一种利那洛肽及其有关物质的检测分析方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种利那洛肽及其有关物质的检测分析方法。


背景技术：

2.利那洛肽是由美国ironwood公司研发的一种鸟苷酸环化酶c(gc-c)受体激动剂，其商品名为linzess，于2012年8月30日获美国fda批准上市，英文名为linaclotide。该药用于治疗成人便秘型肠易激综合征(ibs-c)和慢性特发性便秘(cic)，它是首个具有此种作用机制的治疗便秘的药物。
3.利那洛肽的结构为含14个氨基酸的多肽，其序列为l-cysteinyl-l-cysteinyl-l-glutamyl-l-tyrosyl-l-cysteinyl-lcysteinyl-l-asparaginyl-l-prolyl-l-alanyl-l-cysteinyll-threonyl-l-glycyl-l-cysteinyl-l-tyrosine，cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)；利那洛肽为白色至类白色无定形粉末，微溶于水和氯化钠水溶液(0.9％)。该药物通过与肠道上皮局部的gc-c受体结合发挥作用，活化后的gc-c受体诱导体内cgmp浓度增加，一方面可以刺激肠液的分泌并促进胃肠活动，导致患者排便次数增多；另一方面可以减少痛觉神经活性，进而减少患者肠道疼痛。
4.然而化学合成的利那洛肽在合成工艺中，难免引入一系列的杂质，如异构体杂质、缺损肽杂质等，这些杂质统称为有关物质，其存在将严重影响利那洛肽的产品质量。由于这些有关物质杂质毒性数据不明确，对于患者用药必然存在一定的潜在风险。因此，为了保证利那洛肽产品质量，提高患者用药安全性，对利那洛肽有关物质进行严格的质量控制具有非常重要的现实意义。且到目前为止，未见到文献报道对利那洛肽有关物质进行测定的方法。
5.高效液相色谱法(hplc)是上个世纪七十年代迅速发展起来的一项高效、快速的分析分离技术，是现代分离测试的重要手段，是目前应用最多的色谱分析方法。高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成。
6.高效液相色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。
7.然而，使用高效液相色谱法探索利那洛肽及其有关物质的检测还未见报道。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明提供一种利那洛肽及其有关物质的检测方法，该检测分析方法是一种用于检测利那洛肽原料药中杂质(杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e)的方法，通过改良传统液相系统中的流动相配方，调整了流动相梯度，提高了方法的检测灵敏度和准确度。
9.其中，杂质a为h-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asn-pro-ala-cys-thr-gly-cys-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)。
10.杂质b为h-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asp-pro-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)。
11.杂质c为ac-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asn-pro-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)。
12.杂质d为h-cys-cys-glu-tyr-d-cys-cys-asn-pro-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)。
13.杂质e为h-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asn-pro-ala-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-11)，(5-14)-三(二硫化物)。
14.本发明是通过以下技术方案实现的：
15.本发明的目的是提供一种利那洛肽及其有关物质的检测分析方法，包括以下步骤：
16.(1)定位溶液的配制：将利那洛肽与杂质分别用稀释液进行稀释，制备定位溶液；
17.(2)样品溶液的制备：将待测样品用稀释液进行稀释，配制得到待测溶液；
18.(3)高效液相色谱分析：对步骤(1)所得定位溶液、步骤(2)所得利那洛肽溶液与杂质溶液进行高效液相色谱检测，进而进行定量和/或定性分析；
19.其中所述高效液相色谱包括以下条件：
20.流动相a为高氯酸钠与磷酸二氢钾的混合溶液，所述高氯酸钠与磷酸二氢钾的摩尔比为0.5-1.5:1；
21.流动相b为甲醇；
22.流动相梯度洗脱程序为：0min，5％b；0min-10min，5％-10％b；10min-43min，10％-38％b；43min-55min，38％-80％b；55min-56min，80％-5％b；56min-65min，5％b；
23.色谱柱为phenomenex kinetexps c18柱，所述色谱柱的粒径为2.6μm，规格为150mm
×
4.6mm；柱温30℃-40℃，波长220nm，流速0.5ml/min-0.8ml/min。
24.在本发明的一个实施方案中，步骤(1)和步为骤(2)中所述稀释液为乙腈与盐酸溶液的混合液。
25.在本发明的一个实施方案中，所述乙腈与盐酸溶液的体积比为1-3：3-5。
26.在本发明的一个实施方案中，所述乙腈与盐酸溶液的体积比1-2：3-4。
27.在本发明的一个实施方案中，所述乙腈与盐酸溶液的体积比3：7。
28.在本发明的一个实施方案中，所述盐酸溶液的浓度为0.05mol/l-0.2mol/l。
29.在本发明的一个实施方案中，步骤(1)中，所述杂质为杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e；
30.其中，杂质a为h-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asn-pro-ala-cys-thr-gly-cys-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)；
31.杂质b为h-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asp-pro-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)；
32.杂质c为ac-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asn-pro-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)；
33.杂质d为h-cys-cys-glu-tyr-d-cys-cys-asn-pro-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13)-三(二硫化物)；
34.杂质e为h-cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asn-pro-ala-ala-cys-thr-gly-cys-tyr-oh cyclic(1-6)，(2-11)，(5-14)-三(二硫化物)。
35.在本发明的一个实施方案中，步骤(2)中，所述待测溶液中利那洛肽的浓度为0.1mg/ml-0.3mg/ml。
36.在本发明的一个实施方案中，步骤(2)中，所述待测溶液中杂质的浓度为0.1μg/ml-0.3μg/ml。
37.在本发明的一个实施方案中，所述流动相a的ph值为4.0-5.5。
38.在本发明的一个实施方案中，所述流动相a的ph值为4.5-5.5。
39.在本发明的一个实施方案中，所述流动相a的ph值为5.0。
40.在本发明的一个实施方案中，所述检测分析方法包括以下步骤：
41.(1)供试品溶液的制备：取利那洛肽用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液稀释配制成每1ml中含0.2mg的溶液，即为供试品溶液；
42.(2)量取供试品溶液50μl，进行液相色谱仪分析，记录色谱图，按面积归一化法计算供试品有关物质。
43.色谱条件：
44.色谱柱：phenomenex kinetexps c18柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm)，以0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l乙酸钠溶液(ph5.0)为流动相a，甲醇为流动相b，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进行梯度洗脱。
45.有关物质检测方法高效液相色谱方法色谱条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相a为0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(ph4.0-6.0)；流动相b甲醇；流速0.5ml/min-0.8ml/min；柱温30℃-40℃，波长220nm，进行梯度洗脱。
46.本发明使用了一种新的特殊的固定相填料色谱柱，色谱柱填料包含核-壳型填料，且填料表面带正电荷。使用传统烃基c18固定相分析碱性物质时，由于硅胶表面存在次级相互作用，常常会出现拖尾峰。kinetex ps c18表面带有正电荷，可以有效排斥强碱，使得峰形更佳，且重现性更强。该类型色谱柱具有更高的选择性与灵敏度，在特定的色谱条件下，可以更准确有效地测定利那洛肽中有关物质的含量。
47.本发明的技术方案具有以下优点：
48.(1)本发明公开了一种利那洛肽及其有关物质的检测分析方法，通过改良传统液相系统中的流动相配方，调整了流动相梯度，提高了方法的检测灵敏度和准确度。
49.(2)本发明利那洛肽及其有关物质的检测分析方法简便快速，既可以有效分离利那洛肽各已知杂质，又可以准确检测出各杂质的含量，也为制定利那洛肽原料药质量标准提供依据。
附图说明
50.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
51.图1为本发明实施例2中稀释液的检测色谱图；
52.图2为本发明实施例3中系统适用性色谱图-流动相a(ph4.0)；
53.图3为本发明实施例3中系统适用性色谱图的局部放大图-流动相a(ph4.0)；
54.图4为本发明实施例4中系统适用性色谱图-流动相a(ph4.5)；
55.图5为本发明实施例4中系统适用性色谱图的局部放大图-流动相a(ph4.5)；
56.图6为本发明实施例5中系统适用性色谱图-流动相a(ph5.0)；
57.图7为本发明实施例5中系统适用性色谱图的局部放大图-流动相a(ph5.0)；
58.图8为本发明实施例6中系统适用性色谱图-流动相a(ph5.5)；
59.图9为本发明实施例6中系统适用性色谱图的局部放大图-流动相a(ph5.5)；
60.图10为本发明实施例7中系统适用性色谱图；
61.图11为本发明实施例7中系统适用性色谱图的局部放大图；
62.图12为本发明实施例7中利那洛肽定位图；
63.图13为本发明实施例7中利那洛肽定位图的局部放大图；
64.图14为本发明实施例7中杂质a定位图；
65.图15为本发明实施例7中杂质a定位图的局部放大图；
66.图16为本发明实施例7中杂质b定位图；
67.图17为本发明实施例7中杂质b定位图的局部放大图；
68.图18为本发明实施例7中杂质c定位图；
69.图19为本发明实施例7中杂质c定位图的局部放大图；
70.图20为本发明实施例7中杂质d定位图；
71.图21为本发明实施例7中杂质d定位图的局部放大图；
72.图22为本发明实施例7中杂质e定位图；
73.图23为本发明实施例7中杂质e定位图的局部放大图；
74.图24为本发明对比例1中不同流动相的色谱图；
75.图25为本发明对比例1中不同流动相的色谱图的局部放大图；
76.图26为本发明对比例2中使用welchultimate c18色谱柱检测的色谱图；
77.图27为本发明对比例2中使用welch ultimate c18色谱柱检测的色谱图的局部放大图。
具体实施方式
78.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
79.实施例1
80.由于不同杂质存在极性上的差别，不同极性的溶剂所能溶解的杂质不同，因此为确保样品中杂质完全溶解，本发明对稀释液的种类进行研究。
81.取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e分别用0.1mol/l盐酸溶液稀释，配制成浓度均为0.2mg/ml的利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e溶液。通过实验发现，利那洛肽、杂质a、杂质b和杂质c均能完全溶解，而杂质d与杂质e不能完全溶解。由此可以得出，0.1mol/l盐酸溶液并不适合用于溶解本发明中的杂质。
82.实施例2
83.用乙腈和0.1mol/l的盐酸溶液按体积比为3∶7混合得到的溶液为稀释液，对该稀释液进行色谱检测，仪器及色谱检测条件如下：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，phenomenex kinetex ps c18柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm))，以0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l乙酸钠溶液为流动相a，甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进样体积50μl；具体的梯度洗脱为：0min，5％b；0-10min，5％-10％b；10-43min，10％-38％b；43-55min，38％-80％b；55-56min，80％-5％b；56-65min，5％b。
84.该稀释液的检测色谱图如图1所示。由图1结果显示，利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e溶液均能完全溶解于该稀释液中。由此可以得出，以乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液可以作为检测稀释液。
85.实施例3
86.实验仪器及色谱条件：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，phenomenex kinetex ps c18柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm))，以0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l乙酸钠溶液为流动相a，用醋酸调节流动相a的ph为4.0，甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进样体积50μl；具体的梯度洗脱程序见表1。
87.表1梯度洗脱程序
[0088][0089]
样品配制：取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0090]
利用高效液相色谱仪对系统适用性溶液进行检测，所得ph为4.0的流动相a的检测色谱图如图2和图3所示，其中图3为图2的色谱图的局部放大图。
[0091]
实施例4
[0092]
实验仪器及色谱条件：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，phenomenex kinetex ps c18柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm))，以0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l乙酸钠溶液为流动相a，用醋酸调节流动相a的ph为4.5，甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进样体积50μl；具体的梯度洗脱程序见表1。
[0093]
样品配制：取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0094]
利用高效液相色谱仪对系统适用性溶液进行检测，所得ph为4.5的流动相a的检测
色谱图如图4和图5所示，其中图5为图4的色谱图的局部放大图。
[0095]
实施例5
[0096]
实验仪器及色谱条件：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，phenomenex kinetex ps c18柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm))，以0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l乙酸钠溶液为流动相a，用醋酸调节流动相a的ph为5.0，甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进样体积50μl；具体的梯度洗脱程序见表1。
[0097]
样品配制：取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0098]
利用高效液相色谱仪对系统适用性溶液进行检测，所得ph为5.0的流动相a的检测色谱图如图6和图7所示，其中图7为图6的色谱图的局部放大图。
[0099]
实施例6
[0100]
实验仪器及色谱条件：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，phenomenex kinetex ps c18柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm))，以0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l乙酸钠溶液为流动相a，用醋酸调节流动相a的ph为5.5，甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进样体积50μl；具体的梯度洗脱程序见表1。
[0101]
样品配制：取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0102]
利用高效液相色谱仪对系统适用性溶液进行检测，所得ph为5.5的流动相a检测的色谱图如图8和图9所示，其中图9为图8的色谱图的局部放大图。
[0103]
根据实施例3-6中不同ph(ph4.0、ph4.5、ph5.0和ph5.5)的流动相a的色谱图(具体如图2-图9所示)，所得检测的具体数据见表2。
[0104]
表2不同ph下的流动相a中各杂质的分离情况
[0105][0106]
由表2可以看出，当流动相a的ph较低时(ph4.0和ph4.5)，主峰与杂质d均不能进行有效分离；当流动相a的ph值为5.0和5.5时，各已知杂质与主峰均能进行有效分离，但由主峰拖尾因子可以看出，ph值为5.0时主峰对称性更好。对比发现，流动相a的为ph值为5.0时杂质分离情况更优，因此，确定流动相a的最优ph值为5.0。
[0107]
实施例7：杂质定位研究
[0108]
试验目的：确定利那洛肽和各已知杂质的保留时间。
[0109]
实验仪器及色谱条件：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，phenomenex kinetex ps c18柱(150mm*4.6mm，2.6μm))，以0.05mol/l高氯酸钠和0.05mol/l乙酸钠溶液(ph5.0)为流动相a，甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进样体积50μl。梯度洗脱程序见表1。
[0110]
样品配制：取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0111]
取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e分别用稀释液(乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液)进行稀释，分别配制成每1ml含利那洛肽和各有关物质为0.2mg的溶液，为各定位溶液。
[0112]
取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0113]
分别取系统适用性溶液和各定位溶液按上述色谱条件进行检测。杂质定位研究结果见表3，定位图如图10-图23所示。
[0114]
表3杂质定位研究结果
[0115][0116][0117]
由图10-图23及表3可以看出，本发明利那洛肽及其有关物质的检测分析方法通过改良稀释液和传统液相系统中的流动相配方，可以完全分离利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，并能准确检出各已知杂质，提高了方法的检测灵敏度和准确度，为利那洛肽质量控制提供一个有效的方法。
[0118]
对比例1(更换流动相)
[0119]
实验仪器及色谱条件：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，phenomenex kinetex ps c18柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm))，以水-乙腈-三氟乙酸(98:2:0.1)为流动相a，乙腈-水-三氟乙酸(95:5:0.1)为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，
进样体积50μl；具体的梯度洗脱程序如表1所示。
[0120]
样品配制：取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0121]
利用高效液相色谱仪对系统适用性溶液进行检测，检测色谱图如图24和图25所示，其中图25为图24的色谱图的局部放大图。
[0122]
对比例2(更换色谱柱)
[0123]
实验仪器及色谱条件：agilent 1260infinityⅱ型高效液相色谱仪，welch ultimate c18柱(150
×
4.6mm，2.6μm)，以水-乙腈-三氟乙酸(98:2:0.1)为流动相a，乙腈-水-三氟乙酸(95:5:0.1)为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长220nm；流速0.6ml/min，进样体积50μl；具体的梯度洗脱程如表1所示。
[0124]
样品配制：取利那洛肽、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用乙腈和0.1mol/l盐酸溶液按体积比为3∶7的混合液为稀释液进行稀释，配制成每1ml含利那洛肽0.2mg，含各杂质为0.2μg的溶液，为系统适用性溶液。
[0125]
利用高效液相色谱仪对系统适用性溶液进行检测，检测色谱图如图26和图27所示，其中图27为图26的色谱图的局部放大图。由图26和图27可以看出，以普通c18柱welchultimate c18为色谱柱(150mm
×
4.6mm，2.6μm)，其他条件同实施例2时，杂质c和d均不能进行有效分离。
[0126]
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。