形木棒。由此，以木棒为原料，成本低，性能优异，尺寸合适易裁剪。木棒表面的微观结构为多孔结构，易于交联多聚物，形成的功能材料层比表面积大。
61.根据本发明的实施例，所述干燥老化处理的温度为55-65℃，时间为3-5小时。由此，有利于保证包覆在提取基底有机聚合物充分老化干燥。
62.根据本发明的实施例，所述基底的尖端直径小于300μm。由此，便于进行敞开式固体基底电喷雾质谱分析，将制备好的分离电离元件固定在质谱仪进样口的水平前端位置，通过施加喷雾溶剂，能将吸附在基底表面的黄曲霉毒素目标物洗脱下来，并通过高压电源的作用，在尖端离子化并形成泰勒锥喷雾，从而直接进入质谱检测。
63.根据本发明的实施例，所述硅酮胶溶液为中性硅酮密封胶：苯按体积比1:0.8-1.2形成的混合溶液。
64.根据本发明的实施例，将基底浸入硅酮胶溶液保持30s，缓慢拉出后立即插入含有机聚合物粉末的试管中保持60s，然后缓慢取出，放入烘箱中老化，然后甲醇超声清洗，氮气流吹干，得到有机聚合物修饰的黄曲霉毒素分离电离元件。
65.根据本发明的另一方面，本发明提供了一种黄曲霉毒素分离电离元件。根据本发明的实施例，所述黄曲霉毒素分离电离元件是利用前述的方法制备得到的。由此，该黄曲霉毒素分离电离元件对黄曲霉毒素吸附的特异性高，吸附量大。
66.2、检测黄曲霉毒素含量的方法
67.根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测黄曲霉毒素含量的方法。根据本
发明实施例的检测黄曲霉毒素含量的方法，利用前述的黄曲霉毒素分离电离元件对待测样本中的黄曲霉毒素进行萃取处理，萃取的特异性高，吸附量大，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且，该方法操作方便，简单快速，检测的回收率、重现性、灵敏性和准确性高。
68.为了便于理解检测黄曲霉毒素含量的方法，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：
69.s100提取处理
70.根据本发明的实施例，对待测样品进行提取处理，以便得到提取液。由此，通过提取处理，从样品中提取黄曲霉毒素化合物。
71.根据本发明的实施例，利用乙腈和氯化钠的混合溶液进行该提取处理。发明人对不同提取溶剂进行比较，研究发现，利用乙腈和氯化钠进行所述提取处理，黄曲霉毒素的回收率高，检测结果的精确度高。通过提取处理，可以去除样品中的杂质，比如可以去除蛋白对检测的干扰。综合考虑回收率的稳定性，根据本发明的实施例，基于1g样品，所述乙腈的添加量为1-10ml，氯化钠的添加量为0.1-2g。由此，黄曲霉毒素的回收率高，检测结果的精确度更高。
72.根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将待测样品和乙腈和氯化钠混合，以便得到样品混合液；将样品混合液涡旋震荡3-8min，在4℃条件下以8000-12000r/min的速度离心 5-15min，以便得到上清液；以及将所述上清液进行蒸发浓缩，加水复溶，得到所述提取液。由此，有利于充分提取待测样品中的黄曲霉毒素。
73.s200萃取处理
74.根据本发明的实施例，利用前述的黄曲霉毒素分离电离元件对所述提取液中的黄曲霉毒素进行萃取处理，以便得到待测液。发明人发现利用黄曲霉毒素分离电离元件进行萃取处理，与传统的固相萃取柱相比，无须固相萃取柱的装填及多次洗脱等步骤，整个萃取过程操作方便，简单快速，既能达到检测待测样品中痕量黄曲霉毒素残留的目的，同时检测的精确度、回收率、重现性都较高。
75.根据本发明的实施例，所述萃取处理的萃取时间为15-30 min，优选地，为20 min。由此，有利于充分地将目标物从提取液中吸附到分离电离元件上，提高检测结果的准确度。
76.s300分析检测
77.根据本发明的实施例，对所述富集所述待测化合物的分离电离元件进行分析处理，以便得到待测化合物进行定性/定量检测结果。该分析处理包括色谱串联质谱检测、敞开式固体基底电喷雾质谱检测。
78.(1)色谱串联质谱检测
79.根据本发明的实施例，将所述已富集待测化合物的分离电离元件进行洗脱，利用高效液相色谱-串联质谱对洗脱溶液中黄曲霉毒素含量进行分析检测。
80.根据本发明的实施例，所述洗脱处理的洗脱剂为乙腈。由此，乙腈作为洗脱剂，有利于充分地将目标物从分离电离元件上洗脱下来，提高检测结果的准确度。
81.根据本发明的实施例，所述洗脱处理的洗脱时间为4-10 min，优选地，为6 min。由此，有利于充分地将目标物从分离电离元件上洗脱下来，提高检测结果的准确度。
82.根据本发明的实施例，所述高效液相色谱-串联质谱的分析检测中的色谱条件为：色谱柱：xbridge c18，规格：2.1 mm
×
100 mm，粒径：3.5μm；进样量：5μl；柱温：30℃；流速：
0.35μl/min；流动相：a：乙腈/甲醇(v：v，1:1)溶液，b：0.1％甲酸水。
83.进一步地，根据本发明的实施例，该hplc-ms/ms分析检测的梯度洗脱程序为：0-1 min， 97％b；1-2 min，(97％-90％)b；2-5min，(90％-88％)b；5-7min，(88％-1％)b；7-9 min， 1％b；9-11.1 min，(1％-97％)b；11.1-12 min，97％b。由此，在该梯度洗脱条件下，可实现目标化合物在9 min内出峰，提高了检测的速度，并且色谱峰的峰型好，检测的精确度、回收率和重现性好。
84.根据本发明的实施例，所述高效液相色谱-串联质谱的分析检测中的质谱条件为：扫描方式：esi+；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：4500 v；雾化气压力：35 bar；辅助气压力：10 bar；离子源温度：550℃；驻留时间：100 ms。
85.根据本发明的实施例，该质谱的其他质谱参数如下表：
86.表1
[0087][0088]
*为定量离子
[0089]
进一步地，本发明实施例的分析检测还包括分析化学中常规的检测步骤，例如绘制标准曲线等，本领域技术人员可以根据具体情况进行操作，在此不再一一赘述。例如黄曲霉毒素标准曲线的制备方法如下：准确吸取黄曲霉毒素标准品，用乙腈配制成0.1mg/ml的标准储备液，之后准确称取适量黄曲霉毒素标准储备液，用乙腈稀释成10μg/ml的标准中间液；准确称取适量标准中间液。用初始流动相稀释成0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100， 200ng/ml系列浓度。用前述的hplc-ms/ms系统进行分析检测，得到黄曲霉毒素的定量标准曲线。
[0090]
(2)敞开式固体基底电喷雾质谱检测
[0091]
根据本发明的实施例，所述敞开式固体基底电喷雾质谱检测包括：将所述已富集待测化合物的分离电离元件固定在质谱进样口前端，通过施加高压电和喷雾溶剂，使待测物质离子化并进入质谱进行分析检测。
[0092]
根据本发明的一些具体实施例，将吸附完成的黄曲霉毒素分离电离元件安装在三维移动平台上，木尖指向质谱仪(ms)进样口，调整到距ms进气口5mm的位置。具体地，可以利用可控微流泵以5μl/min的速度持续提供含(0-1)％乙酸的甲醇溶液作为洗脱溶剂，移动高压电源通过铜夹于木尖施加2.5-5kv的高压，目标物在木尖产生喷雾电离，用于质谱分析。根据本发明的一些具体实施例，质谱仪在正离子模式及mrm模式下进行目标分析。
[0093]
根据本发明的实施例，所述黄曲霉毒素为选自afb1、afb2、afg1、afg2、afm1和 afm2中的至少一种。
[0094]
根据本发明的实施例，所述待测样品为牛奶或奶制品。牛奶或奶制品作为动物源性食品可能存在黄曲霉毒素的残留，本发明实施例的检测黄曲霉毒素的方法尤其适用于牛
奶或奶制品的检测。
[0095]
3、试剂盒
[0096]
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测黄曲霉毒素的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的黄曲霉毒素分离电离元件。由此，本发明实施例的试剂盒利用前述的黄曲霉毒素分离电离元件对待测样品中的黄曲霉毒素进行特异吸附，吸附特异性高，吸附量大，从而提高试剂盒对黄曲霉毒素检测的灵敏度和准确度，尤其适应复杂基质的黄曲霉毒素的检测。
[0097]
根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：提取剂：乙腈和氯化钠；微孔滤膜；以及标准溶液：黄曲霉毒素混合标准溶液。
[0098]
根据本发明的实施例，所述黄曲霉毒素为选自黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、黄曲霉毒素m1和黄曲霉毒素m2中的至少一种。
[0099]
根据本发明的另一方面，本发明提供了前述的试剂盒用于检测牛奶或奶制品中黄曲霉毒素含量的用途。由于牛奶和奶制品作为动物源性食品可能存在黄曲霉毒素的残留，本发明实施例的试剂盒尤其适用于牛奶和奶制品的检测，检测的准确率和灵敏度高。
[0100]
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0101]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自sigma公司。
[0102]
实施例1
[0103]
本实施例以牛奶样品中痕量黄曲霉毒素为例，利用本发明实施例的黄曲霉毒素分离电离元件进行检测，具体如下：
[0104]
1、实验方法
[0105]
(1)有机聚合物材料的制备：
[0106]
称取1,3,5-三(4-氨苯基)苯(tapb)100mg于圆底烧瓶中，接着加入20ml的四氢呋喃(thf)，超声溶解20min，然后放到磁力搅拌器并将磁转子投入其中。接着，称取1,3,5
‑ꢀ
三甲酰基间苯三酚(tp)60mg溶于8ml四氢呋喃中，超声2min溶解。然后，将tp的四氢呋喃溶液加入上述反应体系中，边摇晃边加入，再加1ml乙酸，于磁力搅拌器上继续反应6h(60℃，150rpm/min)。反应结束后，将所获材料用乙醇和乙腈交替清洗3次，放入烘箱烘干备用。
[0107]
(2)黄曲霉毒素分离电离元件的制备：
[0108]
选取5cm长的木签作为基底，表面打磨光滑均匀，再用超纯水超声清洗后于60℃下烘干备用。采用粘合法制备，具体步骤如下：(a)称量少许烘干的有机聚合物粉末进行研磨，转移至2.5ml试管中；(b)将基底垂直浸入硅酮胶溶液(中性硅酮密封胶：苯，1:1)中保持30s，再从浆液中缓慢拉出，立即插入含cop粉末的试管中保持60s，然后缓慢取出后，再放入60℃烘箱中老化4h；(c)老化后木签涂层用甲醇超声清洗10min，氮气流吹干；(d) 用刀片小心刮去多余涂层，保留涂层的长度为2.5cm，最终得到有机聚合物修饰的黄曲霉毒素分离电离元件，备后续实验使用。
[0109]
(3)样品牛奶样品前处理：
[0110]
取市售牛奶10.00ml放入50ml离心管中，加入10ml乙腈和2.00g氯化钠后，涡旋震荡5min，在4℃条件下以10000r/min的速度离心10min，移取10ml上清液至另一个离心管中，进行蒸发浓缩，加超纯水复溶至5ml，得到样品溶液供后续实验使用。
[0111]
(4)萃取过程
[0112]
将2.00ml样品溶液置于4ml带密封垫的样品瓶中，插入制备的黄曲霉毒素分离电离元件，涂层需全部侵入样品溶液中，置于摇床上，150rpm萃取20min。然后将黄曲霉毒素分离电离元件立即放入加有2ml乙腈洗脱液的小瓶中，超声洗脱6min，收集洗脱液，洗脱液过0.22μm微孔滤膜过滤后待hplc-ms/ms分析。
[0113]
(5)上机测定
[0114]
色谱柱：xbridge c18，规格：2.1mm
×
100mm，粒径：3.5μm；进样量：5μl；柱温： 30℃；流速：0.35μl/min；流动相：a：乙腈/甲醇(v：v，1:1)溶液，b：0.1％甲酸水。梯度洗脱程序为：0-1min，97％b；1-2min，(97％-90％)b；2-5min，(90％-88％)b；5
‑ꢀ
7min，(88％-1％)b；7-9min，1％b；9-11.1min，(1％-97％)b；11.1-12min，97％ b。
[0115]
质谱条件:
[0116]
扫描方式：esi
+
；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：4500v；雾化气压力：35bar；辅助气压力：10bar；离子源温度：550℃；驻留时间：100ms；其他质谱参数如表1。
[0117]
(6)标准溶液的配制与标准曲线、检测限与定量限的测定
[0118]
准确吸取黄曲霉毒素标准品，用乙腈配制成0.1mg/ml的标准储备液，之后准确称取适量黄曲霉毒素标准储备液，用乙腈稀释成10μg/ml的标准中间液；准确称取适量标准中间液。用初始流动相稀释成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100和200ng/ml系列浓度，利用高效液相色谱-串联三重四级杆质谱对各标准曲线溶液进行检测，工作站软件进行分析，绘制标准曲线。
[0119]
2、实验结果：
[0120]
(1)sem表征
[0121]
使用hitachi s-4800扫描电镜仪对分离电离元件进行表征，观察表面形态，加速电压为 10kv，放大倍数为30倍和2000倍。电镜结果如图1，可以清晰地观察到有机聚合物材料在分离电离元件表面结合紧密且分布均匀，在更大的放大倍数下，能观察到分离电离元件表面的有机聚合物材料呈高度交联的骨架结构，为分离电离元件强吸附性提供作用位点。
[0122]
(2)萃取时间
[0123]
考察了5、10、15、20、25、30min萃取时间对吸附量的影响，每个时间下进行3次平行试验。结果如图2a所示，当萃取时间小于20min时，6afs的峰面积随着萃取时间的增加而增加，但当萃取时间大于20min时，6afs的峰面积随着萃取时间的增加几乎不变，这可能是由于当萃取时间小于20min时，分离电离元件吸附未达到饱和，而当萃取时间超过 20min时，分离电离元件的吸附位点趋于饱和。因此，选择20min作为优选萃取时间。
[0124]
(3)洗脱溶剂类型
[0125]
洗脱溶剂的类型直接关系黄曲霉毒素在分离电离元件中解吸程度，良好的洗脱溶剂可以最大限度地将目标物从分离电离元件上洗脱下来。考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、丙酮五种不同的洗脱溶剂。结果如图2b所示，使用乙腈作为洗脱溶剂时，目标物峰面积
最大，洗脱量最高。因此，选用乙腈作为洗脱溶剂，能更有效的洗脱掉目标物，
[0126]
(4)洗脱溶剂酸碱性
[0127]
通过加不同量的甲酸和氨水对洗脱溶剂的酸碱性进行调节，考察洗脱溶剂的酸碱性对洗脱性能的影响。如图2c所示，甲酸和氨水的加入一定程度的降低了洗脱效果，选择不对洗脱溶剂的酸碱性进行调节。
[0128]
(5)洗脱时间
[0129]
洗脱时间的长短决定了是否能把吸附在分离电离元件上的6种afs完全洗脱掉，直接影响洗脱量。考察了不同洗脱时间(2,4,6,8,10min)对洗脱量的影响，结果如图2d所示，当洗脱时间较少(0-6min)时，洗脱效果较差，当洗脱时间大于等于6min时，洗脱量较高且趋于平稳，表明黄曲霉毒素已基本从分离电离元件上洗脱下来。因此，选择6min作为优选洗脱时间
[0130]
(6)重复使用次数
[0131]
为评价分离电离元件的可重复使用性，对添加量为10ng/ml的加标牛奶样品进行了5 次循环吸附实验，以回收率为指标。结果如图3所示，随着使用次数的增加，回收率虽有一定降低，但5次循环吸附实验的回收率均大于75％。5次循环后，信号比约为首次使用时的 83.67％。在这种情况下，分离电离元件表现出良好的再生性能，可以多次回收。
[0132]
(7)标准曲线的制备以及检测限与定量限的测定
[0133]
按照上述所述方式制备黄曲霉毒素标准品溶液，进液相色谱-串联质谱仪按照上述的检测色谱质谱条件检测黄曲霉毒素的检出限(s/n＝3)和定量限(s/n＝10)。在最佳条件下，对建立的6种黄曲霉毒素分析方法进行评估，如表2所示，6种黄曲霉毒素在0.05-100ng/g 的范围内呈良好线性关系，相关系数均大于0.9995。该方法的lods和loqs分别为0.01～0.04 ng/g和0.03～0.13ng/g。
[0134]
表2牛奶中6种afs残留的线性度、lod、loq、重复性和重现性分析
[0135][0136]
(8)检测方法的精密度
[0137]
精密度是指在同样的实验条件下，多次重复试验检测值之间符合的程度，使用相对标准偏差(rsd％)作为指标，rsd值越小，表明试验的精密度越好。黄曲霉毒素分离电离元件对50ng/ml的目标物溶液进行处理后，洗脱进行hplc-ms/ms检测，连续测定3天，计算得到日内精密度和日间精密度，结果如表2，日内和日间精密度(rsd)分别为4.39～8.21％和5.79～9.12％，本发明实施例的检测方法展现出良好的精密度。
[0138]
(9)实际样品的测定
的高压，目标物在木尖产生喷雾电离，用于质谱分析，示意图见图4。其中质谱仪为absciexqtrap5500离子阱质谱仪，在正离子模式及mrm模式下进行目标分析，通过质谱信号的采集得到。
[0151]
(4)标准曲线与含量的测定
[0152]
将浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50和100ng/ml系列浓度的黄曲霉毒素标准溶液，利用敞开式固体基底电喷雾质谱对各标准曲线溶液进行检测，利用工作站软件进行分析，以喷雾曲线的面积为纵坐标绘制标准曲线，并基于标准曲线进行含量的计算。
[0153]
综上所述，本发明实施例的检测黄曲霉毒素含量的方法，利用前述的黄曲霉毒素分离电离元件对待测样本中的黄曲霉毒素进行萃取处理，萃取的特异性高，吸附量大，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且，该方法操作方便，简单快速，检测的回收率、重现性、灵敏性和准确性高。
[0154]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0155]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。